表皮生长因子受体单抗导向药物(EQ75-ADR)的制备及对人表皮癌抑瘤作用的研究
作者：何颖 张尚权 赵峰 吴振华 王耀发 严缘昌
单位：何颖 张尚权 赵峰 吴振华 王耀发 严缘昌(中国科学院上海细胞生物学研究所 上海 200031)
关键词：抗肿瘤；免疫偶联物；表皮生长因子受体
中国肿瘤生物治疗杂志000217
摘 要 目的： 制备抗表皮生长因子受体单克隆抗体(EQ75)与化疗药物阿霉素(ADR)、免疫偶联物(EQ75-ADR)，研究该偶联物对人表皮癌A431的抑瘤作用和小鼠的副作用,为最终应用于临床打下基础。方法： 用改进的戊二醛方法制备EQ75-ADR，MTT法检测EQ75-ADR对人表皮癌细胞A431和对照细胞人羊膜细胞Wish的48h和2h细胞毒作用，建立荷人表皮癌裸鼠模型和C57BL/6J小鼠模型，观察EQ75-ADR的抑瘤作用，比较EQ75-ADR和ADR对C57BL/6J的副作用。结果： EQ75-ADR对 A431细胞有明显的细胞毒作用，体外作用48h，EQ75-ADR对A431细胞的杀伤分别是EQ75，ADR和EQ75与ADR混合物(EQ75+ADR)的50倍，14倍和10倍，而EQ75-ADR对Wish细胞的杀伤只有ADR和EQ75+ADR的1/10，对Wish细胞的杀伤只有对A431细胞的1/300，2 h作用得到类似结果。EQ75-ADR显著抑制裸鼠体内肿瘤的生长，抑制率高达92.2% (P<0.01)，对C57BL/6J小鼠的副作用明显低ADR。结论： EQ75-ADR具有选择性杀伤作用，在体外和体内对表皮癌均有显著抑制作用，副作用小，在肿瘤生物治疗中具有潜在的应用价值。
, 百拇医药
《中国图书资料分类法》分类号 R979.1； R392.1
Preparation of Anti-EGFR Monoclonal Antibody Immunoconjugate (EQ75-ADR) and It's Inhibitory Effect on Human Epidermoid Carcinoma
He Ying Zhang Shangquan Zhao Feng Wu Zhenghua Wang Yaofa Yan Yuanchang
(Shanghai Institute of Cell Biology，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200031)
Abstract Objective: To prepare an immunoconjugate of anti-EGFR monoclonal antibody (EQ75) and adriamycin (ADR) and to investigute it's inhibitory effect on human epidermoid carcinoma (A431) in vitro and in vivo and it's side effect on C57BL/6J mice. Methods: The immunoconjugate (EQ75-ADR) was prepared with an improved glutaraldehyde conjugate method and the cytotoxicity effects of EQ75-ADR on A431 cells and Wish cells were measured by MTT assay. A431 tumor-bearing nude mice and C57BL/6J experimental model were established and were used for testing the inhibitory effects of EQ75-ADR. The side effect of EQ75-ADR was compared with ADR. Results: The EQ75-ADR showed specific cytotoxicity on A431cells, the cytotoxicity of EQ75-ADR was 50-fold, 14-fold and 10-fold more efficient than that of EQ75, ADR and mixture of EQ75 and ADR (EQ75+ADR) respectively. The effect of EQ75-ADR on with cells was 10-fold less efficient than that of ADR and EQ75+ADR. As compared with the cytoxicity effect of EQ75-ADR on Wish cells with A431 cells, it showed 300-fold less efficient. Similar cytotoxicity results were shown in 2 h treatment experimental group. The EQ75-ADR exhibited significant anti-tumor activity on tumor-bearing nude mice, and the inhibition rate is 92.2% (P<0.01). As compared with ADR, it's side effect was much lower. Conclusion: The EQ75-ADR exhibited targeted delivery and striking anti-tumor activity in vitro and in vivo and this approach appears a promising future for clinic purpose.
