膀胱癌组织MDR1基因产物P-GP170表达的意义
作者：张子顺 赵玉千 吴长利
单位：张子顺 赵玉千 首都医科大学附属北京天坛医院泌尿外科；吴长利 天津泌尿外科研究所
关键词：膀胱癌；MDR1基因； P-GP170糖蛋白；免疫组化；膀胱腔内化疗
首都医科大学学报/990317 提要： 为证实肿瘤多项耐药基因(MDR1)产物P-GP170与膀胱癌化疗失败及复发的关系，利用免疫组化方法对72例膀胱癌进行了研究。发现膀胱癌术后丝裂霉素膀胱灌注化疗失败者的P-GP170阳性率及强阳性率均明显高于初发膀胱癌，并且高分级肿瘤的P-GP170阳性及强阳性表达均高于低分级肿瘤。通过本实验可以认为膀胱癌化疗效果如何与膀胱癌组织中MDR1产物的量有关。
中图分类号： R737.14
, 百拇医药
The Significance of the MDR1 Gene Products GP170 Expression in the Bladder Cancer Tissue
Zhang Zishun, Zhao Yuqian
Department of Urology, Beijing Tiantan Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences
Wu Changli
Tianjin Institute for Urology
Abstract:The drug resistance of the tumor cells is the important factor in the failure of chemotherapy for cancer. To demonstrate the relation between the MDR1 products and the failure of chemotherapy for bladder cancer, the 72 cases of bladder cancer were studied with the immunohistochemical method. The restults suggested that the positive rate and the strong positive rate of the MDR1 products in the cases, in which the chemotherapy with mitomycin pouring into the bladdler post-operation was fail, were higher than those in the initial stage of bladder cancer. The positive and strong positive expressions of MDR1 products in the high differentiation tumors were higher than those in the low differentiation tumors. This research indicated that the outcome of the chemotherapy for bladder cancer is relevant to the amounts of the MDR1 products in the bladder cancer tissue.
, 百拇医药
Key words: bladder cancer; MDR1 gene; P-GP170 glycoprotein; immunohistochemical method; the chemotherapy in the bladder
了解膀胱癌组织中MDR1基因表达产物P-GP170糖蛋白的多少，是判断膀胱内注药化疗治疗膀胱癌和预防膀胱癌复发效果的指标之一。我们采用免疫组织化学技术对72例膀胱癌组织MDR1基因产物P-GP170糖蛋白的表达进行了研究，并对MDR1基因产物的表达与膀胱癌的恶性生物学行为及其病理分级的相互关系进行了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 临床资料
, 百拇医药
研究对象为1993～1997年收治的72例膀胱癌患者的膀胱癌组织石蜡块标本。患者年龄58～76岁。按WHO国际病理组织学分级标准分为G1级23例，G2级21例，G3级为28例。其中56例为初发膀胱癌，16例为膀胱内注药化疗后复发膀胱癌。本实验72例病人均单一应用丝裂霉素膀胱灌注化疗。
1.2 材料制备与实验方法
将膀胱癌石蜡块行4 μm的连续切片，60 ℃烘烤2 h，每块标本制备2张切片，并另有1张作为阴性对照。
免疫组织化学染色，将石蜡切片脱水，反复用蒸馏水振洗3次，再用配好的0.01 mol/L、pH 7.6的PBS缓冲液振洗3次，然后净片，用0.3%H2O2-甲醇溶液封闭切片，并置湿盒中37 ℃温育30 min，用PBS缓冲液振洗3次，净片。用0.1%胰酶37 ℃温箱温育20 min，PBS缓冲液振洗3次，然后净片。加第1抗体(MDR1-Ab 1∶100)4 ℃湿盒过夜。PBS缓冲液振洗3次，净片后滴加Biotin-Ⅰ抗体(1∶200)置湿盒内37 ℃温箱中温育60 min。取出切片用0.01 mol/L pH 7.6 PBS缓冲液振洗3次，每次3 min，然后净片。滴加DAB-H2O2工作液，镜下显色5 min，立即将切片放入PBS缓冲液中终止显色。用水冲洗10 min，用苏木素复染2 min，水洗10 min，1%盐酸乙醇分色后水洗10 min。将切片依次放入85%、95%和100%乙醇中各浸泡10 min，将切片置入二甲苯溶液中透明15 min后用树脂封片室温下自然干燥，显微镜下观察。
, 百拇医药
