CCK-8抗TNF-α抑制离体兔肺动脉舒张反应性的机制*
作者：孟爱宏 王殿华 凌亦凌 谷振勇 李淑瑾
单位：河北医科大学基础医学院病理生理学教研室(石家庄050011)
关键词：缩胆囊素/投药和剂量；内毒素类/代谢；肺；兔
河北医科大学学报990314 中图号 R332.3
肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF) 是内毒素诱导肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH)的重要前炎症介质，给动物单独注入TNF-α也可引起于内毒素血症中所见到的PAH，但其机制尚未完全明了。作者已于整体实验证实了8肽胆囊收缩素(cholecystokinin-octapeptide，CCK- 8)具有明显的抗内毒素所致PAH及肺组织损伤的作用。而CCK-8对TNF-α诱导兔肺动脉反应性的变化有何作用尚未见报道。本实验在离体兔肺动脉环水平，探讨了CCK-8对TNF-α诱导肺动脉反应性变化之作用及其可能机制。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
实验所用TNF-α、CCK-8、乙酰胆碱(ACh)、iNOS抑制剂氨基胍(AG)、环氧酶抑制剂消炎痛、血管收缩剂新福林(PE)均为Sigma公司产品。NOS底物L-精氨酸(L-Arg)由中国科学院微生物研究室提供。
制备离体兔肺动脉环，将血管环按以下分组置于RPMI-1640培养液中,在CO2培养箱内37 ℃孵育7 h。然后将孵育后的血管环分别悬挂于盛有Krebs- Ringer-Bicarbonate(KRB)液的浴槽中(含消炎痛以排除环氧酶产物作用)，通过张力传感器连接记录仪记录舒缩张力变化。实验分组:①对照组(n=14);② TNF-α组(n=14);③ TNF-α+CCK-8组(n=12);④CCK-8组(n= 6) 。 TNF- α终浓度为4000 u/ml，CCK-8为0.05μg/ml。观察:①血管环对PE(10-8～10-5 mol/L) 累积浓度收缩反应和10-6 mol/L PE预收缩后对Ach(10-8～10-5 mol/L)舒张反应;②2×10-3 mol/L L-Arg预孵育15 min各组血管环对PE、ACh的反应性 ; ③ 10-4 mol/L AG预孵育15 min各组血管环对PE、Ach的反应性。数据用均数±标准误(
±
)表示，血管收缩性以干重克.张力/毫克(g.tension/mg)表示，舒张作用以舒张值占收缩值的舒张百分比表示。
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2 结 果
2.1 TNF-α对兔肺动脉反应性的作用
TNF-α组与对照组比较，不同浓度PE收缩值无显著性差异(P>0.05)，10-6、10-5 mol/L ACh舒张百分比显著降低(53.77±2.84) % vs(78.99±3.23) %、(38.96±2.65) % vs (71.12±6.16) %，P值均<0.001。
2.2 CCK-8对TNF-α抑制肺动脉舒张反应性的影响
TNF-α+CCK-8组不同浓度PE收缩值与TNF-α组比较均无显著性差异(P>0.05)，而前者的10-7～10-5 mol/L ACh舒张百分比均高于TNF-α组，其中10-6 mol/L ACh舒张百分比明显高于TNF-α组(73.15±1.70) % vs(53.77±2.84) %，P<0.05。CCK-8组10-8～10-5 mol/L PE收缩值和ACh 舒张百分比与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。
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2.3 NO对CCK-8抗TNF-α抑制肺动脉舒张反应性的影响