, 百拇医药
Key words anti-tumor; immunoconjugate; epidermal growth factor receptor(EGFR)
蒽环类药物阿霉素(adriamycin，ADR)是目前普遍使用的抗癌化疗药物之一。但由于阿霉素的非特异性细胞毒性，在用于治疗肿瘤的同时，常常对正常组织，器官也造成严重的毒副作用，使它在临床上的应用受到了限制。研究表明，抗体导向治疗能有效地减少药物对正常组织的毒副作用，增加肿瘤细胞的药物摄入量而提高治疗指数，已成为癌症生物治疗的重要研究方向之一[1]。近年来，随着肿瘤分子生物学的发展，国内外研究者发现，表皮癌,膀胱癌，乳腺癌和胶质癌等多种肿瘤细胞表面过度表达表皮生长因子受体(EGFR)[2]，而且由于EGFR的结构并不随细胞的分裂增殖而改变，所以不存在异质性(heterogeneity)，使抗EGFR单抗具有广谱抗肿瘤作用，避免了单一的肿瘤特异性单抗的局限性，因而是抗肿瘤导向治疗的理想药物载体。
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本实验以抗表皮生长因子受体单抗EQ75为载体(本实验室制惫，鉴定[3])，采用改进后的戊二醛方法将阿霉素(ADR)与单抗(EQ75)偶联，制备抗体偶联物(EQ75-ADR)，研究其对表面过度表达EGFR的人表皮癌细胞A431的体外细胞毒作用和对荷人表皮癌裸鼠治疗作用，比较偶联物与阿霉素对C57BL/6J的副作用，为导向药物应用于临床提供实验依据和理论基础。
1 材料与方法
1.1 动物
实验BALB/c裸小鼠, 雄性， 5～6周, C57BL/6J小鼠,雄性，6～7周,由中国科学院上海细胞生物学研究所实验动物中心提供。
1.2 细胞和抗体
人表皮癌细胞(A431)，人羊膜细胞(Wish)，由中科院上海细胞生物学研究所提供。
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抗EGFR抗体EQ75,由本实验室制备，常规导引小鼠腹水的方法大量扩增，用快速蛋白液相色谱系统(FPLC) 经Sepharose Protein G亲和层析柱纯化，PD-10柱脱盐，经 SDS-PAGE电泳鉴定(图略)。浓缩抗体浓度为3～5 mg/ml，低温保存备用。
1.3 偶联物EQ75-ADR的制备和纯化[4]
EQ75单抗(3～5 mg)，室温下用二硫苏糖醇(DTT, 25 mmol/L)还原，30 min后过PD-10柱(Pharmacia)除去未反应的DTT，收集还原后的抗体部分；阿霉素室温下与新配的戊二醛反应(分子比1∶1),然后与还原的抗体反应(抗体与阿霉素的分子比为1∶25),反应混合物在摇床上反应1 h后，过PD-10柱，除去未反应的游离的阿霉素部分；抗体与阿霉素的分子比通过分别测量偶联物在280 nm和495 nm的吸光度计算，(波长495 nm时，阿霉素的消光系数为196)。
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1.4 抗体和偶联物免疫活性的鉴定
4℃条件下，A431细胞( 1×106)与100 μl不同浓度(10倍稀释)的抗体或偶联物反应,加入兔抗鼠IgG1-FITC,反应1 h,用流式细胞仪 FACScan(Becton Dicknson)进行定量荧光分析，以非特异性抗体肺癌单抗7D为阴性对照,用所有细胞的平均荧光强度值表示抗体及偶联物与靶细胞的结合力大小。
1.5 体外细胞毒作用实验(MTT比色法测定)
1.5.1 长时细胞毒作用
人表皮癌细胞A431细胞,加入96孔培养板中(2.5×104/孔)，培养过夜，使细胞贴壁，将细胞分为4组，分别加入不同稀释度(5倍稀释)的单抗，偶联物，阿霉素，及单抗阿霉素混合物(每组药物浓度与偶联物中抗体和阿霉素浓度平行), 每个浓度设3个平行孔；对照孔为RPMI 1640培液，继续培养48 h后，加入噻唑蓝MTT 25 μl/孔(5 mg/ml，Sigma公司)，于 37℃，5%CO2温箱中培养4～6 h，2 000 r/min离心，弃上清，加入二甲亚砜(DMSO) 150 μl/孔，计算各组药物对细胞生长的抑制率：
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同法测定4组药对人羊膜细胞Wish的生长的抑制率。
1.5.2 短时细胞毒实验
A431细胞和Wish细胞分别与上述4组药物作用2 h，吸去作用药物，用RPMI培液洗3次，然后加入培液继续培养46 h，同法计算药物的抑制率。
1.6 偶联物对荷人表皮癌裸鼠的治疗作用
