病毒性心肌炎细胞感染模型的建立
作者：朱理安 关瑞锦 胡锡衷
单位：福建省心血管病研究所,福州 350001
关键词：心肌细胞；病毒性心肌炎；柯萨奇病毒B组；大鼠
福建医科大学学报000306
摘要: 目的 建立病毒性心肌炎细胞感染模型。 方法 以柯萨奇B3m病毒感染新生SD大鼠的培养心肌细胞,观察感染后细胞病变、搏动情况及超微结构的变化,检测培养液中心肌酶的改变,测定DNA含量。 结果 培养的SD大鼠搏动心肌细胞感染柯萨奇B3m病毒后,逐步出现细胞病变,细胞停止搏动,电镜下可见细胞线粒体肿胀,肌原纤维紊乱,Z线模糊,髓质体增多,细胞周期分析显示细胞受阻于G1期。 结论 该模型可作为体外研究病毒性心肌炎的基础。
中图分类号: R-332; R329.24; R542.21 文献标识码: A
, 百拇医药
文章编号:1000-2235(2000)03-0224-04
A Model of Viral Myocarditis:
Coxsackie B3m Virus Infection in Rat Myocytes
ZHU Li-an GUAN Rui-jin HU Xi-zhong
(Fujian Province Cardiovascular Insitute, Fuzhou 350001, China)
ABSTRACT: Objective To establish a model of viral myocarditis. Methods A micro-model of cultured new born rat myocytes was established,cells infected with Coxsackie B3m virus,48 h after Coxsackie virus B3m(CVB3m) infection,cytopathic effect(CPE),the beating rate and ultrastructural changes were observed under inverted-microscope and electron microscope. The cardiac enzyme——aspartate aminotransferase(AST),lactic dehydrogenase(LDH),creatine kinase(CK),CK-MB were detected by automatic biochemical analysis instrument. DNA content was detected by flow cytometry. Results After CVB3m infection,the beating rate decreased and then stopped and the ultrastructural damage was serious. Conclusion Myocardial cell infected with Coxsackie B3 virus could be used as a model for in vitro studies of viral myocarditis.
, 百拇医药
KEY WORDS: myocardial cell; viral myocarditis; Coxsackie virus B group; rat
柯萨奇B组病毒(Coxsackie B virus,CVB)可直接引起心肌细胞的损伤、病变及死亡,是导致病毒性心肌炎(virus myocarditis,VMC)的主要原因之一。进行病毒性心肌炎的研究,必然要遇到如何建立动物模型的问题,以便在此基础上进行生理、病理、药理及免疫学等方面的研究,探讨疾病的发展演变过程及药物作用机制,从而为VMC的治疗提供依据,并可直接作为药物治疗的模型。笔者于1997年8月～1998年6月采用柯萨奇B3m病毒感染培养的大鼠心肌细胞,建立病毒性心肌炎细胞感染模型,作为从事体外研究VMC的基础。
1 材料与方法
1.1 新生Sprague-Dawlay(SD)种大鼠由上海医科大学实验动物中心提供。
, 百拇医药
1.2 嗜心性柯萨奇病毒(CVB3m,Nancy株)由美国ATCC引入,甘肃省地方病防治研究所惠赠。
1.3 Eagle' MEM培养基购自GIBCO,胰蛋白酶(Trypsin 1∶250)购自DIFICO,其余试剂均为分析纯。
