rRTA:DS27免疫毒素的制备及胞内运输研究
作者：裴武红 沈倍奋 黎 燕 贺永怀 王国华 张贺秋 汪宝珍
单位：军事医学科学院基础医学研究所，北京100850
关键词：重组蓖麻毒素A链；免疫毒素；胶体金标记；内化；电镜
中国免疫学杂志990411 中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的：探讨免疫毒素rRTA:DS27的内化行为。方法：用原核系统来获得重组蓖麻毒z素A链(rRTA)；用胶体金双标记法进行Molt4细胞中免疫毒素的导向研究。结果：CM-Sephorose一步纯化到电泳纯的rRTA，电镜观察到rRTA:DS27遵循特异的胞内运输途径。结论：上述结果对于深入了解免疫毒素的作用机理，并进而改善其临床应用具有重要作用。
Preparation and intracellular routing of immunotoxin rRTA:DS27
, http://www.100md.com
PEI Wu-Hong,SHEN Bei-Fen,LI Yan et al.Beijing Institute of Basic Medical Sciences,Beijing 100850
Abstract Objective:To investigate the internalization of immunotoxin rRTA:DS27.Methods:Recombinant ricin toxin A chain were expressed in prokaryotic system.Immunogold double labelling method was used to study the intracellular routing of immunotoxin rRTA:DS27 in cultured Molt4 cells.Results:Recombinant ricin toxin A chain were purified to homogenity by one-step CM-Sephrose.Electron microscopy study showed that immunotoxin rRTA:DS27 was routing along with a specific intracellular pathway.Conclusion:These results may be helpful to deeply understand the targeting behavior of immunotoxins and further improve their clinical application.
, 百拇医药
Key words Recombinant ricin toxin A chain Immunotoxin Immunogold labelling Internalizatin Electron microscopy
免疫毒素是将一个具有特异性导向的单克隆抗体与一个强毒性的弹头蛋白进行化学交联而得到的，用于治疗肿瘤等顽症[1]。蓖麻毒素(ricin)是常用的弹头成分，由A、B两条链构成，其毒性部分A链是一种N-糖苷酶，可失活60 S核糖体，导致真核细胞的死亡。B链是一种半乳糖结合型蛋白，几乎可与所有的真核细胞上半乳糖受体相结合。天然的ricin作为弹头，存在的缺陷是，A、B链高度糖基化，在体内容易被网织内皮系统清除；B链会产生非特异性结合，影响了免疫毒素的导向特异性。用原核系统表达不杂有B链的、非糖基化的重组蓖麻毒素A链(recombinant ricin toxin A chain, rRTA)，解决了以上问题，而且满足了医药上的大量需求[2]。目前，在细胞生物学的研究中，人们已对ricin的内化有了初步的了解[3，4]，但对免疫毒素的细胞内行为知之甚少，对于重组毒素所构建的免疫毒素的胞内导向报道，更不曾见到。我们用胶体金法研究重组蓖麻毒素A链所构建的免疫毒素的内化，了解其胞内运输及最终定位情况，对免疫毒素的作用机理研究，临床上的合理用药，以及进行一些有效的药效改善，无疑具有很重要的意义。
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1 材料与方法
1.1 材料 重组质粒pET3b-rRTA，抗CD5的单克隆抗体DS27，携CD5抗原的Molt4细胞，BL21(DE3)菌株为本室保存；CM-Sepharose购自Pharmacia公司。
1.2 方法
1.2.1 rRTA的原核表达与鉴定 重组质粒pET3b-rRTA转化宿主菌BL21(DE3)，转化子过夜活化后，1%接种于新鲜的LB-Amp培养基中，37℃培养至OD600 nm约0.6，加入IPTG使终浓度达1 mmol
/L，诱导5h，12%SDS-PAGE分析全菌体蛋白。表达产物的免疫学鉴定，参照文献方法[5]进行。
1.2.2 表达产物的CM-Sepharose纯化30mlCM-Sepharose预先用5mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液平衡，然后将表达产物的超声上清缓慢流过层析柱，不被CM-Sepharose吸附的杂蛋白用10倍柱体积的5 mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液洗脱，然后用含有90 mmol/L NaCl的5 mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰，用12%SDS-PAGE分析。
