阿法骨化醇对去卵巢大鼠骨质疏松症防治作用的实验研究
作者：夏维波 孟迅吾 邢小平 周学瀛 胡莹莹 Victor Shen DD WU
单位：夏维波 孟迅吾 邢小平 周学赢(100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院内分泌科)；Victor Shen DD WU(Colombia University Helen Hayes Hospital Regional Bone Center USA)
关键词：骨质疏松；骨化醇类
中华医学杂志000923 【摘要】 目的 探讨从骨量、骨结构、骨力学和骨转换等方面研究阿法骨化醇对去卵巢大鼠骨质疏松症的防治作用。方法 53只健康雌性未交配6个月龄Wistar大鼠分为6组(1)基线组(Base)6个月龄时处死；(2)假手术组(Sham)；(3)去卵巢(OVX)治疗前对照组(OVXb)；(4)OVX治疗末对照组(OVXe)；(5)OVX后雌激素治疗组(O+E)；(6)OVX后阿法骨化醇治疗组(O+VD)OVX后6周开始经胃肠给予阿法骨化醇每天0.1 μg/kg，共8周。动物处死前留取24 h尿标本，处死时留取右侧胫骨、股骨和血标本。进行骨组织计量学动态和静态指标分析，计算机断层扫描(pQCT)检查，股骨远端凹入实验和血尿骨转换指标测定。结果 O+VD的骨小梁面积较未治疗组增加l06.7% (12.0%±1.1% 比 5.8%±1.3%，P<0.01)。pQCT检查表明，O+VD的股骨远端松质骨骨量和骨密度分别较OVXe增加109.2%和133.1%,P均<0.01。O+VD组的股骨远端松质骨的最大载荷较OVXe增加170.8% (2l.3%±4.0% 比 7.9%±1.9% P<0.05)。O+VD的尿脱氧吡啶啉较OVXe显著下降(降低58.9%，P<0.0l)。结论 阿法骨化醇能使OVX骨质疏松症大鼠的骨量增加，骨小梁的结构改善，同时使松质骨的力学特性得以改善，能有效地治疗OVX大鼠的骨质疏松症。
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Effects of alfacalcidol on osteoporosis in ovariectomized rats
XIA Weibo
(Department of Endocrinology, Peking Union Medical College Hospital, PUMC & CAMS, Beijing,100730, China)
MENG Xunwu
(Department of Endocrinology, Peking Union Medical College Hospital, PUMC & CAMS, Beijing,100730, China)
XING Xiaoping, et al.
, 百拇医药
(Department of Endocrinology, Peking Union Medical College Hospital, PUMC & CAMS, Beijing,100730, China)
【Abstract】 Objective To investigate the effects of alfacalcidol on osteoporosis in rats induced by ovariectomy (OVX). Methods Fifty-three virgin female Wistar rats of six months old were divided into 6 groups: (1) rats in baseline group (base) were sacrificed what 6 months before OVX, and those in the other 5 groups were either bilaterally OVX or sham-operated (sham) as follows: (2) Sham; (3) OVX baseline (OVXb); (4) OVX end (OVXe); (5) OVX+17β-estradiol 20 μg/kg*d-1 SC. (O+E); and (6) OVX+alfacalcidol 0.1 μg/kg*d-1 oral (O+VD). Rats in OVXb group were sacrificed 6 weeks after OVX and the others were sacrificed 14 weeks after surgery. Alfacalcidol (TEVA, Israel) was fed orally at 6 weeks after OVX and lasted for 8 weeks. Urine and serum samples were collected before sacrifice to determine the bone turnover markers. The right tibia was processed undecalcified for histomorphometric analysis, and the right femur was prepared for pQCT scanning and bone biomechanical measurement with indentation test. Results Treatment of OVX rats with alfacalcidol (O+VD) increased tibial cancellous bone volume in histomorphometric analysis (12.0%±1.1% vs 5.8%±1.3%, P<0.01). pQCT scanning showed that trabecular BMC and BMD were sharply elevated in O+VD group compared with OVXe group, increased 109.2% and 133.1% respectively (P<0.01). In consistency with these changes in mechanical competency of cancellous bone in distal femur, maximal load was enhanced in O+VD group compared with OVXe group (21.3%±4.0%N vs 7.9%±1.9%N, P<0.05). All these changes in O+VD group were similar to those in 17β-estradiol treatment group (O+E). Serum calcium concentration increased in O+VD group. Histomorphometric and biochemical indices of bone resorption reduced in O+VD group. Conclusion Alfacalcidol effectively prevent bone loss in OVX rats and restore partly the trabecula, with evidenced increasing density, contents as well as maximal loads of cancellous bone, and reduce bone resorption.