1.4 SD大鼠心肌细胞原代培养[2] 出生1～3天的SD大鼠,取其心室肌用0.1%胰蛋白酶(DIFCO 1∶250)分次消化细胞,所得的细胞悬液以差速贴壁法纯化,采用锥虫蓝染色观察细胞成活率(>95%)后分装于24孔组织培养板,每孔1 ml生长液含5×105细胞,生长液用含20%胎牛血清的Eagle's MEM液,置37℃培养箱(Forma 3339,美国)培养。
1.5 CVB3m病毒对培养搏动心肌细胞的感染 CVB3mNancy株,在人胚肾细胞上繁殖,接种前以3000 r/min离心30 min,弃沉淀;上清液在心肌细胞上测50%组织感染率(TCID50)[3]。上清液做不同程度稀释后,接种细胞作预实验,选择100TCID50作为正式实验的接种浓度。培养48 h将已呈规律搏动的各孔心肌细胞分成二组——病毒感染组和对照组。弃去上清液后,在病毒感染组细胞中每孔加0.5 ml含100TCID50CVB3m(在培养心肌细胞上测定其50%组织感染率为10[4,5])的生长液,对照组仅加生长液。37℃温育1 h后,各组弃上清,加生长液1 ml/孔,置37℃培养观察。
, 百拇医药
1.5.1 病毒感染后心肌细胞的形态学观察 37℃恒温倒置显微镜(Olympus 141AD,日本)观察培养过程心肌细胞的形态变化,感染CVB3m后细胞病变(cytopathic effect,CPE)以细胞受累的程度为标准,CPE表示法:(±)<25%,(+)25%～50%,(
)51%～75%,(
)>75%,(
)近100%。
1.5.2 电镜观察方法 取培养于载玻片生长成片、已呈同步化搏动的心肌细胞,无钙、镁离子的D-Hank's液洗涤2次,以pH 7.2的0.1 mol/L磷酸缓冲液洗涤2 h,每半小时换缓冲液一次,再用2%锇酸固定2 h,并经上述缓冲液洗涤1 h,样品包入4%琼脂,凝聚后切成小块,经乙醇及丙酮系列脱水,环氧树脂,EPON812包埋,60℃聚合制成超薄切片,在Hu-12A型电镜下观察。
, 百拇医药
1.5.3 心肌细胞培养液中酶的测定 取细胞密度为5.0×105/ml的心肌细胞培养液,采用全自动生化分析仪(美国Beckman公司)测定感染前后培养液中谷丙转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、CK-MB水平,每份样品1 ml。数据均以
±s表示,采用同批组间资料t检验。
1.5.4 DNA倍体分析 取培养第3天的细胞经0.15%胰蛋白酶液消化1～2 min,弃去消化液,D-Hank's液洗涤2次,然后加入适量培养液,经吹吸后制成细胞悬液(细胞密度>1.0×104/ml),RNA酶37℃作用20 min,碘化丙啶(PI)染色30 min,流式细胞仪检测,Multiple Option Cell Cycle Fitting(Autofit Version 2.53)软件分析。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 倒置显微镜下观察 乳鼠心肌细胞于37℃ CO2培养箱中孵育15 h后开始搏动,培养48 h细胞以60～80 min-1呈同步化搏动,于3～4天形成团簇,密集的细胞团块周围呈放射状排列着许多长梭形及多角形细胞(图1),胞核较大,细胞搏动百分比均在95%以上,搏动规则有力,无细胞病变(CPE)发生。在接种病毒后2天内,细胞搏动变慢(约30～60 min-1)而不规则,CPE不明显;接种病毒后第3天开始,心肌细胞搏动百分比明显下降,直至停止搏动。CPE很快自(+)→(),细胞明显变圆,成堆,有折光并团缩(图2)。
2.2 电镜观察 透射电镜下见正常心肌细胞线粒体丰富,粗面内质网显著可见,肌原纤维整齐,Z线明显(图3),病毒感染细胞的线粒体肿胀,髓样小体增多,肌原纤维紊乱,Z线模糊不清,细胞内可见病毒颗粒及内涵体(图4)。
2.3 CVB感染前后细胞酶学的改变见附表。
, 百拇医药
2.4 DNA倍体分析 正常培养心肌细胞DNA含量直方图中G0/G1期细胞占大多数,S期次之,G2+M期细胞最少。G1、S期的细胞数多于G2+M期(图5),说明此时心肌细胞的代谢主要以核酸和蛋白质的合成代谢为主,细胞生长较活跃。而CVB3m病毒感染的心肌细胞DNA含量直方图中可见G0/G1峰前出现的低于二倍体的峰(图6),为坏死细胞碎片及凋亡细胞,这种亚G0/G1峰的出现是因为变性坏死的细胞核内DNA部分降解或流出,基因组DNA已不足二倍体含量所致。
图1 培养第5天的正常心肌细胞,已形成团簇,周围放射排列着长梭形、多角形细胞.(×200)
, 百拇医药
图2 培养第5天的感染CVB3m心肌细胞,细胞变圆,团缩,成堆.(×200)
图3 正常培养心肌细胞,线粒体丰富,粗面内质网显著可见,肌原纤维整齐,Z线明显.(×7800)
