病毒性心肌炎小鼠LPO与NK细胞活性观察
作者：高大胜 张宁汝 冯慧勤 袁灿兴 陈汝兴
单位：高大胜 张宁汝 冯慧勤 蚌埠医学院附属医院心血管科 233004；袁灿兴 陈汝兴 上海龙华医院
关键词：心肌炎；柯萨奇病毒B；杀伤细胞，天然；过氧化脂质；小鼠
蚌埠医学院学报990503摘要 目的：探讨自然杀伤(NK)细胞活性及过氧化脂质(LPO)在病毒性心肌炎发病中的作用及其相关性。方法：采用125IduR释放法及MDA-TBA比色法，分别测定23只柯萨奇(Coxsackie)B3病毒接种BALB/c小鼠(模型组)和10只健康小鼠(对照组)脾脏的NK细胞活性及心脏组织中的LPO含量。结果：模型组小鼠的NK细胞活性明显低于对照组(P<0.001)，而LPO明显高于对照组(P<0.005)。两者呈显著负相关(P<0.01)。结论：心肌炎小鼠存在免疫功能紊乱及LPO异常，氧自由基损伤是导致NK细胞活性下降的可能原因之一。
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中国图书资料分类法分类号 R 542.21 R 392.12
Natural killer cell activity and lipid peroxide in Coxsackie virus B3-induced murine myocarditis
Gao Dasheng,Zhang Ningru,Feng Huiqin,Yuan Canxing,Chen Ruxing
(Department of Cardiology,Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Anhui 233004)
Abstract Objective:To explore the correlation between natural killer(NK) cell activity and lipid peroxide(LPO) level in 24 weeks BALB/c mice infected with coxsackie B3 virus.Methods:NK cell activity and LPO level were measured by 125IUDR and MDA-TBA colorimetry in 23 experimentally infected mice and 10 normal mice.Results:NK cell activity was significantly lower(P<0.001) and LPO level was significantly higher(P<0.005) in infected mice than in normal mice. NK cell activity and LPO level were negatively correlated(P<0.01).Conclusions:Myocarditis leads to disorder in immune function in mice. LPO level is negatively correlated with NK cell activity.The decrease in NK cell activity may be due to the increase in production of oxidative free radical(OFR).
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Key words myocarditis;Coxsackie B viruses;killer cells,natural;lipid peroxides;mice
病毒性心肌炎的发病机制迄今尚未阐明，业已证实病毒本身及免疫损伤是其发病的主要机制之一〔1，2〕。有关氧自由基(OFR)在病毒性心肌炎发病中的影响报道不多，本研究观察过氧化脂质(LPO)及自然杀伤(NK)细胞活性在柯萨奇B3病毒(CVB3)心肌炎小鼠中的变化，并对两者的相关性进行分析，旨在加深对心肌炎发病机制的认识。
1 材料与方法
1.1 实验动物 4周龄BALB/c小鼠50只，雌雄各半，由中国科学院上海实验动物中心提供。随机分成两组，正常对照组10只，模型组40只。
1.2 病毒与接种 柯萨奇B3病毒(Coxsackie virus B3,CVB3)(嗜心肌病毒，Nancy株)由上海市心血管病学研究所提供。在Hep-2细胞中测定其50%细胞感染率/毫升(TICD50/ml)为1011，接种前按1∶50稀释。模型组每只小鼠腹腔接种内含CVB3的MEM-Eagle液0.2 ml，对照组小鼠接种0.2 ml不含病毒的Eagle上清液。1.3 心脏组织中LPO含量的测定 小鼠处死后取心脏制成10%的组织匀浆，采用MDA-TBA比色法测定LPO的含量。先绘制标准曲线，然后吸取10%的组织匀浆0.2 ml，依次加入8.1%的十二烷基硫酸钠0.2 ml、20%醋酸缓冲液(pH=3.5)1.5 ml、0.8%的硫代巴比妥酸(TBA)1.5 ml、蒸馏水0.6 ml，摇匀；于95℃油浴中保温1 h,冷却；加蒸馏水1.0 ml、正丁醇吡啶混和液5.0 ml，振摇后离心(3 000 r/min)15 min，取上层液在532 nm波长下比色。组织LPO含量的计算：每克湿组织的LPO量(μmol)=查得的标准曲线值×(1/0.2)×(10/1 000)。