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【Key words】 Osteoporosis； Ergocalciferols
绝经后骨质疏松症的发生可能与肠钙吸收减低有关[1]。1α羟维生素D3(阿法骨化醇)在体内经过25羟化酶转化为1,25(OH)2D3，能促进肠钙吸收。动物研究[2]表明,阿法骨化醇对骨组织也有较持久的作用，但出现高钙血症的可能较钙化三醇[1,25(OH)2D3]少。由于以上这些特点，1α羟维生素D3被推荐用于骨质疏松症的防治，但是既往的一些研究结果并不一致[3-6]。本研究通过骨量、骨结构、骨力学和骨转换等方面研究该药对去卵巢(OVX)大鼠骨质疏松症的防治作用。
材料与方法
1.实验动物模型及分组：选用4个月龄未交配健康雌性Wistar大鼠53只(军事医学科学院动物中心提供)适应性喂养8周，将6个月龄大鼠分为6组：(1)基线组(Base，8只)处死；(2)假手术组(Sham，8只)行OVX假手术，手术后第14周处死；(3)OVX治疗前对照组(OVXb，8只),OVX后6周处死；(4)OVX治疗末对照组(OVXe，8只)；(5)OVX后雌激素治疗组(O+E,9只)；(6)OVX后阿法骨化醇治疗组(O+VD,12只),后2组OVX后6周分别给予17β雌二醇每天20 μg/kg皮下注射(美国Sigma公司)和阿法骨化醇每天0.1 μg/kg胃肠道给药(以色列 TEVA公司)共8周。后3组大鼠于手术后14周处死。
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2.荧光标记及标本的收集：分别于动物处死前6 d和2 d，给予以Calcein (Sigma Chemical Co美国) 每次10 mg/kg腹腔内注射标记，以便骨计量学的动态指标的测定。于处死前收集24 h尿液和采血备用。处死后取右侧胫骨备做骨计量学研究，取右股骨供外周肢体定量计算机断层扫描(pQCT)检查和骨生物力学分析。
3.实验方法：(1)骨组织形态计量学分析：经固定，脱水和非脱钙塑料包埋后，分别切取5 μm切片作Von Kossa 和Goldner Trichrome染色，10 μm切片不染色供荧光分析。测量范围为近端胫骨生长板下1～4 mm内的次级松质骨，经与计算机相连摄像装置转化为数字化图像，采用Image 1.49，KSS Stereology analysis和KSS Stereology Image软件进行骨计量学静态和动态指标的测量和分析。直接和派生的指标均采用国际通用的标准骨组织形态计量学术语命名和计算[7]；(2)股骨外周定量CT骨密度测定：使用Stratec XCT 960 CAT扫描仪(Germany)在股骨远端6.5～7.5 mm处扫描1 mm厚。选用的测量指标有小梁骨矿含量(Trab.BMC)和小梁骨密度(Trab.BMD)；(3)股骨远端凹入实验生物力学测定[8]：用低速锯自股骨远端股骨髁处，截取4 mm厚的股骨，置于物质测试系统(Model 810,MTS Systems Corp, MN,USA)，记录载荷-位移曲线，计算开始最大载荷(Can.Load, N)和刚度(Can.Stiff, N/mm2)；(4)血尿骨转换生化指标的测定：尿脱氧吡啶啉/肌酐比率(UDpd/Cr)，采用酶联免疫分析法(ELISA)，药盒为Metra Biosystems, Inc产品，测量的批内和批间系数分别为1.1%和4.2%。血钙采用自动生化分析仪，在医院检验科同批完成测定。
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4.统计学方法：所有的测定指标的结果均采用均数加减标准误(
±s)来表示，组间比较采用单因素ANOVA分析，进行Fisher检验和t检验，以P<0.05表示具有统计学意义。
结果
1.骨组织形态计量学指标的变化：(1)胫骨近端次级骨小梁静态指标的变化：OVX后骨小梁面积比率(Cn-BV/TV)显著减少，经阿法骨化醇治疗后，O+VD比OVXe增加106.7%(P<0.01)，但仍显著低于Sham(P<0.01)。O+E的Cn-BV/TV比OVXe增加122.3%，而与O+VD之间差异无显著意义(P>0.05)。同时O+VD和O+E的松质骨的结构改善明显(表1，图1)。
表1 阿法骨化醇对胫骨近端次级骨小梁静态