, 百拇医药
1.2.3 免疫毒素的交联 使用异型双功能交联剂SPDP，交联方法参考文献[6]。交联液采用HP1050高效排阻液相色谱(HPSEC)进行分离。
1.2.4 双抗的胶体金标记5、15 nm胶体金颗粒由鞣酸法制备[7]。其中5nm胶体金颗粒标记兔抗ricin抗体，以示踪rRTA；15 nm胶体金标记羊抗鼠抗体，以示踪鼠抗人CD5单克隆抗体DS27。使用时将胶体金标双抗液以1∶20～1∶40倍比稀释。
1.2.5 细胞样品的准备 将HPSEC分离免疫毒素rRTA:DS27以10-9mol/L的浓度与胶体金标双抗、Molt4细胞共同孵育(对照组中不加免疫毒素)，并于1、3、6、10四个时间点取样；所采集的细胞样品用无菌PBS(pH7.2)洗涤1次。
1.2.6 电镜样品的制备及观测将PBS洗涤的细胞沉淀，戊二醛和锇酸固定，丙酮、乙醇脱水，EPON 812包埋后，切成厚度约60nm的切片，Philip 400型透射电镜观测。
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2 结果
2.1 rRTA的表达与鉴定 重组质粒pET3b-rRTA转化BL21(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析全菌体蛋白。在相应于天然RTA链的位置，出现了明显的表达条带，表达水平占菌体总蛋白的约40%(图 1)，Western blot证明了所表达的正是目的蛋白rRTA。
图1 SDS-PAGE分析rRTA的表达情况
Fig.1 SDS-PAGE analysis the expression of rRTA
Note:A.Wild type ricin；B.Uninduced pET3b/BL21(DE3)；C.Induced pET3b/BL21(DE3)；D-E. Uninduced pET3b-rRTA/BL21(DE3)；F-G.Induced pET3b-rRTA/BL21(DE3)
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2.2 rRTA的CM-Sepharose纯化 表达产物的超声上清过CM-Sepharose柱，用含有90 mmol/L NaCl的5mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液洗脱得到分子量约为30kD、电泳纯的重组蓖麻毒素A链(图2)。蛋白定量得知，重组蓖麻毒素A链的得率约为30mg/L 发酵液。这种纯化方法操作简单，只用CM-Sepharose一步就获得了电泳纯的重组蓖麻毒素A链。
图2 CM-Sepharose 纯化rRTA
Fig.2 rRTA purified by CM-Sepharose
Note:A. Wild type ricin;B. The sample before purification;C. The undesired proteins;D. Purified rRTA
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2.3 免疫毒素的内化示踪 细胞与免疫毒素、金标双抗37℃培养0～1 h时，5、15 nm两种金标物都出现于细胞膜表面(图3)，或其突起、凹陷等处。这些金标物在质膜上的分布并非均匀，大多数质膜表面未出现金标物，仅在质膜的少数区域观察到两种金粒的存在，这可能与Molt4细胞表面上CD5抗原的不规则分布有关。37℃培养1～3 h时，两种金标物都出现于有被小泡及一些大的胞内体中，有些金标物仍处于质膜表面，或出现于质膜的内陷小泡中，也有少数金标物出现于溶酶体中。37℃培养3～6 h时，在质膜表面几乎观察不到金标物的存在，金标物主要存在于各种形状的胞内体及溶酶体中(图4)。有些溶酶体内含有内化的运输泡，膜层结构非常复杂。37℃培养6～10 h时，在质膜表面及其附近的内吞小泡中都很难观察到金标物，绝大多数金标物出现于溶酶体中，某些含有双金标物的溶酶体临近高尔基器，但是在高尔基堆层内未能观察到金标物，可能是因为仅有极少数的金标物能进入高尔基器的缘故[8]。
, 百拇医药
图3 细胞膜表面的金标物(×80 000)
Fig.3 The gold particles on the cell surface (×80 000) 
图4 溶酶体中的金标物(×60 000)
Fig.4 The gold particles in a lysosome (×60 000)
在对照组的细胞中，只加入金标双抗而未加免疫毒素rRTA:DS27，观察结果表明，在细胞的质膜表面及各种细胞器中，均未发现金标物的存在，说明金标双抗与细胞不发生非特异性结合作用，这一点与预期结果完全一致。
3 讨论
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对于免疫毒素，它在循环过程中应该具有一定时期的稳定性，才能渗透到肿瘤内部，发挥其毒效。从我们的观察结果来看，在细胞与免疫毒素、金标双抗共孵育10h后，各种细胞器(包括溶酶体在内)中的5、15 nm金粒也没有分开，说明免疫毒素中毒素与单克隆抗体并没有发生解离。人们对ricin的毒性研究表明，杀伤细胞是靠其A链进入胞浆靶位点起作用的，而A、B两链何时发生解离，目前尚没有定论。至于免疫毒素中抗体与毒素的解离，文献未曾报道。从我们的研究来看，这种解离作用可能发生于胞内运输过程中溶酶体以后的某个细胞器中，如高尔基器或内质网。这种推测有待于进一步的研究证实。