体外培养人表皮癌细胞A431，制成细胞悬液(2×106细胞/ml)，接种于裸鼠右腋皮下，100 μl/只，接种后10 d，当皮下肿瘤可触及，肿瘤平均直径为3～4 mm 左右时,随机分为4个实验组(单抗，偶联物，阿霉素和PBS组)进行实验，每组5只荷瘤裸鼠，腹腔注射治疗药物，抗体50 μg/g体重，阿霉素1.5 μg/g体重，偶联物(含抗体50 μg，阿霉素1.5 μg/g体重)，隔天注射1次，共10次，对照组注射PBS 1 ml/只，用游标卡尺测量肿瘤长径a(mm)，及相垂直的短径b(mm)，并用公式V(mm3)=(a×b2)×1/2计算体积,治疗结束后处死裸鼠剥离肿瘤称重并进行比较，抑制率(%)=(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。
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1.7 偶联物及游离药物对C57BL/6J荷瘤小鼠的副作用比较
同法建立荷人表皮癌C57BL/6J小鼠模型，随机分为4个实验组，抗体组，偶联物组，阿霉素组和对照组，每组5只荷瘤小鼠，咀部注射抗体(25 μg/g体重)，偶联物(含抗体25 μg/g体重，阿霉素0.75 μg/g体重), 阿霉素 (0.75 μg/g体重)和PBS(0.5 ml/只),隔天注射1次，共注射10次，比较偶联物和阿霉素对C57BL/6J荷瘤小鼠的副作用。
2 结 果
2.1 偶联物EQ75-ADR的制备及稳定性
制备的偶联物，经PD-10柱分离收集(1 ml/管)，其洗脱液经紫外检测，在波长280 nm和495 nm时出现的第一个峰即为偶联物EQ75-ADR，见图1。偶联物中抗体与药物分子比为1∶8～1∶10，聚合物<5%，偶联物得率高达到80%～90%，偶联物除菌后在4℃冰箱内放置1个月以上无沉淀可见，经电泳鉴定无降解，FACScan鉴定仍有高的细胞结合活性，说明偶联物性质稳定。
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图1 用PD-10柱分离反应混合物
Fig. 1 Separation of free ADR from EQ75-ADR,gel filtration on PD-10 column
2.2 抗体和偶联物免疫活性鉴定
流式细胞仪定量免疫荧光分析结果表明，在体外，单抗和偶联物与靶细胞A431特异结合，见图2，在相同浓度下，与未偶联的抗体相比偶联物与靶细胞的结合力只降低5%～10%，保留了抗体的绝大部分活性(90%)，非特异肺癌单抗7D与A431细胞不结合，荧光强度仅为3.45%。
2.3 偶联物体外细胞毒作用
各组药物体外48 h和2 h细胞毒作用的半数抑制浓度，作用48 h，偶联物对A431的杀伤明显强于其它3组作用药物，比单抗强50倍，阿霉素强14倍，单抗阿霉素混合物强10倍(见图3A)，而对非靶细胞Wish，偶联物的杀伤力明显降低，只有阿霉素的1/10，偶联物对Wish 细胞的杀伤只有对A431细胞的1/300，(见图3B)，偶联物表现出明显的选择性细胞毒性。单抗阿霉素混合物的细胞毒性与游离阿霉素相似，对靶细胞和非靶细胞既无选择性杀伤作用，也无协同作用，与偶联物的选择性细胞毒作用明显不同，抗体EQ75对靶细胞生长也表现出一定的抑制作用，但其效果远远低于偶联物。2 h细胞毒作用与48 h细胞毒作用结果相似。(见图4A，B)，偶联物对靶细胞A431的杀伤是阿霉素的26倍，单抗阿霉素混合物的9倍，对非靶细胞Wish生长抑制率在25%以下,说明偶联物作用2 h对正常细胞的生长几乎没有影响。
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图2 间接免疫荧光法检测抗体和偶联物
与A431的结合力曲线
Fig. 2 Antigen binding of the EQ75 and EQ75-ADR
determined by indirect immunofluorescence
2.4 偶联物对荷人表皮癌裸鼠的抑瘤作用
腹腔注射单抗，偶联物和游离药对各组裸鼠进行等剂量治疗，隔天1次，连续用药10次。偶联物治疗1周，裸鼠皮下肿瘤没有继续增大，从第2周开始肿瘤有减小趋势，其中1只裸鼠在治疗结束时皮下肿瘤完全消退，偶联物对荷人表皮癌裸鼠有明显抑瘤作用，抑制率达到92.2% (P<0.01)，抗体和游离阿霉素对裸鼠皮下肿瘤的生长有一定的控制作用，但并不能完全抑制肿瘤持续增长，抑制率分别为76.0%和66.8%。对照组裸鼠皮下肿瘤持续增长，裸鼠体重减轻,其中的1只裸鼠因肿瘤过大而死亡，当对照组裸鼠皮下肿瘤体积达到3 000 mm3时，结束治疗,剥离各组裸鼠皮下肿瘤称重，对照组、EQ75组、ADR组、EQ75-ADR偶联组，分别为2.231±0.895(g)，0.738±0.136 (g), 0.530±0.121 (g),0.173±0.167 (g)。
