肠道病毒感染与儿童Ⅰ型糖尿病关系的研究
作者：刘希红 沈水仙 苏犁云 孙家娥 李红
单位：刘希红(200032 上海医科大学儿科医院内科)； 沈水仙(200032 上海医科大学儿科医院内科)；李红(200032 上海医科大学儿科医院内科)；苏犁云(病毒室)； 孙家娥(病毒室)
关键词：糖尿病；胰岛素依赖型；肠道病毒感染；柯萨奇病毒B组；IGM
中华儿科杂志000209 【摘要】 目的 探讨儿童Ⅰ型糖尿病与肠道病毒(EV)感染，特别是柯萨奇B组病毒(CVB)感染的关系。方法 采用RT-PCR方法，对45例糖尿病患儿血中EV-RNA进行检测，用微量中和试验方法，对糖尿病患儿和正常小儿血清中抗CVB中和抗体水平进行测定，同时用ELISA方法，测定CVB特异性IgM。结果 (1)糖尿病组45例患儿中EV-RNA阳性者为17例，(39%)，对照组51名儿童中阳性者为3名(6%)。(2)检测35例糖尿病患儿CVB-IgM阳性者为14例(40%)，40名对照组儿童中阳性者2名(5%)。(3)40例糖尿病患儿的CVB中和抗体检出为32例(80%)，其中抗体异常者为18例(56%)；对照组CVB中和抗体检出为40例(82%)；CVB感染型别分别以CVB B4，CVB B3为多。结论儿童Ⅰ型糖尿病发病与肠道病毒感染，特别是柯萨奇B组病毒感染有关。
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A study on the relationship between type Ⅰ diabetes mellitus and enterovirus infection
LIU Xihong，SHEN Shuixian, SU Liyun, et al.
Children's Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China
【Abstract】 Objective To study the relationship between type Ⅰ diabetes mellitus and enterovirus (EV) infection. Methods EV-RNA was detected in blood by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Anti-coxsackievirus B (CVB) neutralizing antibodies were detected by using micro-neutralization test. At the same time, CVB specific IgM antibody was detected with ELISA. Results EV-RNA was detected in 39%(17/45) of the patients and in 6%(3/51) of normal control group. Neutralizing antibody to CVB was found positive in 80%(32/40) of diabetes patients and in 82%(40/51)of normal controls, respectively. Abnormal neutralizing antibodies were found in 56%(18/32) of the patients. CVB specific IgM antibody was positive in 40% (14/35) and 5% (2/40) of patients group and normal group. Most of the CVB-prositive individuals in both groups were infected with CVB3 or CVB4. Conclusion The results of this study suggest that there may be a significant correlation between type Ⅰ diabetes mellitus and EV infection.
, 百拇医药
【Key words】 Diabetes mellitus, insulin-dependent; Enterovirus infections; Coxsackieviruses B; IGM
Ⅰ型糖尿病是由于产生胰岛素的β细胞受损而引起，尽管Ⅰ型糖尿病的发病机制还不很清楚，但由于遗传因素和环境因素相互作用导致胰岛β细胞自身免疫损伤已得到大多数人的认可，病毒感染是比较重要的环境因素之一，从宿主易感基因的遗传学分析、细胞动力学分析和新的血清学评价都表明,感染是β细胞损伤的开始点，为此我们观察了儿童Ⅰ型糖尿病与肠道病毒(EV)感染的关系，报道如下。
对象和方法
一、对象
1.儿童Ⅰ型糖尿病组：根据1985年WHO糖尿病诊断及分型标准[1]，选择1995年1月～1998年6月在本院内分泌病房住院的上海地区Ⅰ型糖尿病患儿45例，男21例，女24例，平均年龄9岁(3～13岁)。平均病程4.5个月(0～1年)。所有患儿近期均无发热及感冒等病毒感染史。
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2.对照组：选自上海地区正常小儿51例，男28例，女23例，平均年龄9岁(1～14岁)，所有小儿无心脏病史，近期无发热，感冒等疾病。
二、方法
1.EV RNA检测：采用RT-PCR方法检测血中肠道病毒RNA。引物位于肠道病毒5′末端高度保守区域，引物核苷酸顺序为：
正向：GAAACACGGACACCCAAAGTA
反向：引物为TCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT
扩增片段长度为308 bp。用异硫氰酸胍一步法提取全血中RNA。按RT-PCR常规方法进行,PCR反应条件：94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃聚合反应1 min，共30个循环。
2.柯萨奇B组病毒(CVB)特异性IgM的检测：应用CVB特异性IgM试剂盒(天津大通生物工程公司)。
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3.CVB中和抗体测定：CVB 1～6型采用微量中和抗体方法测定。
结果
一、EV RNA检测情况
在45例患者中RNA阳性17例，阳性率为39%，而对照组51例中RNA阳性3例，阳性率为6%。
二、CVB IgM检测情况
在Ⅰ型糖尿病组中有35例检测了CVB IgM，阳性14例(阳性率40%)，对照组40例检测，其中2例阳性(阳性率5%)。
三、CVB中和抗体检测情况
1.正常对照组CVB中和抗体检测情况及正常值：在正常对照组51例中40例检出抗CVB中和抗体，检出率为82%，中和抗体正常值的确定是以正常对照组检出的各型CVB最高抗体水平作为正常值的上限，本组抗CVB抗体正常值为B1≤1∶80, B2≤1∶80，B3≤1∶160, B4≤1∶160, B5≤1∶160, B6≤1∶80。
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2.Ⅰ型糖尿病组：40例中32例检出CVB中和抗体，检出率为80%。抗体异常为18例，占56%。患儿CVB抗体异常的型别分布以B4、B3感染为多，B4 8例(44%)，B36例(33%)，B23例(17%)，B5 1例(6%)。
四、EV检测结果与病程的关系
在45例患儿中有34例在发病初进行了EV RNA检测，其中15例阳性(44%)；另11例因糖尿病加重或出现酮症酸中毒等症状，分别在发病后3个月、4个月、1年等再次入院时首次进行EV RNA检测。这些患儿EV RNA检测阳性者2例(18%)。
讨论
一些研究发现，EV在Ⅰ型糖尿病发病中起一定的作用[2]。有研究报道在新诊断为Ⅰ型糖尿病的14例中，用PCR技术检测肠道病毒RNA，发现9例阳性(64%)，而45例对照中只有2例阳性(4%)[3]。本研究发现：在45例Ⅰ型糖尿病中RNA有39%为阳性，而对照组仅为6%。CVB IgM检测阳性为40%，对照组为5%。国外报道CVB特异性IgM在Ⅰ型糖尿病组中阳性为29%～33%，对照组仅为5%～8%[4]，与我们报道的相似。因此看来，肠道病毒感染特别是柯萨奇病毒和Ⅰ型糖尿病有很密切的相关性。通过对不同病程的EV RNA检测分析，发现在发病初RNA阳性检出率明显高于发病一段时间后的阳性检出率。说明肠道病毒感染与Ⅰ型糖尿病的起病有明显相关性，病毒可以直接感染胰岛β-细胞，损伤β-细胞；病毒感染也可作为自身免疫反应的起动因子，引起自身免疫反应，导致β-细胞损伤[5]，然而EV病毒感染与Ⅰ型糖尿病的病程研究还有待于进一步追踪不同病程中EV RNA阳性的持续情况。
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在我们研究中，CVB中和抗体在正常小儿中检出率很高，为82%，其中B3、B4、B5抗体滴度可达1∶160。说明EV感染在儿童中是非常常见的，中和抗体可持续存在。而Ⅰ型糖尿病组CVB中和抗体检出率只为80%。虽然根据正常对照组抗体效价水平确定Ⅰ型糖尿病组中有56%的患儿CVB抗体异常，但我们认为此项检查不能证明EV和Ⅰ型糖尿病之间的关系。
Clements等[3]报告对EV-PCR扩增出的阳性片断进行序列分析，发现其与CVB3序列有90%～93%的相似，和CVB4有91%～95%的相似。本组型别分布以CVB4、CVB3多见，因此与Ⅰ型糖尿病关系密切的可能是CVB3、CVB4。然而这些发现还需要大量的Ⅰ型糖尿病病例的检测进一步证实，同时需要完整的基因组序列分析。
, 百拇医药
参考文献
[1]World Health Organization. Diabetes mellitus: report of a WHO study group. Geneva: WHO Technical Report Series, 1985.727-729.
[2]Yoon JW, Austin M, Onodera T, et al. Virus induced diabetes mellitus: isolation of a virus from a child with diabetes ketoacidosis. Nengl Med J, 1979,300:1173-1178.
[3]Clements GB, Galbraith DN, Taylor KW, et al. Coxsackie B virus infection and onset of childhood diabetes. Lancet,1995,346: 221-223.
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[4]Banatvala JE, Schernthaner G, Schober E, et al. Coxsackie B ,mumps, rubella, and cytomegalovirus specific IgM responese in patients with juvenile-onset insulin-dependent diabetes mellitus in Britain, Austria, and Australia. Lancet,1985,8443:1409-1412.
[5]Solimena M, DeCamilli P.Coxsackie viruses and diabetes. Nature Med, 1995,1:25-26.
