pPIC3.5-HPV16L1重组质粒在酵母菌中表达L1蛋白的初步结果
作者：谷鸿喜 李秀荣 黄建林 曲章义 张凤民 程志
单位：哈尔滨医科大学微生物学教研室
关键词：
中华微生物学和免疫学杂志000316 人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)能引起人类多种良性皮肤和粘膜乳头状瘤或疣，且许多型别可导致癌变。诸多研究表明，HPV16型与宫颈癌等癌症发生密切相关，所以预防HPV感染对防止宫颈癌的发生具有重大意义。
HPV基因功能区包括早期区(E区)、晚期区(L区)和长调控区(LCR)。E区与病毒转化细胞有关，L区包括L1和L2，L1基因编码病毒主要衣壳蛋白，表达蛋白能刺激机体产生保护性抗体，为此L1基因是制备基因工程疫苗的理想基因。为获得HPV16L1蛋白，构建了pPIC3.5-HPV16L1重组质粒并在GS115酵母菌中进行诱导表达，现将构建及诱导表达鉴定结果简报如下。
本室构建的pCR2.1-HPV16L1重组质粒经BglⅡ linker化后，用BglⅡ和SpeⅠ酶切，回收1.8kb DNA(L1)片段，与pPIC3.5表达质粒重组，构建了pPIC3.5-HPV16L1重组质粒。经酶切电泳确认后，将该重组质粒转化GS115酵母菌中。经MM和MD平板筛选阳性重组菌株，用0.5%甲醇诱导连续振荡培养6d，每天取1ml菌液冻存细胞。将冻存细胞反复冻融、玻璃珠破碎后，取裂解上清进行SDS-PAGE，观察蛋白表达量及相对分子质量；采用HPV16L1单克隆抗体进行Western blot印迹电泳检测L1蛋白的特异性；将诱导培养3d的阳性表达菌细胞经常规处理进行透射电镜观察类病毒颗粒(VLP)形成。
图1 GS115菌中HPV16L1 VLPs电镜观察(×30000) 结果表明，构建的pPIC3.5-HPV16L1重组质粒转化GS115酵母菌后，经甲醇诱导有蛋白表达。所表达的蛋白经SDS-PAGE电泳证明相对分子质量为55×103，与预计L1蛋白分子量相符；不同诱导时间L1蛋白表达量不同，诱导72h后表达蛋白量最多；Western blot印迹电泳证实，阳性表达菌株所表达的蛋白能与鼠抗HPV16L1单克隆抗体发生特异反应，在相对分子质量为55×103处出现一条特异反应带；阳性菌株电镜下可见直径约50nm、散在的类病毒颗粒(见图1)，是表达蛋白自我组装的空壳蛋白，即VLP。
基金项目：黑龙江省科委重点攻关项目(G98-C0803)
(收稿日期：2000-01-17), http://www.100md.com
单位：哈尔滨医科大学微生物学教研室
关键词：
中华微生物学和免疫学杂志000316 人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)能引起人类多种良性皮肤和粘膜乳头状瘤或疣，且许多型别可导致癌变。诸多研究表明，HPV16型与宫颈癌等癌症发生密切相关，所以预防HPV感染对防止宫颈癌的发生具有重大意义。
HPV基因功能区包括早期区(E区)、晚期区(L区)和长调控区(LCR)。E区与病毒转化细胞有关，L区包括L1和L2，L1基因编码病毒主要衣壳蛋白，表达蛋白能刺激机体产生保护性抗体，为此L1基因是制备基因工程疫苗的理想基因。为获得HPV16L1蛋白，构建了pPIC3.5-HPV16L1重组质粒并在GS115酵母菌中进行诱导表达，现将构建及诱导表达鉴定结果简报如下。
本室构建的pCR2.1-HPV16L1重组质粒经BglⅡ linker化后，用BglⅡ和SpeⅠ酶切，回收1.8kb DNA(L1)片段，与pPIC3.5表达质粒重组，构建了pPIC3.5-HPV16L1重组质粒。经酶切电泳确认后，将该重组质粒转化GS115酵母菌中。经MM和MD平板筛选阳性重组菌株，用0.5%甲醇诱导连续振荡培养6d，每天取1ml菌液冻存细胞。将冻存细胞反复冻融、玻璃珠破碎后，取裂解上清进行SDS-PAGE，观察蛋白表达量及相对分子质量；采用HPV16L1单克隆抗体进行Western blot印迹电泳检测L1蛋白的特异性；将诱导培养3d的阳性表达菌细胞经常规处理进行透射电镜观察类病毒颗粒(VLP)形成。
图1 GS115菌中HPV16L1 VLPs电镜观察(×30000) 结果表明，构建的pPIC3.5-HPV16L1重组质粒转化GS115酵母菌后，经甲醇诱导有蛋白表达。所表达的蛋白经SDS-PAGE电泳证明相对分子质量为55×103，与预计L1蛋白分子量相符；不同诱导时间L1蛋白表达量不同，诱导72h后表达蛋白量最多；Western blot印迹电泳证实，阳性表达菌株所表达的蛋白能与鼠抗HPV16L1单克隆抗体发生特异反应，在相对分子质量为55×103处出现一条特异反应带；阳性菌株电镜下可见直径约50nm、散在的类病毒颗粒(见图1)，是表达蛋白自我组装的空壳蛋白，即VLP。
基金项目：黑龙江省科委重点攻关项目(G98-C0803)
(收稿日期：2000-01-17), http://www.100md.com