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2.5 化疗药阿霉素和偶联物的副作用比较
单独用阿霉素局部治疗C57BL/6J小鼠，连接注射药物3次，小鼠开始出现局部脱毛症状，继续注射药物，小鼠的上肢肿胀变形，脱毛加重，健康状况下降，体重减轻。偶联物对C57BL/6J小鼠的治疗中虽然也有局部脱毛的症状，但其程度要轻得多，并且在停止用药的一周后完全恢复。偶联物EQ75-ADR对C57BL/6J小鼠皮下表皮瘤显示良好的治疗效果，毒副作用远远低于阿霉素。
图3 抗体、阿霉素、偶联物及单抗阿霉素混合物对A431和Wish的48 h细胞毒作用
Fig. 3 48 h cytotoxicity of EQ75，ADR，EQ75-ADR and EQ75+ADR onA431 and Wish tested by MTT
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A： Sensitive cell A431； B： Insensitive cell Wish
图4 抗体、阿霉素、偶联物及单抗阿霉素混合物对A431和Wish的2 h细胞毒作用
Fig. 4 2 h cytotoxicity of EQ75，ADR，EQ75-ADR and EQ75+ADR on A431 and Wish tested by MTT
A： Sensitive cell A431； B： Insensitive cell Wish
3 讨 论
用于偶联单抗和抗肿瘤药物的方法很多[5],本文用改进的戊二醛偶联法制备抗肿瘤导向药物EQ75-ADR，通过对抗体的处理及反应条件的控制，每个抗体分子上偶联8～10个阿霉素分子，比传统的戊二醛偶联方法偶联的药物分子数有所提高，蛋白质和药物分子之间的聚合作用明显降低，基本上无聚合物存在，偶联物与靶细胞A431结合的免疫活性保留90%以上，偶联物得率达80%～90%，是目前较为理想的偶联方法之一。戊二醛偶联方法与其他偶联方法相比，有效率高，操作简单的优点，比较适合临床使用时的大量制备。
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上海市科委科技发展基金(954119028)资助
何颖,女,24岁,硕士,主要从事肿瘤导向治疗的研究
参 考 文 献
1，Mehren MV， Weiner LM. Monoclonal antibody based therapy. Curr Opin Oncol， 1996， 8： 493
2，Harris AL. Epidermal growth factor receptor expression in human primary cancera. Cancer Res， 1990， 31： 458
3，张尚权， 严缘昌， 何 颖， 等. 抗皂角毒，表皮生长因子受体双功能抗体的制备与体外效应的研究. 中国免疫学杂志， 1999， 15： 168
4，Sivam GP， Martin PJ， Resfeld RA， et al. Therapeutic efficacy of a doxorobicin immunoconjugate in a precinical model of spontaneous metastatic human melanoma. Cancer Res， 1995， 55： 2352
5，何 颖， 张尚权， 严缘昌， 等. 单抗与细胞毒药物化学交联概况. 中国新药杂志， 1998， 7(6)： 423
(1999-05-27收稿； 1999-10-03修回), http://www.100md.com
单位：何颖 张尚权 赵峰 吴振华 王耀发 严缘昌(中国科学院上海细胞生物学研究所 上海 200031)
关键词：抗肿瘤；免疫偶联物；表皮生长因子受体
中国肿瘤生物治疗杂志000217
摘 要 目的： 制备抗表皮生长因子受体单克隆抗体(EQ75)与化疗药物阿霉素(ADR)、免疫偶联物(EQ75-ADR)，研究该偶联物对人表皮癌A431的抑瘤作用和小鼠的副作用,为最终应用于临床打下基础。方法： 用改进的戊二醛方法制备EQ75-ADR，MTT法检测EQ75-ADR对人表皮癌细胞A431和对照细胞人羊膜细胞Wish的48h和2h细胞毒作用，建立荷人表皮癌裸鼠模型和C57BL/6J小鼠模型，观察EQ75-ADR的抑瘤作用，比较EQ75-ADR和ADR对C57BL/6J的副作用。结果： EQ75-ADR对 A431细胞有明显的细胞毒作用，体外作用48h，EQ75-ADR对A431细胞的杀伤分别是EQ75，ADR和EQ75与ADR混合物(EQ75+ADR)的50倍，14倍和10倍，而EQ75-ADR对Wish细胞的杀伤只有ADR和EQ75+ADR的1/10，对Wish细胞的杀伤只有对A431细胞的1/300，2 h作用得到类似结果。EQ75-ADR显著抑制裸鼠体内肿瘤的生长，抑制率高达92.2% (P<0.01)，对C57BL/6J小鼠的副作用明显低ADR。结论： EQ75-ADR具有选择性杀伤作用，在体外和体内对表皮癌均有显著抑制作用，副作用小，在肿瘤生物治疗中具有潜在的应用价值。