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指标的影响(±s) 组别
鼠数
Cn-BV/TV
(%)
Tb.Th
(μm)
Tb.Sp
(μm)
Tb.N
(/mm2)
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Base
8
25.1±
2.2
53.5±
2.4
170±
21
4.70±
0.40
Sham
8
19.5±
, 百拇医药
1.5*
54.5±
2.4
236±
27
3.60±
0.30**
OVXb
8
10.5±
2.1**△△
43.4±
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4.1
467±
93*
2.30±
0.30**△△
OVXe
8
5.8±
1.3**△△▲
48.5±
5.8
1 121±
, 百拇医药
273**△△▲▲
1.20±
0.20**△△▲▲
O+E
9
12.9±
0.8**△△^^
55.6±
2.7
381±
21^^
2.30±
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0.10**△△
O+VD
12
12.0±
1.1*△△^^
58.3±
4.3
459±
50*^^
2.20±
0.20**△△^^
注：与Base比较*P<0.05，**P<0.01；与Sham比较△△P<0.01，▲P<0.05，与OVXb比较▲▲P<0.01，与OVXe比较^^P<0.01(表2～3同)。Base：基线组，Sham:假手术组，OVXb:OVX治疗前对照组，OVXe:OVX治疗后对照组，O+E:17β雌二醇治疗组，O+VD：阿法骨化醇治疗组(下同)；Cn-BV/TV：松质骨骨小梁面积，Tb.Th:骨小梁厚度，Tb.Sp:骨小梁分离度，Tb.N:骨小梁数目
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2.反映骨转换和骨矿化的计量学指标的变化：OVX后侵蚀(ES/BS)、类骨质周径(O.Pm)、荧光标记周径(MS/BS)和骨形成率(BFR/S)均显著增加，OVXb较OVXe更为显著。O+VD使以上骨转换和骨矿化指标降低，但不如O+E显著。O+VD和O+E均未使延迟时间(Mlt)发生显著改变(表2)。
3.股骨松质骨骨矿含量(Trab.BMC)和骨密度(Trab.BMD)的变化(pQCT)： O+VD和O+E的Trab.BMC较OVXe分别增加109.2%和69.5%(P<0.01和P<0.05)。OVXe 的Trab.BMD较Sham下降63.2%(P<0.01)，O+VD组和O+E的Trab.BMD较OVXe分别增加133.1%(P<0.01)和119.7%(P<0.01，表3)。
, 百拇医药
图1 大鼠右侧近端胫骨切片，可见A.(Base)和B.9
月龄(Sham)组次级骨小梁致密，结构完整；C.7月龄(OVXb)和D.9月龄(OVXe)组的骨小梁稀疏，尤其是OVXe更明显；E.9月龄(O+E)和F.9 月龄(O+VD)组的骨小梁数目比OVX组有显著增加，结构改善 Von Kossa染色 ×10
表2 阿法骨化醇对骨转换和骨矿化的动态指标的影响(±s) 组别
, 百拇医药
鼠数
ES/BS(%)
O.Pm(%)
MS/BS(%)
MAR(μm/d)
MLT(d)
BFRs
Base
8
2.3±0.4
6.5±1.1
22.8±3.3
, 百拇医药 1.40±0.10
3.2±0.3
31.2±3.6
Sham
8
2.4±0.4
5.4±0.9
20.7±4.0
1.20±0.10
3.8±0.5
22.6±3.7
OVXb
, 百拇医药
8
6.4±1.3**△△
11.7±1.5*△△
40.4±9.4**△△
1.70±0.10△
3.8±0.4
71.2±18.9**△△
OVXe
8
4.5±1.5*△▲
, 百拇医药
8.9±3.0△
29.5±5.2
1.50±0.10△
3.8±0.5
46.2±9.2△▲
O+E
9
2.0±0.3▲▲^
3.3±0.4▲▲^
13.8±1.6▲▲^
, 百拇医药 1.20±0.10▲
3.8±0.4
17.1±2.5▲▲^^
O+VD
12
3.1±0.3▲▲
7.1±1.5▲
19.9±3.2▲▲
1.50±0.10
3.3±0.5