图4 CVB3m感染后的心肌细胞,线粒体肿胀,髓样小体增多,肌原纤维紊乱,Z线模糊不清,细胞内可见病毒颗粒及包涵体.(×7800)附表 CVB3m感染大鼠心肌细胞酶学的变化(n=8)
培养天数
3
5
, 百拇医药
7
对照组
病毒感染组
对照组
病毒感染组
对照组
病毒感染组
AST
35.70±1.86
38.00±4.30
36.00±3.41
72.30±6.12*
, 百拇医药
39.70±2.50
85.41±3.25*
LDH
65.67±2.50
71.00±4.81
69.17±3.19
167.00±7.31*
76.00±4.34
191.85±6.28*
CK
5.50±1.55
, http://www.100md.com
5.80±1.54
5.58±1.11
12.50±3.10*
6.50±1.05
14.70±2.77*
CK-MB
2.51±0.71
3.30±1.83
3.74±0.84
9.80±2.74*
5.00±1.23
, 百拇医药
12.10±2.93*
与对照组比较,*:P<0.05.
图5 正常培养心肌细胞的细胞周期分析
Mean G1=143.2 Mean G2=286.0 %S=18.2
CV G1=4.1 CV G2=2.8 G2/G1=1.997
% G1=74.9 % G2=6.9
, 百拇医药
图6 CVB3m感染后的心肌细胞的细胞周期分析
Mean G1=88.9 Mean G2=171 %S=14.1
CV G1=6.5 CV G2=6.6 G2/G1=1.989
% G1=54.6 % G2=17.1 APOP%=14.2
3 讨 论
VMC是临床上常见的心脏疾病之一,其发病机制尚未阐明,治疗亦无特效方法,病毒感染培养心肌细胞的模型的建立,有助于对发病机制的探讨并可直接作为药物治疗的模型。
, 百拇医药
笔者采用Rui等人的方法成功培养了SD大鼠的心肌细胞[2]。培养的心肌细胞形态变化及搏动规律与有关文献的观察结果相符。实验中根据搏动细胞的比例表明心肌细胞的纯度达95%左右,这是因为采用了差速贴壁分离技术,经胰蛋白酶消化而得的细胞悬液中,主要含搏动心肌细胞及类上皮细胞,比例约60∶40,但因上皮细胞能更早贴壁,故利用此特点可将两种细胞分开,大大提高了心肌细胞的纯度。
各种病毒对不同种动物或同种不同品系动物的亲和性均不相同,就柯萨奇B组病毒而言,SD及Wistar纯种大鼠是可选择的动物模型[4],本实验选用SD纯种大鼠乳鼠培养细胞作为模型,实验证明此品系大鼠心肌炎诱发率可达100%。鼠龄选择1～3天的乳鼠较好,因此时心肌细胞已充分分化,适用于各种研究,而>4天的大鼠的培养心肌细胞就较慢发育成有自律搏动的细胞。新生大鼠心肌细胞易于长期培养,有利于某些指标的观察,即方便又有一定的优越性。
目前已知许多病毒可引起心肌炎,柯萨奇病毒是目前认为病毒性心脏疾患中最常见的病原,它作为一种肠道病毒具有直接的溶细胞作用,产生的溶细胞毒素可直接损害心肌。因此,选择柯萨奇B组病毒感染中最常见的B3型作为感染原[5],实验发现CVB3m有较高的嗜心性,故选用CVB3m作为毒种。
, http://www.100md.com
本研究在建立CVB3m病毒感染心肌细胞模型时按感染阳性百分率计算出病毒的TCID50为4.5,选用病毒的攻击毒力为100TCID50。病毒在感染细胞中繁殖,常可引起细胞代谢等方面的改变,并出现细胞病变,可以此来判定病毒感染的存在。本实验在CVB3m病毒感染心肌细胞后,细胞出现固缩、坏死等形态学改变,随感染时间延长,病变范围扩大,细胞病变达()～(),电镜下观察感染细胞中可见病毒颗粒及包涵体,且培养液中AST、LDH、CK、CK-MB的值明显高于对照组,心肌酶的升高与心肌损伤程度大致平行,这些均提示病毒感染导致了心肌细胞的损伤,胞膜通透性增高,细胞变性坏死,说明该模型的建立是成功的。
以往多通过51Cr(NaCrO4)标记培养的心肌细胞,然后在病毒感染后的不同时期,测定细胞中51Cr释放率后计算细胞毒性百分比,从而了解病毒感染心肌细胞后对其损害程度,但由于采用的是同位素检测,受一定条件限制。Huber等曾测定CVB3m感染后96 h培养液中51Cr释放值,发现此时51Cr自发性释放也大为增加,提示细胞毒性测定不足以真实反映心肌细胞的损害[6]。本实验通过流式细胞仪进行细胞周期分析,了解细胞的生长增殖情况,在一定程度上反映了病毒感染后的细胞毒性反应,方法快捷简便。
, 百拇医药
基金项目:福建省卫生厅青年基金资助项目(96013)
作者简介:朱理安(1974～),女,住院医师,医学硕士.