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《中国图书资料分类法》分类号 R979.1； R392.1
Preparation of Anti-EGFR Monoclonal Antibody Immunoconjugate (EQ75-ADR) and It's Inhibitory Effect on Human Epidermoid Carcinoma
He Ying Zhang Shangquan Zhao Feng Wu Zhenghua Wang Yaofa Yan Yuanchang
(Shanghai Institute of Cell Biology，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200031)
Abstract Objective: To prepare an immunoconjugate of anti-EGFR monoclonal antibody (EQ75) and adriamycin (ADR) and to investigute it's inhibitory effect on human epidermoid carcinoma (A431) in vitro and in vivo and it's side effect on C57BL/6J mice. Methods: The immunoconjugate (EQ75-ADR) was prepared with an improved glutaraldehyde conjugate method and the cytotoxicity effects of EQ75-ADR on A431 cells and Wish cells were measured by MTT assay. A431 tumor-bearing nude mice and C57BL/6J experimental model were established and were used for testing the inhibitory effects of EQ75-ADR. The side effect of EQ75-ADR was compared with ADR. Results: The EQ75-ADR showed specific cytotoxicity on A431cells, the cytotoxicity of EQ75-ADR was 50-fold, 14-fold and 10-fold more efficient than that of EQ75, ADR and mixture of EQ75 and ADR (EQ75+ADR) respectively. The effect of EQ75-ADR on with cells was 10-fold less efficient than that of ADR and EQ75+ADR. As compared with the cytoxicity effect of EQ75-ADR on Wish cells with A431 cells, it showed 300-fold less efficient. Similar cytotoxicity results were shown in 2 h treatment experimental group. The EQ75-ADR exhibited significant anti-tumor activity on tumor-bearing nude mice, and the inhibition rate is 92.2% (P<0.01). As compared with ADR, it's side effect was much lower. Conclusion: The EQ75-ADR exhibited targeted delivery and striking anti-tumor activity in vitro and in vivo and this approach appears a promising future for clinic purpose.