收稿日期：1999-03-12, 百拇医药
单位：刘希红(200032 上海医科大学儿科医院内科)； 沈水仙(200032 上海医科大学儿科医院内科)；李红(200032 上海医科大学儿科医院内科)；苏犁云(病毒室)； 孙家娥(病毒室)
关键词：糖尿病；胰岛素依赖型；肠道病毒感染；柯萨奇病毒B组；IGM
中华儿科杂志000209 【摘要】 目的 探讨儿童Ⅰ型糖尿病与肠道病毒(EV)感染，特别是柯萨奇B组病毒(CVB)感染的关系。方法 采用RT-PCR方法，对45例糖尿病患儿血中EV-RNA进行检测，用微量中和试验方法，对糖尿病患儿和正常小儿血清中抗CVB中和抗体水平进行测定，同时用ELISA方法，测定CVB特异性IgM。结果 (1)糖尿病组45例患儿中EV-RNA阳性者为17例，(39%)，对照组51名儿童中阳性者为3名(6%)。(2)检测35例糖尿病患儿CVB-IgM阳性者为14例(40%)，40名对照组儿童中阳性者2名(5%)。(3)40例糖尿病患儿的CVB中和抗体检出为32例(80%)，其中抗体异常者为18例(56%)；对照组CVB中和抗体检出为40例(82%)；CVB感染型别分别以CVB B4，CVB B3为多。结论儿童Ⅰ型糖尿病发病与肠道病毒感染，特别是柯萨奇B组病毒感染有关。
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A study on the relationship between type Ⅰ diabetes mellitus and enterovirus infection
LIU Xihong，SHEN Shuixian, SU Liyun, et al.
Children's Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China
【Abstract】 Objective To study the relationship between type Ⅰ diabetes mellitus and enterovirus (EV) infection. Methods EV-RNA was detected in blood by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Anti-coxsackievirus B (CVB) neutralizing antibodies were detected by using micro-neutralization test. At the same time, CVB specific IgM antibody was detected with ELISA. Results EV-RNA was detected in 39%(17/45) of the patients and in 6%(3/51) of normal control group. Neutralizing antibody to CVB was found positive in 80%(32/40) of diabetes patients and in 82%(40/51)of normal controls, respectively. Abnormal neutralizing antibodies were found in 56%(18/32) of the patients. CVB specific IgM antibody was positive in 40% (14/35) and 5% (2/40) of patients group and normal group. Most of the CVB-prositive individuals in both groups were infected with CVB3 or CVB4. Conclusion The results of this study suggest that there may be a significant correlation between type Ⅰ diabetes mellitus and EV infection.
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【Key words】 Diabetes mellitus, insulin-dependent; Enterovirus infections; Coxsackieviruses B; IGM
Ⅰ型糖尿病是由于产生胰岛素的β细胞受损而引起，尽管Ⅰ型糖尿病的发病机制还不很清楚，但由于遗传因素和环境因素相互作用导致胰岛β细胞自身免疫损伤已得到大多数人的认可，病毒感染是比较重要的环境因素之一，从宿主易感基因的遗传学分析、细胞动力学分析和新的血清学评价都表明,感染是β细胞损伤的开始点，为此我们观察了儿童Ⅰ型糖尿病与肠道病毒(EV)感染的关系，报道如下。
对象和方法
一、对象
1.儿童Ⅰ型糖尿病组：根据1985年WHO糖尿病诊断及分型标准[1]，选择1995年1月～1998年6月在本院内分泌病房住院的上海地区Ⅰ型糖尿病患儿45例，男21例，女24例，平均年龄9岁(3～13岁)。平均病程4.5个月(0～1年)。所有患儿近期均无发热及感冒等病毒感染史。
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2.对照组：选自上海地区正常小儿51例，男28例，女23例，平均年龄9岁(1～14岁)，所有小儿无心脏病史，近期无发热，感冒等疾病。
二、方法
1.EV RNA检测：采用RT-PCR方法检测血中肠道病毒RNA。引物位于肠道病毒5′末端高度保守区域，引物核苷酸顺序为：
正向：GAAACACGGACACCCAAAGTA
反向：引物为TCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT
扩增片段长度为308 bp。用异硫氰酸胍一步法提取全血中RNA。按RT-PCR常规方法进行,PCR反应条件：94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃聚合反应1 min，共30个循环。
2.柯萨奇B组病毒(CVB)特异性IgM的检测：应用CVB特异性IgM试剂盒(天津大通生物工程公司)。
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3.CVB中和抗体测定：CVB 1～6型采用微量中和抗体方法测定。
结果
一、EV RNA检测情况
在45例患者中RNA阳性17例，阳性率为39%，而对照组51例中RNA阳性3例，阳性率为6%。
二、CVB IgM检测情况
在Ⅰ型糖尿病组中有35例检测了CVB IgM，阳性14例(阳性率40%)，对照组40例检测，其中2例阳性(阳性率5%)。
三、CVB中和抗体检测情况
1.正常对照组CVB中和抗体检测情况及正常值：在正常对照组51例中40例检出抗CVB中和抗体，检出率为82%，中和抗体正常值的确定是以正常对照组检出的各型CVB最高抗体水平作为正常值的上限，本组抗CVB抗体正常值为B1≤1∶80, B2≤1∶80，B3≤1∶160, B4≤1∶160, B5≤1∶160, B6≤1∶80。
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2.Ⅰ型糖尿病组：40例中32例检出CVB中和抗体，检出率为80%。抗体异常为18例，占56%。患儿CVB抗体异常的型别分布以B4、B3感染为多，B4 8例(44%)，B36例(33%)，B23例(17%)，B5 1例(6%)。
四、EV检测结果与病程的关系
在45例患儿中有34例在发病初进行了EV RNA检测，其中15例阳性(44%)；另11例因糖尿病加重或出现酮症酸中毒等症状，分别在发病后3个月、4个月、1年等再次入院时首次进行EV RNA检测。这些患儿EV RNA检测阳性者2例(18%)。
讨论
一些研究发现，EV在Ⅰ型糖尿病发病中起一定的作用[2]。有研究报道在新诊断为Ⅰ型糖尿病的14例中，用PCR技术检测肠道病毒RNA，发现9例阳性(64%)，而45例对照中只有2例阳性(4%)[3]。本研究发现：在45例Ⅰ型糖尿病中RNA有39%为阳性，而对照组仅为6%。CVB IgM检测阳性为40%，对照组为5%。国外报道CVB特异性IgM在Ⅰ型糖尿病组中阳性为29%～33%，对照组仅为5%～8%[4]，与我们报道的相似。因此看来，肠道病毒感染特别是柯萨奇病毒和Ⅰ型糖尿病有很密切的相关性。通过对不同病程的EV RNA检测分析，发现在发病初RNA阳性检出率明显高于发病一段时间后的阳性检出率。说明肠道病毒感染与Ⅰ型糖尿病的起病有明显相关性，病毒可以直接感染胰岛β-细胞，损伤β-细胞；病毒感染也可作为自身免疫反应的起动因子，引起自身免疫反应，导致β-细胞损伤[5]，然而EV病毒感染与Ⅰ型糖尿病的病程研究还有待于进一步追踪不同病程中EV RNA阳性的持续情况。
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在我们研究中，CVB中和抗体在正常小儿中检出率很高，为82%，其中B3、B4、B5抗体滴度可达1∶160。说明EV感染在儿童中是非常常见的，中和抗体可持续存在。而Ⅰ型糖尿病组CVB中和抗体检出率只为80%。虽然根据正常对照组抗体效价水平确定Ⅰ型糖尿病组中有56%的患儿CVB抗体异常，但我们认为此项检查不能证明EV和Ⅰ型糖尿病之间的关系。
Clements等[3]报告对EV-PCR扩增出的阳性片断进行序列分析，发现其与CVB3序列有90%～93%的相似，和CVB4有91%～95%的相似。本组型别分布以CVB4、CVB3多见，因此与Ⅰ型糖尿病关系密切的可能是CVB3、CVB4。然而这些发现还需要大量的Ⅰ型糖尿病病例的检测进一步证实，同时需要完整的基因组序列分析。
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参考文献
[1]World Health Organization. Diabetes mellitus: report of a WHO study group. Geneva: WHO Technical Report Series, 1985.727-729.
[2]Yoon JW, Austin M, Onodera T, et al. Virus induced diabetes mellitus: isolation of a virus from a child with diabetes ketoacidosis. Nengl Med J, 1979,300:1173-1178.
[3]Clements GB, Galbraith DN, Taylor KW, et al. Coxsackie B virus infection and onset of childhood diabetes. Lancet,1995,346: 221-223.
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[4]Banatvala JE, Schernthaner G, Schober E, et al. Coxsackie B ,mumps, rubella, and cytomegalovirus specific IgM responese in patients with juvenile-onset insulin-dependent diabetes mellitus in Britain, Austria, and Australia. Lancet,1985,8443:1409-1412.
[5]Solimena M, DeCamilli P.Coxsackie viruses and diabetes. Nature Med, 1995,1:25-26.
收稿日期：1999-03-12, 百拇医药