参考文献:
[1] Fohlman J,Pauksen K,Hyypia T,et al. Antiviral treatment with WIN54954 reduces mortality in murine Coxsackie virus B3 myocarditis[J]. Circulation, 1996,94(9):2254.
[2] Rui T,Yang YZ,Guo Q,et al. Effect of Astragalus memberanceus on electrophysiological activities of acute experimental Coxsackie B-3 viral myocarditis in mice[J]. Chin Med Sci J, 1993,8:203.
, 百拇医药
[3] 黄祯祥. 医学病毒学基础及实验技术[M]. 北京:科学出版社, 1990.130.
[4] 杨英珍. 病毒性心肌炎[M]. 上海:上海医科大学出版社, 1991.28.
[5] Yang YZ. Coxsackie B virus infection in rat beating heart cell culture[J]. J Virol Methods, 1985,12:92.
[6] Huber SA,Job LP, Woodruff JF. Lysis of infected myofibers by Coxsackie virus B-3 immune T lymphocytes[J]. Am J Pathol, 1980,98:681.
收稿日期:2000-04-18, http://www.100md.com
单位：福建省心血管病研究所,福州 350001
关键词：心肌细胞；病毒性心肌炎；柯萨奇病毒B组；大鼠
福建医科大学学报000306
摘要: 目的 建立病毒性心肌炎细胞感染模型。 方法 以柯萨奇B3m病毒感染新生SD大鼠的培养心肌细胞,观察感染后细胞病变、搏动情况及超微结构的变化,检测培养液中心肌酶的改变,测定DNA含量。 结果 培养的SD大鼠搏动心肌细胞感染柯萨奇B3m病毒后,逐步出现细胞病变,细胞停止搏动,电镜下可见细胞线粒体肿胀,肌原纤维紊乱,Z线模糊,髓质体增多,细胞周期分析显示细胞受阻于G1期。 结论 该模型可作为体外研究病毒性心肌炎的基础。
中图分类号: R-332; R329.24; R542.21 文献标识码: A
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文章编号:1000-2235(2000)03-0224-04
A Model of Viral Myocarditis:
Coxsackie B3m Virus Infection in Rat Myocytes
ZHU Li-an GUAN Rui-jin HU Xi-zhong
(Fujian Province Cardiovascular Insitute, Fuzhou 350001, China)
ABSTRACT: Objective To establish a model of viral myocarditis. Methods A micro-model of cultured new born rat myocytes was established,cells infected with Coxsackie B3m virus,48 h after Coxsackie virus B3m(CVB3m) infection,cytopathic effect(CPE),the beating rate and ultrastructural changes were observed under inverted-microscope and electron microscope. The cardiac enzyme——aspartate aminotransferase(AST),lactic dehydrogenase(LDH),creatine kinase(CK),CK-MB were detected by automatic biochemical analysis instrument. DNA content was detected by flow cytometry. Results After CVB3m infection,the beating rate decreased and then stopped and the ultrastructural damage was serious. Conclusion Myocardial cell infected with Coxsackie B3 virus could be used as a model for in vitro studies of viral myocarditis.