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Key words anti-tumor; immunoconjugate; epidermal growth factor receptor(EGFR)
蒽环类药物阿霉素(adriamycin，ADR)是目前普遍使用的抗癌化疗药物之一。但由于阿霉素的非特异性细胞毒性，在用于治疗肿瘤的同时，常常对正常组织，器官也造成严重的毒副作用，使它在临床上的应用受到了限制。研究表明，抗体导向治疗能有效地减少药物对正常组织的毒副作用，增加肿瘤细胞的药物摄入量而提高治疗指数，已成为癌症生物治疗的重要研究方向之一[1]。近年来，随着肿瘤分子生物学的发展，国内外研究者发现，表皮癌,膀胱癌，乳腺癌和胶质癌等多种肿瘤细胞表面过度表达表皮生长因子受体(EGFR)[2]，而且由于EGFR的结构并不随细胞的分裂增殖而改变，所以不存在异质性(heterogeneity)，使抗EGFR单抗具有广谱抗肿瘤作用，避免了单一的肿瘤特异性单抗的局限性，因而是抗肿瘤导向治疗的理想药物载体。
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本实验以抗表皮生长因子受体单抗EQ75为载体(本实验室制惫，鉴定[3])，采用改进后的戊二醛方法将阿霉素(ADR)与单抗(EQ75)偶联，制备抗体偶联物(EQ75-ADR)，研究其对表面过度表达EGFR的人表皮癌细胞A431的体外细胞毒作用和对荷人表皮癌裸鼠治疗作用，比较偶联物与阿霉素对C57BL/6J的副作用，为导向药物应用于临床提供实验依据和理论基础。
1 材料与方法
1.1 动物
实验BALB/c裸小鼠, 雄性， 5～6周, C57BL/6J小鼠,雄性，6～7周,由中国科学院上海细胞生物学研究所实验动物中心提供。
1.2 细胞和抗体
人表皮癌细胞(A431)，人羊膜细胞(Wish)，由中科院上海细胞生物学研究所提供。
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抗EGFR抗体EQ75,由本实验室制备，常规导引小鼠腹水的方法大量扩增，用快速蛋白液相色谱系统(FPLC) 经Sepharose Protein G亲和层析柱纯化，PD-10柱脱盐，经 SDS-PAGE电泳鉴定(图略)。浓缩抗体浓度为3～5 mg/ml，低温保存备用。
1.3 偶联物EQ75-ADR的制备和纯化[4]
EQ75单抗(3～5 mg)，室温下用二硫苏糖醇(DTT, 25 mmol/L)还原，30 min后过PD-10柱(Pharmacia)除去未反应的DTT，收集还原后的抗体部分；阿霉素室温下与新配的戊二醛反应(分子比1∶1),然后与还原的抗体反应(抗体与阿霉素的分子比为1∶25),反应混合物在摇床上反应1 h后，过PD-10柱，除去未反应的游离的阿霉素部分；抗体与阿霉素的分子比通过分别测量偶联物在280 nm和495 nm的吸光度计算，(波长495 nm时，阿霉素的消光系数为196)。
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1.4 抗体和偶联物免疫活性的鉴定
4℃条件下，A431细胞( 1×106)与100 μl不同浓度(10倍稀释)的抗体或偶联物反应,加入兔抗鼠IgG1-FITC,反应1 h,用流式细胞仪 FACScan(Becton Dicknson)进行定量荧光分析，以非特异性抗体肺癌单抗7D为阴性对照,用所有细胞的平均荧光强度值表示抗体及偶联物与靶细胞的结合力大小。
1.5 体外细胞毒作用实验(MTT比色法测定)
1.5.1 长时细胞毒作用
人表皮癌细胞A431细胞,加入96孔培养板中(2.5×104/孔)，培养过夜，使细胞贴壁，将细胞分为4组，分别加入不同稀释度(5倍稀释)的单抗，偶联物，阿霉素，及单抗阿霉素混合物(每组药物浓度与偶联物中抗体和阿霉素浓度平行), 每个浓度设3个平行孔；对照孔为RPMI 1640培液，继续培养48 h后，加入噻唑蓝MTT 25 μl/孔(5 mg/ml，Sigma公司)，于 37℃，5%CO2温箱中培养4～6 h，2 000 r/min离心，弃上清，加入二甲亚砜(DMSO) 150 μl/孔，计算各组药物对细胞生长的抑制率：
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同法测定4组药对人羊膜细胞Wish的生长的抑制率。