rRTA:DS27免疫毒素的制备及胞内运输研究 国家‘863’生物技术项目资助(No.102-09-01-03)
作者简介：裴武红，女，28岁，博士生，主要研究分子免疫学；
沈倍奋，女，55岁，院士，博士生导师，主要研究分子免疫
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4 参考文献
[1] Wellner R B, Heweton J F, Poli M A et al. Ricin: Mechanism of action, detection and intoxication. J Toxical Toxin Reviews, 1995; 14(4): 483
[2] Frankel A E, Gerald D F, Siegall C et al. Advances in immunotoxin biology and therapy: A summary of the fourth international symposium on immunotoxins. Cancer Research, 1996; 56(4): 926
[3] Sandvig K, Deurs B V. Endocytosis, intracellular transport and cytotoxic action of Shiga toxin and ricin. Physiological Reviews, 1996; 76(4): 949
, 百拇医药
[4] Sandvig K, Deurs B V. Endocytosis and intracellular sorting of ricin and Shiga toxin. FEBS Letters, 1994; 346(1): 99
[5] 裴武红，沈倍奋， 李伍举 et al.计算机辅助设计使重组蓖麻毒素A链在E.coli中 高效表达.细胞与分子免疫学杂志，1998; 14(1)：81
[6] 赵立超，黎 燕，陈 兴 et al.免疫毒素清除人骨髓中克隆化白血病细胞的研究.中国实验血液学杂志，1993;1(1)：73
[7] Slot J W, Geuze H J. A method to prepare isodisperse colliodal gold sols in the size range 3-17nm. Ultramicroscopy, 1984; 15(1): 383
[8] Rapak A,Falnes P,Olsnes S.Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent trarslocation to cytosol.Proc Natl Acad Sci USA,1997;94:3783
(收稿1998-04-16 修回1998-05-25〕, 百拇医药
单位：军事医学科学院基础医学研究所，北京100850
关键词：重组蓖麻毒素A链；免疫毒素；胶体金标记；内化；电镜
中国免疫学杂志990411 中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的：探讨免疫毒素rRTA:DS27的内化行为。方法：用原核系统来获得重组蓖麻毒z素A链(rRTA)；用胶体金双标记法进行Molt4细胞中免疫毒素的导向研究。结果：CM-Sephorose一步纯化到电泳纯的rRTA，电镜观察到rRTA:DS27遵循特异的胞内运输途径。结论：上述结果对于深入了解免疫毒素的作用机理，并进而改善其临床应用具有重要作用。
Preparation and intracellular routing of immunotoxin rRTA:DS27
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PEI Wu-Hong,SHEN Bei-Fen,LI Yan et al.Beijing Institute of Basic Medical Sciences,Beijing 100850
Abstract Objective:To investigate the internalization of immunotoxin rRTA:DS27.Methods:Recombinant ricin toxin A chain were expressed in prokaryotic system.Immunogold double labelling method was used to study the intracellular routing of immunotoxin rRTA:DS27 in cultured Molt4 cells.Results:Recombinant ricin toxin A chain were purified to homogenity by one-step CM-Sephrose.Electron microscopy study showed that immunotoxin rRTA:DS27 was routing along with a specific intracellular pathway.Conclusion:These results may be helpful to deeply understand the targeting behavior of immunotoxins and further improve their clinical application.