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1.4 NK细胞活性的测定 检测方法采用李仪奎等所述的125IudR释放法。接种后第8天，将小鼠处死取脾，用Ficoll液分别分离各鼠脾脏的淋巴细胞作为效应细胞，用YAC-1细胞(中科院上海细胞所提供)为靶细胞，用5 μci 125IudR标记靶细胞，效靶细胞比为100∶1。每份标本做2次，实验时用靶细胞对照测自然释放率，则NK细胞活性=上0.5 ml上清液cpm×〔2/(上0.5 ml上清液cpm+下0.5 ml上清液cpm)〕×100-自然释放率。
1.5 统计学方法 采用t检验及直线相关分析。
2 结果
模型组小鼠的NK细胞活性明显低于对照组(P<0.001)；而LPO水平则模型组显著高于对照组(P<0.005)(见表1)。心肌炎小鼠的NK细胞活性与LPO呈显著负相关(r=-0.756,P<0.01)。
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表1 两组小鼠NK细胞活性和LPO含量的比较(
±s) 组别
n
NK细胞活性(%)
LPO(μmol/g)
对照组
10
12.750±2.100
1.517±0.297
模型组
23
7.670±2.010
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2.525±0.316
t
—
6.59
3.25
P
—
<0.001
<0.005
3 讨论
近年来，细胞免疫在病毒性心肌炎发病中的作用已受到众多学者的普遍关注。Godeny在实验中发现NK细胞能直接抑制病毒的复制〔1〕，另有学者报道小鼠体内的NK细胞消失，抵抗力显著下降，则病毒显著增殖，提示机体为防御病毒感染，NK细胞是不可缺少的〔3〕。笔者观察到小鼠感染CVB3 8 d后，NK细胞活性比对照组显著下降(P<0.001)，这与文献报道雷同，也充分表明NK细胞活性在病毒性心肌炎的发病中具有重要作用。
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LPO是OFR与细胞膜上多价不饱和脂肪酸侧链结合的产物，故LPO水平可以间接反映组织中OFR的含量。本研究发现，模型组小鼠心肌组织中的LPO明显高于对照组(P<0.005)，揭示OFR在病毒性心肌炎的发病机制中占有重要地位。OFR对心肌损害的可能机制为：(1)OFR与心肌细胞膜结合生成LPO，其又反过来作用于细胞膜，进而扩大膜的损伤，则细胞膜对离子的通透性发生改变，膜静息电位、心肌的兴奋性和传导性发生异常，从而导致心律失常；细胞外大量的钙离子进入细胞内造成钙超载，加重细胞损害〔4〕。(2)OFR还可与细胞内线粒体膜、溶酶体膜结合使氧化磷酸化受到抑制，能量代谢障碍；并释放出各种水解蛋白酶引起细胞的自溶，更加重心肌细胞的损伤。
为进一步探讨NK细胞活性与LPO的关系，本文对两者进行相关分析，发现两者呈显著负相关(P<0.01)，这与费瑜等报道OFR可损伤高血压患者淋巴细胞功能的结果类似〔5〕，其可能机制为OFR还可损伤淋巴细胞的细胞膜或直接抑制其功能，从而降低淋巴细胞对刺激原的应答，抑制淋巴细胞增殖和分化，影响淋巴细胞的免疫功能〔6〕。
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本文结果显示，CVB3病毒性心肌炎小鼠体内存在免疫功能紊乱，NK细胞活性与LPO呈显著负相关，OFR是造成NK细胞活性下降的可能原因之一。因此，为病毒性心肌炎防治奠定新的理论基础，在本病的防治中应用调节细胞免疫功能及氧自由基清除剂是可取的。
参考文献
1 Godeny EK,Gauntt CJ.Interferon and natural killer cell activity in Coxsackie virus B3——induced murine myocarditis.Eur Heart J,1987,8(Suppl)∶389
2 杨英珍，郭 棋，金佩英，等.急性病毒性心肌炎发病机理的探讨.中华微生物和免疫学杂志，1987，7(2)∶92
3 坦生圜子.NK(自然杀伤)细胞的抗病毒作用.国外医学微生物学分册，1984，7(2)∶66
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4 Kutryk MJB,Maddaford TG,Ramjiawan B.Oxidation of membrane cholesterol alters active and passive transsarcolemmal calcium movement.Circ Res,1991,68(1)∶18
5 费 瑜，刘万车，陈丽娟，等.高血压患者脂质过氧化物及白细胞介素Ⅱ的相关性.高血压杂志，1997，5(3)∶222
6 徐华模.自由基与细胞免疫.国外医学免疫学分册，1991，14(4)∶188
〔收稿日期 1999-02-30〕, 百拇医药
单位：高大胜 张宁汝 冯慧勤 蚌埠医学院附属医院心血管科 233004；袁灿兴 陈汝兴 上海龙华医院