L-Arg预孵育15 min后，TNF-α组比孵育前PE收缩值显著降低(P<0.05)，舒张百分比显著增加(71.83±2.74) % vs (61.56±2.95) %，P<0.01，余各组舒缩均无明显改变。AG预孵育15 min后,对照组和TNF-α组比孵育前PE收缩值显著增加(P<0.05),TNF-α+CCK-8及CCK-8组无显著性差异。在AG孵育后各组舒张百分比均无明显改变。结果表明NOS底物可减轻TNF- α的抑制内皮依赖性舒张反应，而不影响对照组、TNF-α+CCK-8组和CCK-8组的内皮依赖性舒张反应。
3 讨 论
本实验发现一定质量浓度的TNF-α(4000 u/ml)可抑制兔肺动脉血管内皮依赖性舒张作用,一定质量浓度的CCK-8显著逆转TNF-α的抑制内皮依赖性舒张反应。给予NOS底物L-Arg可减轻TNF-α的这种抑制作用，表明TNF-α的作用与肺动脉血管内皮受损使NO合成减少有关，说明在内皮受损时L-Arg缺乏从而限制了NO 的生成，而正常内皮L-Arg充足，因此给予L-Arg对NO生成影响不大。iNOS抑制剂对CCK的作用无显著影响，说明CCK可能通过一定途径减少TNF-α诱生的iNOS, 从而减轻iNOS对cNOS的抑制作用。有研究表明TNF-α抑制血管内皮细胞cNOS基因表达，增加cNOSmRNA降解;NO是由底物L-Arg在固有型NO合酶(cNOS)和诱生型NO合酶(iNOS)作用下生成的;cNOS主要存在于血管内皮细胞，生成小量NO,对维持正常血管紧张性起重要作用;iNOS主要存在于平滑肌细胞，在TNF- α等刺激后生成大量NO,可能对cNOS有抑制作用。本实验用L-Arg孵育后TNF-α+CCK-8 组血管内皮依赖性舒张反应无明显改变，提示CCK-8 可能通过保护肺动脉血管内皮cNOS，从而对抗TNF-α使内皮NO合成减少的作用。应用iNOS抑制剂AG孵育后TNF-α+CCK-8及CCK-8组肺动脉收缩值无显著增强，提示CCK-8可能减少iNOS的产生。因而，CCK-8可能通过保护肺动脉血管内皮cNOS,及减少iNOS对cNOS的抑制作用,从而逆转TNF-α的抑制内皮依赖性舒张反应而发挥抗PAH的保护作用，但确切机制有待进一步探讨。
* 国家自然科学基金资助课题(No.39570304)
(1999-02-05 收稿), 百拇医药
单位：河北医科大学基础医学院病理生理学教研室(石家庄050011)
关键词：缩胆囊素/投药和剂量；内毒素类/代谢；肺；兔
河北医科大学学报990314 中图号 R332.3
肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF) 是内毒素诱导肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH)的重要前炎症介质，给动物单独注入TNF-α也可引起于内毒素血症中所见到的PAH，但其机制尚未完全明了。作者已于整体实验证实了8肽胆囊收缩素(cholecystokinin-octapeptide，CCK- 8)具有明显的抗内毒素所致PAH及肺组织损伤的作用。而CCK-8对TNF-α诱导兔肺动脉反应性的变化有何作用尚未见报道。本实验在离体兔肺动脉环水平，探讨了CCK-8对TNF-α诱导肺动脉反应性变化之作用及其可能机制。
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1 材料和方法
实验所用TNF-α、CCK-8、乙酰胆碱(ACh)、iNOS抑制剂氨基胍(AG)、环氧酶抑制剂消炎痛、血管收缩剂新福林(PE)均为Sigma公司产品。NOS底物L-精氨酸(L-Arg)由中国科学院微生物研究室提供。
制备离体兔肺动脉环，将血管环按以下分组置于RPMI-1640培养液中,在CO2培养箱内37 ℃孵育7 h。然后将孵育后的血管环分别悬挂于盛有Krebs- Ringer-Bicarbonate(KRB)液的浴槽中(含消炎痛以排除环氧酶产物作用)，通过张力传感器连接记录仪记录舒缩张力变化。实验分组:①对照组(n=14);② TNF-α组(n=14);③ TNF-α+CCK-8组(n=12);④CCK-8组(n= 6) 。 TNF- α终浓度为4000 u/ml，CCK-8为0.05μg/ml。观察:①血管环对PE(10-8～10-5 mol/L) 累积浓度收缩反应和10-6 mol/L PE预收缩后对Ach(10-8～10-5 mol/L)舒张反应;②2×10-3 mol/L L-Arg预孵育15 min各组血管环对PE、ACh的反应性 ; ③ 10-4 mol/L AG预孵育15 min各组血管环对PE、Ach的反应性。数据用均数±标准误(