30.9±6.5▲▲
, 百拇医药
注：与Sham比较△P<0.05，与OVX6比较▲P<0.05；与O+E比较^P<0.05。ES/BS：侵蚀周径比率，O.Pm：类骨质周径，MS/BS：标记表面比率，MAR：矿盐沉积率，MLT：矿化延迟时间，BFRs：骨形成率(表面) 4.股骨骨生物力学特性的改变：OVX后松质骨最大载荷(Can.load)显著下降。O+VD组和O+E组的Can.load比OVXe组分别增加170.8%和211.3%(P均<0.05)。O+VD组和O+E组的松质骨刚度(Can.stiff)比Ovxe组分别增加138.4%和202.9%(P均>0.05)。O+VD和O+E 2组之间差异无显著意义(表3)。
5.血钙(Ca)和尿脱氧吡啶啉(UDpd/Cr)的变化：阿法骨化醇治疗组的血Ca值显著高于OVXe(3.28 mmol/L±0.10 mmol/L 比2.72 mmol/L+0.04 mmol/L, P<0.05)。UDpd/Cr 在OVX后显著增加，OVXb和OVXe显著高于Sham(169 mmol/L±22 mmol/L, 131 mmol/L±14 mmol/L 比 56 mmol/L±8 mmol/L, P<0.01)。O+VD(54 mmol/L±7 mmol/L)和O+E组(60 mmol/L±9 mmol/L)较OVXe显著降低(P均<0.01)，而与Sham差异无显著意义。O+VD和O+E 2组之间差异无显著意义。
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表3 阿法骨化醇对股骨松质骨骨密度和骨生物力学
特性的影响(±s) 组别
鼠数
Trab.BMC
(mg/mm)
Trab.BMD
(mg/mm2)
Can.Load
(N)
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Can.Stiff
(N/mm)
Base
8
2.80±
0.40
349±
48
54.0±
10.7
767±
170
Sham
, 百拇医药
8
3.20±
0.50
320±
39
23.4±
3.2**
396±
72**
OVXb
8
1.40±
0.20**△△
, 百拇医药
136±
24**△△
13.2±
2.6**
236±
62**
OVXe
8
1.40±
0.40**△△
117±
30**△△
, 百拇医药
7.9±
1.9**△
144±
31**△
O+E
9
2.40±
0.20▲^
259±
17*▲▲^^
24.5±
5.6**^
, 百拇医药
436±
94*^
O+VD
12
3.00±
0.20▲▲^^
275±
16*▲▲^^
21.3±
4.0**^
343±
67**
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注：与O+E比较^P<0.05；Trab.BMC：小梁骨骨矿含量；Trab.BMD：小梁骨骨矿密度；Can.Load：松质骨最大载荷；Can.Stiff:松质骨刚度讨论
OVX大鼠被推荐作为研究绝经后骨质疏松症动物的模型，正如我们的结果所示，OVX后大鼠骨转换增加，胫骨近端次级骨小梁变薄，结构稀疏。经pQCT检查表明，股骨远端松质骨的骨量和骨密度均有显著减少。股骨远端最大载荷的强度也较对照组显著减低，OVX后14周比OVX后6周更明显。
骨计量学结果表明，经阿法骨化醇治疗后，次级骨小梁的面积(CnBV/TV)比未治疗组有显著增加，O+VD超过了治疗前的水平，骨小梁的厚度和数目增加。说明阿法骨化醇不仅有效地防止了OVX后大鼠小梁骨的进一步骨丢失，而且促使部分骨小梁得以重获。与以往的使用活性维生素D防治OVX大鼠骨量丢失的结果是一致的[9-11]，与O+E组比较可知，阿法骨化醇在改善骨小梁结构方面与17β雌二醇的作用相似。我们的结果表明，经阿法骨化醇干预后股骨远端松质骨骨量和骨密度均较非治疗组有明显增加，且超过了治疗前的水平。说明阿法骨化醇治疗后能有效地增加松质骨的骨量和骨密度。使骨质疏松症患者椎体和髋部骨密度增加[5]。此外，在本结果中未见到治疗后矿盐沉积率和矿化延迟时间的异常变化。有临床研究证明，阿法骨化醇治疗可以降低骨折的发生率[12]，说明该药有可能使骨骼的力学特性得到改善。本研究的股骨远端凹入实验结果表明，阿法骨化醇干预后松质骨的最大载荷显著增加。
, 百拇医药