关键词：心肌炎；柯萨奇病毒B；杀伤细胞，天然；过氧化脂质；小鼠
蚌埠医学院学报990503摘要 目的：探讨自然杀伤(NK)细胞活性及过氧化脂质(LPO)在病毒性心肌炎发病中的作用及其相关性。方法：采用125IduR释放法及MDA-TBA比色法，分别测定23只柯萨奇(Coxsackie)B3病毒接种BALB/c小鼠(模型组)和10只健康小鼠(对照组)脾脏的NK细胞活性及心脏组织中的LPO含量。结果：模型组小鼠的NK细胞活性明显低于对照组(P<0.001)，而LPO明显高于对照组(P<0.005)。两者呈显著负相关(P<0.01)。结论：心肌炎小鼠存在免疫功能紊乱及LPO异常，氧自由基损伤是导致NK细胞活性下降的可能原因之一。
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中国图书资料分类法分类号 R 542.21 R 392.12
Natural killer cell activity and lipid peroxide in Coxsackie virus B3-induced murine myocarditis
Gao Dasheng,Zhang Ningru,Feng Huiqin,Yuan Canxing,Chen Ruxing
(Department of Cardiology,Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Anhui 233004)
Abstract Objective:To explore the correlation between natural killer(NK) cell activity and lipid peroxide(LPO) level in 24 weeks BALB/c mice infected with coxsackie B3 virus.Methods:NK cell activity and LPO level were measured by 125IUDR and MDA-TBA colorimetry in 23 experimentally infected mice and 10 normal mice.Results:NK cell activity was significantly lower(P<0.001) and LPO level was significantly higher(P<0.005) in infected mice than in normal mice. NK cell activity and LPO level were negatively correlated(P<0.01).Conclusions:Myocarditis leads to disorder in immune function in mice. LPO level is negatively correlated with NK cell activity.The decrease in NK cell activity may be due to the increase in production of oxidative free radical(OFR).
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Key words myocarditis;Coxsackie B viruses;killer cells,natural;lipid peroxides;mice
病毒性心肌炎的发病机制迄今尚未阐明，业已证实病毒本身及免疫损伤是其发病的主要机制之一〔1，2〕。有关氧自由基(OFR)在病毒性心肌炎发病中的影响报道不多，本研究观察过氧化脂质(LPO)及自然杀伤(NK)细胞活性在柯萨奇B3病毒(CVB3)心肌炎小鼠中的变化，并对两者的相关性进行分析，旨在加深对心肌炎发病机制的认识。
1 材料与方法
1.1 实验动物 4周龄BALB/c小鼠50只，雌雄各半，由中国科学院上海实验动物中心提供。随机分成两组，正常对照组10只，模型组40只。
1.2 病毒与接种 柯萨奇B3病毒(Coxsackie virus B3,CVB3)(嗜心肌病毒，Nancy株)由上海市心血管病学研究所提供。在Hep-2细胞中测定其50%细胞感染率/毫升(TICD50/ml)为1011，接种前按1∶50稀释。模型组每只小鼠腹腔接种内含CVB3的MEM-Eagle液0.2 ml，对照组小鼠接种0.2 ml不含病毒的Eagle上清液。1.3 心脏组织中LPO含量的测定 小鼠处死后取心脏制成10%的组织匀浆，采用MDA-TBA比色法测定LPO的含量。先绘制标准曲线，然后吸取10%的组织匀浆0.2 ml，依次加入8.1%的十二烷基硫酸钠0.2 ml、20%醋酸缓冲液(pH=3.5)1.5 ml、0.8%的硫代巴比妥酸(TBA)1.5 ml、蒸馏水0.6 ml，摇匀；于95℃油浴中保温1 h,冷却；加蒸馏水1.0 ml、正丁醇吡啶混和液5.0 ml，振摇后离心(3 000 r/min)15 min，取上层液在532 nm波长下比色。组织LPO含量的计算：每克湿组织的LPO量(μmol)=查得的标准曲线值×(1/0.2)×(10/1 000)。