染色标准的判断，MDR1-Ab阴性染色判断标准为细胞膜无阳性染色物质者为阴性。如果细胞膜或胞浆有阳性物质(棕黄色棕红色)者为阳性。若阳性染色物质为棕黑色并呈片状分布者为强阳性。阴性对照以正常羊血清代替第1抗体(MDR1-Ab)。
2 结果
72例标本中P-GP170总的阳性表达率为66.7%(48/72)。56例初发膀胱癌中有62.5%(35/56)呈阳性染色，其中19%(11/56)为强阳性染色。16例丝裂霉素膀胱灌注治疗失败的复发膀胱癌切片中81.2%(13/16)P-GP170呈强阳性或阳性表达。
按WHO国际病理组织学分级，其P-GP170表达率不同，23例G1级肿瘤P-GP170的阳性表达率为52.1(12/23)%，21例G2级肿瘤的阳性表达率为72.3%(15/21)，而28例G3级肿瘤的阳性表达率高达82.1%(23/28)。
, http://www.100md.com
16例复发膀胱癌其初发时病理分级为G1级4例，G2级5例，G3级7例，P-GP170阳性表达率为75.0%(12/16)；复发后G1级2例，G2级6例，G3级8例，P-GP170阳性表达率为81.2%(13/16)。
3 讨论
体外研究证明，膀胱肿瘤细胞在一种化疗药物诱导下可以对多种结构无关的细胞毒药物发生交叉耐药，而其耐药水平与P-GP170糖蛋白的表达密切相关[1]。由MDR1基因编码的能量依赖性糖蛋白的相对分子质量为170万(P-GP170即P-glycoprotein-170)，其生物活性具有膜的药物排出泵的作用，它能逆浓度差将细胞内脂溶性化疗药物泵出细胞外，使细胞内药物浓度下降，从而产生抗药性[2，3]。人类各种不同组织中MDR1基因表达水平高低不同，故各种恶性肿瘤对化疗药物敏感度不同。
, 百拇医药
有关膀胱癌的MDR1基因表达的研究较少，有人认为膀胱粘膜仅有较低的P-GP170表达[4]。还有人证实[5]，膀胱癌P-GP170表达率为75%。本实验中58例初发膀胱癌P-GP170阳性表达率为62.5%，16例丝裂霉素灌注后复发的膀胱癌P-GP170阳性表达率为81.2%。而各不同分期的膀胱癌标本中P-GP170阳性表达率明显不同，肿瘤病理分级越高，其P-GP170阳性表达率愈高，并且相差显著。从而表明膀胱癌MDR1基因产物P-GP170的表达水平与膀胱癌的恶性行为及病理分级密切相关。此外化疗后复发的16例膀胱癌标本中P-GP170的阳性表达率(81.2%)明显高于初发膀胱癌(62.5%)，这一结果提示化疗后复发性膀胱癌P-GP170的高水平表达可能是膀胱癌内灌注化疗失败的重要因素。
, 百拇医药
对膀胱癌MDR1基因产物P-GP170表达水平的研究为膀胱癌抗药机制及逆转的研究及应用提供了理论依据。国外有研究发现采用钙通道阻滞剂如异搏定及免疫抑制剂环孢素A和FK506均可逆转MDR1表型，抑制P-GP170的膜泵作用[1，6]，增加细胞内化疗药物的浓度，提高癌细胞对化疗药物的敏感性。但是，由于患者应用抗药逆转剂后全身不良反应较大，故临床上此类药物的应用还处于实验阶段。由于膀胱腔内灌注化疗药物是局部效应，故采用抗药逆转剂与化疗药物联合应用可能是一种有效的化疗方法。
本实验结果证明，膀胱癌MDR1基因产物P-GP170的表达研究具有重要的临床意义：①膀胱癌MDR1基因产物P-GP170的检测，有助于膀胱癌术后化疗方案的合理制定和对预后的判断。②P-GP170功能蛋白的表达可能揭示腔内化疗失败的机制。③P-GP170过度表达的研究为采用MDR1逆转剂与化疗药物联合膀胱腔内灌注，预防和治疗膀胱癌提供了重要的科学依据。
, 百拇医药
参考文献
1.Floyd J W, Lin C W, Prout G R. Multidrug resistance of a doxorubicin-resistant bladder cancer cell lines. J Urol, 1990, 144:169～173
2.Noonan K E, Bedk C, Holzmayer T A. Quantitative analysis of MDR1 (multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A, 1990, 97:7160～7165
3.Alfred H, Schinkel, Morjo E M R, et al. Characterization of the human MDR3 P-glycoprotein and its recongnition by P-glycoprotein specific monoclonal antibody. Cancer Res, 1991,51:2626～2631
, http://www.100md.com
4.Chan H S L, Bradley C, Theorner P, et al. Immunohisochemcal detection of P-glycoprotein. J Clin Oncol, 1990,8:694
5.Gordon-cardo, O′Brien J P, Boccla J, et al. Expression of the multidrug resistance gene product (P-glycoprotein) in normal and tumor tissue. J Histochem Cytochem, 1990,38:1277～1283
6.Park J, Nobous, Monica L, et al. P-glycoprotein expression in bladder cancer. J Urol, 1994,151:43～47
收稿日期:1998-11-23, 百拇医药
单位：张子顺 赵玉千 首都医科大学附属北京天坛医院泌尿外科；吴长利 天津泌尿外科研究所
关键词：膀胱癌；MDR1基因； P-GP170糖蛋白；免疫组化；膀胱腔内化疗