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KEY WORDS: myocardial cell; viral myocarditis; Coxsackie virus B group; rat
柯萨奇B组病毒(Coxsackie B virus,CVB)可直接引起心肌细胞的损伤、病变及死亡,是导致病毒性心肌炎(virus myocarditis,VMC)的主要原因之一。进行病毒性心肌炎的研究,必然要遇到如何建立动物模型的问题,以便在此基础上进行生理、病理、药理及免疫学等方面的研究,探讨疾病的发展演变过程及药物作用机制,从而为VMC的治疗提供依据,并可直接作为药物治疗的模型。笔者于1997年8月～1998年6月采用柯萨奇B3m病毒感染培养的大鼠心肌细胞,建立病毒性心肌炎细胞感染模型,作为从事体外研究VMC的基础。
1 材料与方法
1.1 新生Sprague-Dawlay(SD)种大鼠由上海医科大学实验动物中心提供。
, 百拇医药
1.2 嗜心性柯萨奇病毒(CVB3m,Nancy株)由美国ATCC引入,甘肃省地方病防治研究所惠赠。
1.3 Eagle' MEM培养基购自GIBCO,胰蛋白酶(Trypsin 1∶250)购自DIFICO,其余试剂均为分析纯。
1.4 SD大鼠心肌细胞原代培养[2] 出生1～3天的SD大鼠,取其心室肌用0.1%胰蛋白酶(DIFCO 1∶250)分次消化细胞,所得的细胞悬液以差速贴壁法纯化,采用锥虫蓝染色观察细胞成活率(>95%)后分装于24孔组织培养板,每孔1 ml生长液含5×105细胞,生长液用含20%胎牛血清的Eagle's MEM液,置37℃培养箱(Forma 3339,美国)培养。
1.5 CVB3m病毒对培养搏动心肌细胞的感染 CVB3mNancy株,在人胚肾细胞上繁殖,接种前以3000 r/min离心30 min,弃沉淀;上清液在心肌细胞上测50%组织感染率(TCID50)[3]。上清液做不同程度稀释后,接种细胞作预实验,选择100TCID50作为正式实验的接种浓度。培养48 h将已呈规律搏动的各孔心肌细胞分成二组——病毒感染组和对照组。弃去上清液后,在病毒感染组细胞中每孔加0.5 ml含100TCID50CVB3m(在培养心肌细胞上测定其50%组织感染率为10[4,5])的生长液,对照组仅加生长液。37℃温育1 h后,各组弃上清,加生长液1 ml/孔,置37℃培养观察。
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1.5.1 病毒感染后心肌细胞的形态学观察 37℃恒温倒置显微镜(Olympus 141AD,日本)观察培养过程心肌细胞的形态变化,感染CVB3m后细胞病变(cytopathic effect,CPE)以细胞受累的程度为标准,CPE表示法:(±)<25%,(+)25%～50%,(
)51%～75%,()>75%,()近100%。1.5.2 电镜观察方法 取培养于载玻片生长成片、已呈同步化搏动的心肌细胞,无钙、镁离子的D-Hank's液洗涤2次,以pH 7.2的0.1 mol/L磷酸缓冲液洗涤2 h,每半小时换缓冲液一次,再用2%锇酸固定2 h,并经上述缓冲液洗涤1 h,样品包入4%琼脂,凝聚后切成小块,经乙醇及丙酮系列脱水,环氧树脂,EPON812包埋,60℃聚合制成超薄切片,在Hu-12A型电镜下观察。
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1.5.3 心肌细胞培养液中酶的测定 取细胞密度为5.0×105/ml的心肌细胞培养液,采用全自动生化分析仪(美国Beckman公司)测定感染前后培养液中谷丙转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、CK-MB水平,每份样品1 ml。数据均以