基金项目：国家“九五”科技攻关基金资助项目(96-906-01-06)
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(收稿日期：1999-10-18), 百拇医药
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中华医学杂志000923 【摘要】 目的 探讨从骨量、骨结构、骨力学和骨转换等方面研究阿法骨化醇对去卵巢大鼠骨质疏松症的防治作用。方法 53只健康雌性未交配6个月龄Wistar大鼠分为6组(1)基线组(Base)6个月龄时处死；(2)假手术组(Sham)；(3)去卵巢(OVX)治疗前对照组(OVXb)；(4)OVX治疗末对照组(OVXe)；(5)OVX后雌激素治疗组(O+E)；(6)OVX后阿法骨化醇治疗组(O+VD)OVX后6周开始经胃肠给予阿法骨化醇每天0.1 μg/kg，共8周。动物处死前留取24 h尿标本，处死时留取右侧胫骨、股骨和血标本。进行骨组织计量学动态和静态指标分析，计算机断层扫描(pQCT)检查，股骨远端凹入实验和血尿骨转换指标测定。结果 O+VD的骨小梁面积较未治疗组增加l06.7% (12.0%±1.1% 比 5.8%±1.3%，P<0.01)。pQCT检查表明，O+VD的股骨远端松质骨骨量和骨密度分别较OVXe增加109.2%和133.1%,P均<0.01。O+VD组的股骨远端松质骨的最大载荷较OVXe增加170.8% (2l.3%±4.0% 比 7.9%±1.9% P<0.05)。O+VD的尿脱氧吡啶啉较OVXe显著下降(降低58.9%，P<0.0l)。结论 阿法骨化醇能使OVX骨质疏松症大鼠的骨量增加，骨小梁的结构改善，同时使松质骨的力学特性得以改善，能有效地治疗OVX大鼠的骨质疏松症。
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Effects of alfacalcidol on osteoporosis in ovariectomized rats
XIA Weibo
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【Abstract】 Objective To investigate the effects of alfacalcidol on osteoporosis in rats induced by ovariectomy (OVX). Methods Fifty-three virgin female Wistar rats of six months old were divided into 6 groups: (1) rats in baseline group (base) were sacrificed what 6 months before OVX, and those in the other 5 groups were either bilaterally OVX or sham-operated (sham) as follows: (2) Sham; (3) OVX baseline (OVXb); (4) OVX end (OVXe); (5) OVX+17β-estradiol 20 μg/kg*d-1 SC. (O+E); and (6) OVX+alfacalcidol 0.1 μg/kg*d-1 oral (O+VD). Rats in OVXb group were sacrificed 6 weeks after OVX and the others were sacrificed 14 weeks after surgery. Alfacalcidol (TEVA, Israel) was fed orally at 6 weeks after OVX and lasted for 8 weeks. Urine and serum samples were collected before sacrifice to determine the bone turnover markers. The right tibia was processed undecalcified for histomorphometric analysis, and the right femur was prepared for pQCT scanning