±)表示，血管收缩性以干重克.张力/毫克(g.tension/mg)表示，舒张作用以舒张值占收缩值的舒张百分比表示。, 百拇医药
2 结 果
2.1 TNF-α对兔肺动脉反应性的作用
TNF-α组与对照组比较，不同浓度PE收缩值无显著性差异(P>0.05)，10-6、10-5 mol/L ACh舒张百分比显著降低(53.77±2.84) % vs(78.99±3.23) %、(38.96±2.65) % vs (71.12±6.16) %，P值均<0.001。
2.2 CCK-8对TNF-α抑制肺动脉舒张反应性的影响
TNF-α+CCK-8组不同浓度PE收缩值与TNF-α组比较均无显著性差异(P>0.05)，而前者的10-7～10-5 mol/L ACh舒张百分比均高于TNF-α组，其中10-6 mol/L ACh舒张百分比明显高于TNF-α组(73.15±1.70) % vs(53.77±2.84) %，P<0.05。CCK-8组10-8～10-5 mol/L PE收缩值和ACh 舒张百分比与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。
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2.3 NO对CCK-8抗TNF-α抑制肺动脉舒张反应性的影响
L-Arg预孵育15 min后，TNF-α组比孵育前PE收缩值显著降低(P<0.05)，舒张百分比显著增加(71.83±2.74) % vs (61.56±2.95) %，P<0.01，余各组舒缩均无明显改变。AG预孵育15 min后,对照组和TNF-α组比孵育前PE收缩值显著增加(P<0.05),TNF-α+CCK-8及CCK-8组无显著性差异。在AG孵育后各组舒张百分比均无明显改变。结果表明NOS底物可减轻TNF- α的抑制内皮依赖性舒张反应，而不影响对照组、TNF-α+CCK-8组和CCK-8组的内皮依赖性舒张反应。
3 讨 论
本实验发现一定质量浓度的TNF-α(4000 u/ml)可抑制兔肺动脉血管内皮依赖性舒张作用,一定质量浓度的CCK-8显著逆转TNF-α的抑制内皮依赖性舒张反应。给予NOS底物L-Arg可减轻TNF-α的这种抑制作用，表明TNF-α的作用与肺动脉血管内皮受损使NO合成减少有关，说明在内皮受损时L-Arg缺乏从而限制了NO 的生成，而正常内皮L-Arg充足，因此给予L-Arg对NO生成影响不大。iNOS抑制剂对CCK的作用无显著影响，说明CCK可能通过一定途径减少TNF-α诱生的iNOS, 从而减轻iNOS对cNOS的抑制作用。有研究表明TNF-α抑制血管内皮细胞cNOS基因表达，增加cNOSmRNA降解;NO是由底物L-Arg在固有型NO合酶(cNOS)和诱生型NO合酶(iNOS)作用下生成的;cNOS主要存在于血管内皮细胞，生成小量NO,对维持正常血管紧张性起重要作用;iNOS主要存在于平滑肌细胞，在TNF- α等刺激后生成大量NO,可能对cNOS有抑制作用。本实验用L-Arg孵育后TNF-α+CCK-8 组血管内皮依赖性舒张反应无明显改变，提示CCK-8 可能通过保护肺动脉血管内皮cNOS，从而对抗TNF-α使内皮NO合成减少的作用。应用iNOS抑制剂AG孵育后TNF-α+CCK-8及CCK-8组肺动脉收缩值无显著增强，提示CCK-8可能减少iNOS的产生。因而，CCK-8可能通过保护肺动脉血管内皮cNOS,及减少iNOS对cNOS的抑制作用,从而逆转TNF-α的抑制内皮依赖性舒张反应而发挥抗PAH的保护作用，但确切机制有待进一步探讨。
* 国家自然科学基金资助课题(No.39570304)
(1999-02-05 收稿), 百拇医药