±s表示,采用同批组间资料t检验。1.5.4 DNA倍体分析 取培养第3天的细胞经0.15%胰蛋白酶液消化1～2 min,弃去消化液,D-Hank's液洗涤2次,然后加入适量培养液,经吹吸后制成细胞悬液(细胞密度>1.0×104/ml),RNA酶37℃作用20 min,碘化丙啶(PI)染色30 min,流式细胞仪检测,Multiple Option Cell Cycle Fitting(Autofit Version 2.53)软件分析。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 倒置显微镜下观察 乳鼠心肌细胞于37℃ CO2培养箱中孵育15 h后开始搏动,培养48 h细胞以60～80 min-1呈同步化搏动,于3～4天形成团簇,密集的细胞团块周围呈放射状排列着许多长梭形及多角形细胞(图1),胞核较大,细胞搏动百分比均在95%以上,搏动规则有力,无细胞病变(CPE)发生。在接种病毒后2天内,细胞搏动变慢(约30～60 min-1)而不规则,CPE不明显;接种病毒后第3天开始,心肌细胞搏动百分比明显下降,直至停止搏动。CPE很快自(+)→(),细胞明显变圆,成堆,有折光并团缩(图2)。
2.2 电镜观察 透射电镜下见正常心肌细胞线粒体丰富,粗面内质网显著可见,肌原纤维整齐,Z线明显(图3),病毒感染细胞的线粒体肿胀,髓样小体增多,肌原纤维紊乱,Z线模糊不清,细胞内可见病毒颗粒及内涵体(图4)。
2.3 CVB感染前后细胞酶学的改变见附表。
, 百拇医药
2.4 DNA倍体分析 正常培养心肌细胞DNA含量直方图中G0/G1期细胞占大多数,S期次之,G2+M期细胞最少。G1、S期的细胞数多于G2+M期(图5),说明此时心肌细胞的代谢主要以核酸和蛋白质的合成代谢为主,细胞生长较活跃。而CVB3m病毒感染的心肌细胞DNA含量直方图中可见G0/G1峰前出现的低于二倍体的峰(图6),为坏死细胞碎片及凋亡细胞,这种亚G0/G1峰的出现是因为变性坏死的细胞核内DNA部分降解或流出,基因组DNA已不足二倍体含量所致。
图1 培养第5天的正常心肌细胞,已形成团簇,周围放射排列着长梭形、多角形细胞.(×200)
, 百拇医药
图2 培养第5天的感染CVB3m心肌细胞,细胞变圆,团缩,成堆.(×200)
图3 正常培养心肌细胞,线粒体丰富,粗面内质网显著可见,肌原纤维整齐,Z线明显.(×7800)
图4 CVB3m感染后的心肌细胞,线粒体肿胀,髓样小体增多,肌原纤维紊乱,Z线模糊不清,细胞内可见病毒颗粒及包涵体.(×7800)附表 CVB3m感染大鼠心肌细胞酶学的变化(n=8)
培养天数
3
5
, 百拇医药
7
对照组
病毒感染组
对照组
病毒感染组
对照组
病毒感染组
AST
35.70±1.86
38.00±4.30
36.00±3.41
72.30±6.12*
, 百拇医药
39.70±2.50
85.41±3.25*
LDH
65.67±2.50
71.00±4.81
69.17±3.19
167.00±7.31*
76.00±4.34
191.85±6.28*
CK
5.50±1.55
, http://www.100md.com
5.80±1.54
5.58±1.11
12.50±3.10*
6.50±1.05
14.70±2.77*
CK-MB
2.51±0.71
3.30±1.83
3.74±0.84
9.80±2.74*
5.00±1.23
, 百拇医药
12.10±2.93*
与对照组比较,*:P<0.05.