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Key words Recombinant ricin toxin A chain Immunotoxin Immunogold labelling Internalizatin Electron microscopy
免疫毒素是将一个具有特异性导向的单克隆抗体与一个强毒性的弹头蛋白进行化学交联而得到的，用于治疗肿瘤等顽症[1]。蓖麻毒素(ricin)是常用的弹头成分，由A、B两条链构成，其毒性部分A链是一种N-糖苷酶，可失活60 S核糖体，导致真核细胞的死亡。B链是一种半乳糖结合型蛋白，几乎可与所有的真核细胞上半乳糖受体相结合。天然的ricin作为弹头，存在的缺陷是，A、B链高度糖基化，在体内容易被网织内皮系统清除；B链会产生非特异性结合，影响了免疫毒素的导向特异性。用原核系统表达不杂有B链的、非糖基化的重组蓖麻毒素A链(recombinant ricin toxin A chain, rRTA)，解决了以上问题，而且满足了医药上的大量需求[2]。目前，在细胞生物学的研究中，人们已对ricin的内化有了初步的了解[3，4]，但对免疫毒素的细胞内行为知之甚少，对于重组毒素所构建的免疫毒素的胞内导向报道，更不曾见到。我们用胶体金法研究重组蓖麻毒素A链所构建的免疫毒素的内化，了解其胞内运输及最终定位情况，对免疫毒素的作用机理研究，临床上的合理用药，以及进行一些有效的药效改善，无疑具有很重要的意义。
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1 材料与方法
1.1 材料 重组质粒pET3b-rRTA，抗CD5的单克隆抗体DS27，携CD5抗原的Molt4细胞，BL21(DE3)菌株为本室保存；CM-Sepharose购自Pharmacia公司。
1.2 方法
1.2.1 rRTA的原核表达与鉴定 重组质粒pET3b-rRTA转化宿主菌BL21(DE3)，转化子过夜活化后，1%接种于新鲜的LB-Amp培养基中，37℃培养至OD600 nm约0.6，加入IPTG使终浓度达1 mmol
/L，诱导5h，12%SDS-PAGE分析全菌体蛋白。表达产物的免疫学鉴定，参照文献方法[5]进行。
1.2.2 表达产物的CM-Sepharose纯化30mlCM-Sepharose预先用5mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液平衡，然后将表达产物的超声上清缓慢流过层析柱，不被CM-Sepharose吸附的杂蛋白用10倍柱体积的5 mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液洗脱，然后用含有90 mmol/L NaCl的5 mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰，用12%SDS-PAGE分析。
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1.2.3 免疫毒素的交联 使用异型双功能交联剂SPDP，交联方法参考文献[6]。交联液采用HP1050高效排阻液相色谱(HPSEC)进行分离。
1.2.4 双抗的胶体金标记5、15 nm胶体金颗粒由鞣酸法制备[7]。其中5nm胶体金颗粒标记兔抗ricin抗体，以示踪rRTA；15 nm胶体金标记羊抗鼠抗体，以示踪鼠抗人CD5单克隆抗体DS27。使用时将胶体金标双抗液以1∶20～1∶40倍比稀释。
1.2.5 细胞样品的准备 将HPSEC分离免疫毒素rRTA:DS27以10-9mol/L的浓度与胶体金标双抗、Molt4细胞共同孵育(对照组中不加免疫毒素)，并于1、3、6、10四个时间点取样；所采集的细胞样品用无菌PBS(pH7.2)洗涤1次。
1.2.6 电镜样品的制备及观测将PBS洗涤的细胞沉淀，戊二醛和锇酸固定，丙酮、乙醇脱水，EPON 812包埋后，切成厚度约60nm的切片，Philip 400型透射电镜观测。
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2 结果
2.1 rRTA的表达与鉴定 重组质粒pET3b-rRTA转化BL21(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析全菌体蛋白。在相应于天然RTA链的位置，出现了明显的表达条带，表达水平占菌体总蛋白的约40%(图 1)，Western blot证明了所表达的正是目的蛋白rRTA。
图1 SDS-PAGE分析rRTA的表达情况
Fig.1 SDS-PAGE analysis the expression of rRTA
Note:A.Wild type ricin；B.Uninduced pET3b/BL21(DE3)；C.Induced pET3b/BL21(DE3)；D-E. Uninduced pET3b-rRTA/BL21(DE3)；F-G.Induced pET3b-rRTA/BL21(DE3)
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2.2 rRTA的CM-Sepharose纯化 表达产物的超声上清过CM-Sepharose柱，用含有90 mmol/L NaCl的5mmol/L pH6.5的磷酸缓冲液洗脱得到分子量约为30kD、电泳纯的重组蓖麻毒素A链(图2)。蛋白定量得知，重组蓖麻毒素A链的得率约为30mg/L 发酵液。这种纯化方法操作简单，只用CM-Sepharose一步就获得了电泳纯的重组蓖麻毒素A链。
图2 CM-Sepharose 纯化rRTA