首都医科大学学报/990317 提要： 为证实肿瘤多项耐药基因(MDR1)产物P-GP170与膀胱癌化疗失败及复发的关系，利用免疫组化方法对72例膀胱癌进行了研究。发现膀胱癌术后丝裂霉素膀胱灌注化疗失败者的P-GP170阳性率及强阳性率均明显高于初发膀胱癌，并且高分级肿瘤的P-GP170阳性及强阳性表达均高于低分级肿瘤。通过本实验可以认为膀胱癌化疗效果如何与膀胱癌组织中MDR1产物的量有关。
中图分类号： R737.14
, 百拇医药
The Significance of the MDR1 Gene Products GP170 Expression in the Bladder Cancer Tissue
Zhang Zishun, Zhao Yuqian
Department of Urology, Beijing Tiantan Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences
Wu Changli
Tianjin Institute for Urology
Abstract:The drug resistance of the tumor cells is the important factor in the failure of chemotherapy for cancer. To demonstrate the relation between the MDR1 products and the failure of chemotherapy for bladder cancer, the 72 cases of bladder cancer were studied with the immunohistochemical method. The restults suggested that the positive rate and the strong positive rate of the MDR1 products in the cases, in which the chemotherapy with mitomycin pouring into the bladdler post-operation was fail, were higher than those in the initial stage of bladder cancer. The positive and strong positive expressions of MDR1 products in the high differentiation tumors were higher than those in the low differentiation tumors. This research indicated that the outcome of the chemotherapy for bladder cancer is relevant to the amounts of the MDR1 products in the bladder cancer tissue.
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Key words: bladder cancer; MDR1 gene; P-GP170 glycoprotein; immunohistochemical method; the chemotherapy in the bladder
了解膀胱癌组织中MDR1基因表达产物P-GP170糖蛋白的多少，是判断膀胱内注药化疗治疗膀胱癌和预防膀胱癌复发效果的指标之一。我们采用免疫组织化学技术对72例膀胱癌组织MDR1基因产物P-GP170糖蛋白的表达进行了研究，并对MDR1基因产物的表达与膀胱癌的恶性生物学行为及其病理分级的相互关系进行了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 临床资料
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研究对象为1993～1997年收治的72例膀胱癌患者的膀胱癌组织石蜡块标本。患者年龄58～76岁。按WHO国际病理组织学分级标准分为G1级23例，G2级21例，G3级为28例。其中56例为初发膀胱癌，16例为膀胱内注药化疗后复发膀胱癌。本实验72例病人均单一应用丝裂霉素膀胱灌注化疗。
1.2 材料制备与实验方法
将膀胱癌石蜡块行4 μm的连续切片，60 ℃烘烤2 h，每块标本制备2张切片，并另有1张作为阴性对照。
免疫组织化学染色，将石蜡切片脱水，反复用蒸馏水振洗3次，再用配好的0.01 mol/L、pH 7.6的PBS缓冲液振洗3次，然后净片，用0.3%H2O2-甲醇溶液封闭切片，并置湿盒中37 ℃温育30 min，用PBS缓冲液振洗3次，净片。用0.1%胰酶37 ℃温箱温育20 min，PBS缓冲液振洗3次，然后净片。加第1抗体(MDR1-Ab 1∶100)4 ℃湿盒过夜。PBS缓冲液振洗3次，净片后滴加Biotin-Ⅰ抗体(1∶200)置湿盒内37 ℃温箱中温育60 min。取出切片用0.01 mol/L pH 7.6 PBS缓冲液振洗3次，每次3 min，然后净片。滴加DAB-H2O2工作液，镜下显色5 min，立即将切片放入PBS缓冲液中终止显色。用水冲洗10 min，用苏木素复染2 min，水洗10 min，1%盐酸乙醇分色后水洗10 min。将切片依次放入85%、95%和100%乙醇中各浸泡10 min，将切片置入二甲苯溶液中透明15 min后用树脂封片室温下自然干燥，显微镜下观察。
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染色标准的判断，MDR1-Ab阴性染色判断标准为细胞膜无阳性染色物质者为阴性。如果细胞膜或胞浆有阳性物质(棕黄色棕红色)者为阳性。若阳性染色物质为棕黑色并呈片状分布者为强阳性。阴性对照以正常羊血清代替第1抗体(MDR1-Ab)。