1.5.2 短时细胞毒实验
A431细胞和Wish细胞分别与上述4组药物作用2 h，吸去作用药物，用RPMI培液洗3次，然后加入培液继续培养46 h，同法计算药物的抑制率。
1.6 偶联物对荷人表皮癌裸鼠的治疗作用
体外培养人表皮癌细胞A431，制成细胞悬液(2×106细胞/ml)，接种于裸鼠右腋皮下，100 μl/只，接种后10 d，当皮下肿瘤可触及，肿瘤平均直径为3～4 mm 左右时,随机分为4个实验组(单抗，偶联物，阿霉素和PBS组)进行实验，每组5只荷瘤裸鼠，腹腔注射治疗药物，抗体50 μg/g体重，阿霉素1.5 μg/g体重，偶联物(含抗体50 μg，阿霉素1.5 μg/g体重)，隔天注射1次，共10次，对照组注射PBS 1 ml/只，用游标卡尺测量肿瘤长径a(mm)，及相垂直的短径b(mm)，并用公式V(mm3)=(a×b2)×1/2计算体积,治疗结束后处死裸鼠剥离肿瘤称重并进行比较，抑制率(%)=(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。
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1.7 偶联物及游离药物对C57BL/6J荷瘤小鼠的副作用比较
同法建立荷人表皮癌C57BL/6J小鼠模型，随机分为4个实验组，抗体组，偶联物组，阿霉素组和对照组，每组5只荷瘤小鼠，咀部注射抗体(25 μg/g体重)，偶联物(含抗体25 μg/g体重，阿霉素0.75 μg/g体重), 阿霉素 (0.75 μg/g体重)和PBS(0.5 ml/只),隔天注射1次，共注射10次，比较偶联物和阿霉素对C57BL/6J荷瘤小鼠的副作用。
2 结 果
2.1 偶联物EQ75-ADR的制备及稳定性
制备的偶联物，经PD-10柱分离收集(1 ml/管)，其洗脱液经紫外检测，在波长280 nm和495 nm时出现的第一个峰即为偶联物EQ75-ADR，见图1。偶联物中抗体与药物分子比为1∶8～1∶10，聚合物<5%，偶联物得率高达到80%～90%，偶联物除菌后在4℃冰箱内放置1个月以上无沉淀可见，经电泳鉴定无降解，FACScan鉴定仍有高的细胞结合活性，说明偶联物性质稳定。
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图1 用PD-10柱分离反应混合物
Fig. 1 Separation of free ADR from EQ75-ADR,gel filtration on PD-10 column
2.2 抗体和偶联物免疫活性鉴定
流式细胞仪定量免疫荧光分析结果表明，在体外，单抗和偶联物与靶细胞A431特异结合，见图2，在相同浓度下，与未偶联的抗体相比偶联物与靶细胞的结合力只降低5%～10%，保留了抗体的绝大部分活性(90%)，非特异肺癌单抗7D与A431细胞不结合，荧光强度仅为3.45%。
2.3 偶联物体外细胞毒作用
各组药物体外48 h和2 h细胞毒作用的半数抑制浓度，作用48 h，偶联物对A431的杀伤明显强于其它3组作用药物，比单抗强50倍，阿霉素强14倍，单抗阿霉素混合物强10倍(见图3A)，而对非靶细胞Wish，偶联物的杀伤力明显降低，只有阿霉素的1/10，偶联物对Wish 细胞的杀伤只有对A431细胞的1/300，(见图3B)，偶联物表现出明显的选择性细胞毒性。单抗阿霉素混合物的细胞毒性与游离阿霉素相似，对靶细胞和非靶细胞既无选择性杀伤作用，也无协同作用，与偶联物的选择性细胞毒作用明显不同，抗体EQ75对靶细胞生长也表现出一定的抑制作用，但其效果远远低于偶联物。2 h细胞毒作用与48 h细胞毒作用结果相似。(见图4A，B)，偶联物对靶细胞A431的杀伤是阿霉素的26倍，单抗阿霉素混合物的9倍，对非靶细胞Wish生长抑制率在25%以下,说明偶联物作用2 h对正常细胞的生长几乎没有影响。
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图2 间接免疫荧光法检测抗体和偶联物
与A431的结合力曲线
Fig. 2 Antigen binding of the EQ75 and EQ75-ADR
determined by indirect immunofluorescence
2.4 偶联物对荷人表皮癌裸鼠的抑瘤作用