图5 正常培养心肌细胞的细胞周期分析
Mean G1=143.2 Mean G2=286.0 %S=18.2
CV G1=4.1 CV G2=2.8 G2/G1=1.997
% G1=74.9 % G2=6.9
, 百拇医药
图6 CVB3m感染后的心肌细胞的细胞周期分析
Mean G1=88.9 Mean G2=171 %S=14.1
CV G1=6.5 CV G2=6.6 G2/G1=1.989
% G1=54.6 % G2=17.1 APOP%=14.2
3 讨 论
VMC是临床上常见的心脏疾病之一,其发病机制尚未阐明,治疗亦无特效方法,病毒感染培养心肌细胞的模型的建立,有助于对发病机制的探讨并可直接作为药物治疗的模型。
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笔者采用Rui等人的方法成功培养了SD大鼠的心肌细胞[2]。培养的心肌细胞形态变化及搏动规律与有关文献的观察结果相符。实验中根据搏动细胞的比例表明心肌细胞的纯度达95%左右,这是因为采用了差速贴壁分离技术,经胰蛋白酶消化而得的细胞悬液中,主要含搏动心肌细胞及类上皮细胞,比例约60∶40,但因上皮细胞能更早贴壁,故利用此特点可将两种细胞分开,大大提高了心肌细胞的纯度。
各种病毒对不同种动物或同种不同品系动物的亲和性均不相同,就柯萨奇B组病毒而言,SD及Wistar纯种大鼠是可选择的动物模型[4],本实验选用SD纯种大鼠乳鼠培养细胞作为模型,实验证明此品系大鼠心肌炎诱发率可达100%。鼠龄选择1～3天的乳鼠较好,因此时心肌细胞已充分分化,适用于各种研究,而>4天的大鼠的培养心肌细胞就较慢发育成有自律搏动的细胞。新生大鼠心肌细胞易于长期培养,有利于某些指标的观察,即方便又有一定的优越性。
目前已知许多病毒可引起心肌炎,柯萨奇病毒是目前认为病毒性心脏疾患中最常见的病原,它作为一种肠道病毒具有直接的溶细胞作用,产生的溶细胞毒素可直接损害心肌。因此,选择柯萨奇B组病毒感染中最常见的B3型作为感染原[5],实验发现CVB3m有较高的嗜心性,故选用CVB3m作为毒种。
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本研究在建立CVB3m病毒感染心肌细胞模型时按感染阳性百分率计算出病毒的TCID50为4.5,选用病毒的攻击毒力为100TCID50。病毒在感染细胞中繁殖,常可引起细胞代谢等方面的改变,并出现细胞病变,可以此来判定病毒感染的存在。本实验在CVB3m病毒感染心肌细胞后,细胞出现固缩、坏死等形态学改变,随感染时间延长,病变范围扩大,细胞病变达()～(),电镜下观察感染细胞中可见病毒颗粒及包涵体,且培养液中AST、LDH、CK、CK-MB的值明显高于对照组,心肌酶的升高与心肌损伤程度大致平行,这些均提示病毒感染导致了心肌细胞的损伤,胞膜通透性增高,细胞变性坏死,说明该模型的建立是成功的。
以往多通过51Cr(NaCrO4)标记培养的心肌细胞,然后在病毒感染后的不同时期,测定细胞中51Cr释放率后计算细胞毒性百分比,从而了解病毒感染心肌细胞后对其损害程度,但由于采用的是同位素检测,受一定条件限制。Huber等曾测定CVB3m感染后96 h培养液中51Cr释放值,发现此时51Cr自发性释放也大为增加,提示细胞毒性测定不足以真实反映心肌细胞的损害[6]。本实验通过流式细胞仪进行细胞周期分析,了解细胞的生长增殖情况,在一定程度上反映了病毒感染后的细胞毒性反应,方法快捷简便。
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基金项目:福建省卫生厅青年基金资助项目(96013)
作者简介:朱理安(1974～),女,住院医师,医学硕士.
参考文献:
[1] Fohlman J,Pauksen K,Hyypia T,et al. Antiviral treatment with WIN54954 reduces mortality in murine Coxsackie virus B3 myocarditis[J]. Circulation, 1996,94(9):2254.
[2] Rui T,Yang YZ,Guo Q,et al. Effect of Astragalus memberanceus on electrophysiological activities of acute experimental Coxsackie B-3 viral myocarditis in mice[J]. Chin Med Sci J, 1993,8:203.
, 百拇医药
[3] 黄祯祥. 医学病毒学基础及实验技术[M]. 北京:科学出版社, 1990.130.
[4] 杨英珍. 病毒性心肌炎[M]. 上海:上海医科大学出版社, 1991.28.
[5] Yang YZ. Coxsackie B virus infection in rat beating heart cell culture[J]. J Virol Methods, 1985,12:92.
[6] Huber SA,Job LP, Woodruff JF. Lysis of infected myofibers by Coxsackie virus B-3 immune T lymphocytes[J]. Am J Pathol, 1980,98:681.
收稿日期:2000-04-18, http://www.100md.com