2 结果
72例标本中P-GP170总的阳性表达率为66.7%(48/72)。56例初发膀胱癌中有62.5%(35/56)呈阳性染色，其中19%(11/56)为强阳性染色。16例丝裂霉素膀胱灌注治疗失败的复发膀胱癌切片中81.2%(13/16)P-GP170呈强阳性或阳性表达。
按WHO国际病理组织学分级，其P-GP170表达率不同，23例G1级肿瘤P-GP170的阳性表达率为52.1(12/23)%，21例G2级肿瘤的阳性表达率为72.3%(15/21)，而28例G3级肿瘤的阳性表达率高达82.1%(23/28)。
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16例复发膀胱癌其初发时病理分级为G1级4例，G2级5例，G3级7例，P-GP170阳性表达率为75.0%(12/16)；复发后G1级2例，G2级6例，G3级8例，P-GP170阳性表达率为81.2%(13/16)。
3 讨论
体外研究证明，膀胱肿瘤细胞在一种化疗药物诱导下可以对多种结构无关的细胞毒药物发生交叉耐药，而其耐药水平与P-GP170糖蛋白的表达密切相关[1]。由MDR1基因编码的能量依赖性糖蛋白的相对分子质量为170万(P-GP170即P-glycoprotein-170)，其生物活性具有膜的药物排出泵的作用，它能逆浓度差将细胞内脂溶性化疗药物泵出细胞外，使细胞内药物浓度下降，从而产生抗药性[2，3]。人类各种不同组织中MDR1基因表达水平高低不同，故各种恶性肿瘤对化疗药物敏感度不同。
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有关膀胱癌的MDR1基因表达的研究较少，有人认为膀胱粘膜仅有较低的P-GP170表达[4]。还有人证实[5]，膀胱癌P-GP170表达率为75%。本实验中58例初发膀胱癌P-GP170阳性表达率为62.5%，16例丝裂霉素灌注后复发的膀胱癌P-GP170阳性表达率为81.2%。而各不同分期的膀胱癌标本中P-GP170阳性表达率明显不同，肿瘤病理分级越高，其P-GP170阳性表达率愈高，并且相差显著。从而表明膀胱癌MDR1基因产物P-GP170的表达水平与膀胱癌的恶性行为及病理分级密切相关。此外化疗后复发的16例膀胱癌标本中P-GP170的阳性表达率(81.2%)明显高于初发膀胱癌(62.5%)，这一结果提示化疗后复发性膀胱癌P-GP170的高水平表达可能是膀胱癌内灌注化疗失败的重要因素。
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对膀胱癌MDR1基因产物P-GP170表达水平的研究为膀胱癌抗药机制及逆转的研究及应用提供了理论依据。国外有研究发现采用钙通道阻滞剂如异搏定及免疫抑制剂环孢素A和FK506均可逆转MDR1表型，抑制P-GP170的膜泵作用[1，6]，增加细胞内化疗药物的浓度，提高癌细胞对化疗药物的敏感性。但是，由于患者应用抗药逆转剂后全身不良反应较大，故临床上此类药物的应用还处于实验阶段。由于膀胱腔内灌注化疗药物是局部效应，故采用抗药逆转剂与化疗药物联合应用可能是一种有效的化疗方法。
本实验结果证明，膀胱癌MDR1基因产物P-GP170的表达研究具有重要的临床意义：①膀胱癌MDR1基因产物P-GP170的检测，有助于膀胱癌术后化疗方案的合理制定和对预后的判断。②P-GP170功能蛋白的表达可能揭示腔内化疗失败的机制。③P-GP170过度表达的研究为采用MDR1逆转剂与化疗药物联合膀胱腔内灌注，预防和治疗膀胱癌提供了重要的科学依据。
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参考文献
1.Floyd J W, Lin C W, Prout G R. Multidrug resistance of a doxorubicin-resistant bladder cancer cell lines. J Urol, 1990, 144:169～173
2.Noonan K E, Bedk C, Holzmayer T A. Quantitative analysis of MDR1 (multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A, 1990, 97:7160～7165
3.Alfred H, Schinkel, Morjo E M R, et al. Characterization of the human MDR3 P-glycoprotein and its recongnition by P-glycoprotein specific monoclonal antibody. Cancer Res, 1991,51:2626～2631
, http://www.100md.com
4.Chan H S L, Bradley C, Theorner P, et al. Immunohisochemcal detection of P-glycoprotein. J Clin Oncol, 1990,8:694
5.Gordon-cardo, O′Brien J P, Boccla J, et al. Expression of the multidrug resistance gene product (P-glycoprotein) in normal and tumor tissue. J Histochem Cytochem, 1990,38:1277～1283
6.Park J, Nobous, Monica L, et al. P-glycoprotein expression in bladder cancer. J Urol, 1994,151:43～47
收稿日期:1998-11-23, 百拇医药