腹腔注射单抗，偶联物和游离药对各组裸鼠进行等剂量治疗，隔天1次，连续用药10次。偶联物治疗1周，裸鼠皮下肿瘤没有继续增大，从第2周开始肿瘤有减小趋势，其中1只裸鼠在治疗结束时皮下肿瘤完全消退，偶联物对荷人表皮癌裸鼠有明显抑瘤作用，抑制率达到92.2% (P<0.01)，抗体和游离阿霉素对裸鼠皮下肿瘤的生长有一定的控制作用，但并不能完全抑制肿瘤持续增长，抑制率分别为76.0%和66.8%。对照组裸鼠皮下肿瘤持续增长，裸鼠体重减轻,其中的1只裸鼠因肿瘤过大而死亡，当对照组裸鼠皮下肿瘤体积达到3 000 mm3时，结束治疗,剥离各组裸鼠皮下肿瘤称重，对照组、EQ75组、ADR组、EQ75-ADR偶联组，分别为2.231±0.895(g)，0.738±0.136 (g), 0.530±0.121 (g),0.173±0.167 (g)。
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2.5 化疗药阿霉素和偶联物的副作用比较
单独用阿霉素局部治疗C57BL/6J小鼠，连接注射药物3次，小鼠开始出现局部脱毛症状，继续注射药物，小鼠的上肢肿胀变形，脱毛加重，健康状况下降，体重减轻。偶联物对C57BL/6J小鼠的治疗中虽然也有局部脱毛的症状，但其程度要轻得多，并且在停止用药的一周后完全恢复。偶联物EQ75-ADR对C57BL/6J小鼠皮下表皮瘤显示良好的治疗效果，毒副作用远远低于阿霉素。
图3 抗体、阿霉素、偶联物及单抗阿霉素混合物对A431和Wish的48 h细胞毒作用
Fig. 3 48 h cytotoxicity of EQ75，ADR，EQ75-ADR and EQ75+ADR onA431 and Wish tested by MTT
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A： Sensitive cell A431； B： Insensitive cell Wish
图4 抗体、阿霉素、偶联物及单抗阿霉素混合物对A431和Wish的2 h细胞毒作用
Fig. 4 2 h cytotoxicity of EQ75，ADR，EQ75-ADR and EQ75+ADR on A431 and Wish tested by MTT
A： Sensitive cell A431； B： Insensitive cell Wish
3 讨 论
用于偶联单抗和抗肿瘤药物的方法很多[5],本文用改进的戊二醛偶联法制备抗肿瘤导向药物EQ75-ADR，通过对抗体的处理及反应条件的控制，每个抗体分子上偶联8～10个阿霉素分子，比传统的戊二醛偶联方法偶联的药物分子数有所提高，蛋白质和药物分子之间的聚合作用明显降低，基本上无聚合物存在，偶联物与靶细胞A431结合的免疫活性保留90%以上，偶联物得率达80%～90%，是目前较为理想的偶联方法之一。戊二醛偶联方法与其他偶联方法相比，有效率高，操作简单的优点，比较适合临床使用时的大量制备。
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上海市科委科技发展基金(954119028)资助
何颖,女,24岁,硕士,主要从事肿瘤导向治疗的研究
参 考 文 献
1，Mehren MV， Weiner LM. Monoclonal antibody based therapy. Curr Opin Oncol， 1996， 8： 493
2，Harris AL. Epidermal growth factor receptor expression in human primary cancera. Cancer Res， 1990， 31： 458
3，张尚权， 严缘昌， 何 颖， 等. 抗皂角毒，表皮生长因子受体双功能抗体的制备与体外效应的研究. 中国免疫学杂志， 1999， 15： 168
4，Sivam GP， Martin PJ， Resfeld RA， et al. Therapeutic efficacy of a doxorobicin immunoconjugate in a precinical model of spontaneous metastatic human melanoma. Cancer Res， 1995， 55： 2352
5，何 颖， 张尚权， 严缘昌， 等. 单抗与细胞毒药物化学交联概况. 中国新药杂志， 1998， 7(6)： 423
(1999-05-27收稿； 1999-10-03修回), http://www.100md.com