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1.4 NK细胞活性的测定 检测方法采用李仪奎等所述的125IudR释放法。接种后第8天，将小鼠处死取脾，用Ficoll液分别分离各鼠脾脏的淋巴细胞作为效应细胞，用YAC-1细胞(中科院上海细胞所提供)为靶细胞，用5 μci 125IudR标记靶细胞，效靶细胞比为100∶1。每份标本做2次，实验时用靶细胞对照测自然释放率，则NK细胞活性=上0.5 ml上清液cpm×〔2/(上0.5 ml上清液cpm+下0.5 ml上清液cpm)〕×100-自然释放率。
1.5 统计学方法 采用t检验及直线相关分析。
2 结果
模型组小鼠的NK细胞活性明显低于对照组(P<0.001)；而LPO水平则模型组显著高于对照组(P<0.005)(见表1)。心肌炎小鼠的NK细胞活性与LPO呈显著负相关(r=-0.756,P<0.01)。
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表1 两组小鼠NK细胞活性和LPO含量的比较(
±s) 组别n
NK细胞活性(%)
LPO(μmol/g)
对照组
10
12.750±2.100
1.517±0.297
模型组
23
7.670±2.010
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2.525±0.316
t
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6.59
3.25
P
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<0.001
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3 讨论
近年来，细胞免疫在病毒性心肌炎发病中的作用已受到众多学者的普遍关注。Godeny在实验中发现NK细胞能直接抑制病毒的复制〔1〕，另有学者报道小鼠体内的NK细胞消失，抵抗力显著下降，则病毒显著增殖，提示机体为防御病毒感染，NK细胞是不可缺少的〔3〕。笔者观察到小鼠感染CVB3 8 d后，NK细胞活性比对照组显著下降(P<0.001)，这与文献报道雷同，也充分表明NK细胞活性在病毒性心肌炎的发病中具有重要作用。
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LPO是OFR与细胞膜上多价不饱和脂肪酸侧链结合的产物，故LPO水平可以间接反映组织中OFR的含量。本研究发现，模型组小鼠心肌组织中的LPO明显高于对照组(P<0.005)，揭示OFR在病毒性心肌炎的发病机制中占有重要地位。OFR对心肌损害的可能机制为：(1)OFR与心肌细胞膜结合生成LPO，其又反过来作用于细胞膜，进而扩大膜的损伤，则细胞膜对离子的通透性发生改变，膜静息电位、心肌的兴奋性和传导性发生异常，从而导致心律失常；细胞外大量的钙离子进入细胞内造成钙超载，加重细胞损害〔4〕。(2)OFR还可与细胞内线粒体膜、溶酶体膜结合使氧化磷酸化受到抑制，能量代谢障碍；并释放出各种水解蛋白酶引起细胞的自溶，更加重心肌细胞的损伤。
为进一步探讨NK细胞活性与LPO的关系，本文对两者进行相关分析，发现两者呈显著负相关(P<0.01)，这与费瑜等报道OFR可损伤高血压患者淋巴细胞功能的结果类似〔5〕，其可能机制为OFR还可损伤淋巴细胞的细胞膜或直接抑制其功能，从而降低淋巴细胞对刺激原的应答，抑制淋巴细胞增殖和分化，影响淋巴细胞的免疫功能〔6〕。
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本文结果显示，CVB3病毒性心肌炎小鼠体内存在免疫功能紊乱，NK细胞活性与LPO呈显著负相关，OFR是造成NK细胞活性下降的可能原因之一。因此，为病毒性心肌炎防治奠定新的理论基础，在本病的防治中应用调节细胞免疫功能及氧自由基清除剂是可取的。
参考文献
1 Godeny EK,Gauntt CJ.Interferon and natural killer cell activity in Coxsackie virus B3——induced murine myocarditis.Eur Heart J,1987,8(Suppl)∶389
2 杨英珍，郭 棋，金佩英，等.急性病毒性心肌炎发病机理的探讨.中华微生物和免疫学杂志，1987，7(2)∶92
3 坦生圜子.NK(自然杀伤)细胞的抗病毒作用.国外医学微生物学分册，1984，7(2)∶66
, http://www.100md.com
4 Kutryk MJB,Maddaford TG,Ramjiawan B.Oxidation of membrane cholesterol alters active and passive transsarcolemmal calcium movement.Circ Res,1991,68(1)∶18
5 费 瑜，刘万车，陈丽娟，等.高血压患者脂质过氧化物及白细胞介素Ⅱ的相关性.高血压杂志，1997，5(3)∶222
6 徐华模.自由基与细胞免疫.国外医学免疫学分册，1991，14(4)∶188
〔收稿日期 1999-02-30〕, 百拇医药