Fig.2 rRTA purified by CM-Sepharose
Note:A. Wild type ricin;B. The sample before purification;C. The undesired proteins;D. Purified rRTA
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2.3 免疫毒素的内化示踪 细胞与免疫毒素、金标双抗37℃培养0～1 h时，5、15 nm两种金标物都出现于细胞膜表面(图3)，或其突起、凹陷等处。这些金标物在质膜上的分布并非均匀，大多数质膜表面未出现金标物，仅在质膜的少数区域观察到两种金粒的存在，这可能与Molt4细胞表面上CD5抗原的不规则分布有关。37℃培养1～3 h时，两种金标物都出现于有被小泡及一些大的胞内体中，有些金标物仍处于质膜表面，或出现于质膜的内陷小泡中，也有少数金标物出现于溶酶体中。37℃培养3～6 h时，在质膜表面几乎观察不到金标物的存在，金标物主要存在于各种形状的胞内体及溶酶体中(图4)。有些溶酶体内含有内化的运输泡，膜层结构非常复杂。37℃培养6～10 h时，在质膜表面及其附近的内吞小泡中都很难观察到金标物，绝大多数金标物出现于溶酶体中，某些含有双金标物的溶酶体临近高尔基器，但是在高尔基堆层内未能观察到金标物，可能是因为仅有极少数的金标物能进入高尔基器的缘故[8]。
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图3 细胞膜表面的金标物(×80 000)
Fig.3 The gold particles on the cell surface (×80 000)
图4 溶酶体中的金标物(×60 000)
Fig.4 The gold particles in a lysosome (×60 000)
在对照组的细胞中，只加入金标双抗而未加免疫毒素rRTA:DS27，观察结果表明，在细胞的质膜表面及各种细胞器中，均未发现金标物的存在，说明金标双抗与细胞不发生非特异性结合作用，这一点与预期结果完全一致。
3 讨论
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对于免疫毒素，它在循环过程中应该具有一定时期的稳定性，才能渗透到肿瘤内部，发挥其毒效。从我们的观察结果来看，在细胞与免疫毒素、金标双抗共孵育10h后，各种细胞器(包括溶酶体在内)中的5、15 nm金粒也没有分开，说明免疫毒素中毒素与单克隆抗体并没有发生解离。人们对ricin的毒性研究表明，杀伤细胞是靠其A链进入胞浆靶位点起作用的，而A、B两链何时发生解离，目前尚没有定论。至于免疫毒素中抗体与毒素的解离，文献未曾报道。从我们的研究来看，这种解离作用可能发生于胞内运输过程中溶酶体以后的某个细胞器中，如高尔基器或内质网。这种推测有待于进一步的研究证实。
rRTA:DS27免疫毒素的制备及胞内运输研究 国家‘863’生物技术项目资助(No.102-09-01-03)
作者简介：裴武红，女，28岁，博士生，主要研究分子免疫学；
沈倍奋，女，55岁，院士，博士生导师，主要研究分子免疫
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4 参考文献
[1] Wellner R B, Heweton J F, Poli M A et al. Ricin: Mechanism of action, detection and intoxication. J Toxical Toxin Reviews, 1995; 14(4): 483
[2] Frankel A E, Gerald D F, Siegall C et al. Advances in immunotoxin biology and therapy: A summary of the fourth international symposium on immunotoxins. Cancer Research, 1996; 56(4): 926
[3] Sandvig K, Deurs B V. Endocytosis, intracellular transport and cytotoxic action of Shiga toxin and ricin. Physiological Reviews, 1996; 76(4): 949
, 百拇医药
[4] Sandvig K, Deurs B V. Endocytosis and intracellular sorting of ricin and Shiga toxin. FEBS Letters, 1994; 346(1): 99
[5] 裴武红，沈倍奋， 李伍举 et al.计算机辅助设计使重组蓖麻毒素A链在E.coli中 高效表达.细胞与分子免疫学杂志，1998; 14(1)：81
[6] 赵立超，黎 燕，陈 兴 et al.免疫毒素清除人骨髓中克隆化白血病细胞的研究.中国实验血液学杂志，1993;1(1)：73
[7] Slot J W, Geuze H J. A method to prepare isodisperse colliodal gold sols in the size range 3-17nm. Ultramicroscopy, 1984; 15(1): 383
[8] Rapak A,Falnes P,Olsnes S.Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent trarslocation to cytosol.Proc Natl Acad Sci USA,1997;94:3783
(收稿1998-04-16 修回1998-05-25〕, 百拇医药