and bone biomechanical measurement with indentation test. Results Treatment of OVX rats with alfacalcidol (O+VD) increased tibial cancellous bone volume in histomorphometric analysis (12.0%±1.1% vs 5.8%±1.3%, P<0.01). pQCT scanning showed that trabecular BMC and BMD were sharply elevated in O+VD group compared with OVXe group, increased 109.2% and 133.1% respectively (P<0.01). In consistency with these changes in mechanical competency of cancellous bone in distal femur, maximal load was enhanced in O+VD group compared with OVXe group (21.3%±4.0%N vs 7.9%±1.9%N, P<0.05). All these changes in O+VD group were similar to those in 17β-estradiol treatment group (O+E). Serum calcium concentration increased in O+VD group. Histomorphometric and biochemical indices of bone resorption reduced in O+VD group. Conclusion Alfacalcidol effectively prevent bone loss in OVX rats and restore partly the trabecula, with evidenced increasing density, contents as well as maximal loads of cancellous bone, and reduce bone resorption.
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【Key words】 Osteoporosis； Ergocalciferols
绝经后骨质疏松症的发生可能与肠钙吸收减低有关[1]。1α羟维生素D3(阿法骨化醇)在体内经过25羟化酶转化为1,25(OH)2D3，能促进肠钙吸收。动物研究[2]表明,阿法骨化醇对骨组织也有较持久的作用，但出现高钙血症的可能较钙化三醇[1,25(OH)2D3]少。由于以上这些特点，1α羟维生素D3被推荐用于骨质疏松症的防治，但是既往的一些研究结果并不一致[3-6]。本研究通过骨量、骨结构、骨力学和骨转换等方面研究该药对去卵巢(OVX)大鼠骨质疏松症的防治作用。
材料与方法
1.实验动物模型及分组：选用4个月龄未交配健康雌性Wistar大鼠53只(军事医学科学院动物中心提供)适应性喂养8周，将6个月龄大鼠分为6组：(1)基线组(Base，8只)处死；(2)假手术组(Sham，8只)行OVX假手术，手术后第14周处死；(3)OVX治疗前对照组(OVXb，8只),OVX后6周处死；(4)OVX治疗末对照组(OVXe，8只)；(5)OVX后雌激素治疗组(O+E,9只)；(6)OVX后阿法骨化醇治疗组(O+VD,12只),后2组OVX后6周分别给予17β雌二醇每天20 μg/kg皮下注射(美国Sigma公司)和阿法骨化醇每天0.1 μg/kg胃肠道给药(以色列 TEVA公司)共8周。后3组大鼠于手术后14周处死。
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2.荧光标记及标本的收集：分别于动物处死前6 d和2 d，给予以Calcein (Sigma Chemical Co美国) 每次10 mg/kg腹腔内注射标记，以便骨计量学的动态指标的测定。于处死前收集24 h尿液和采血备用。处死后取右侧胫骨备做骨计量学研究，取右股骨供外周肢体定量计算机断层扫描(pQCT)检查和骨生物力学分析。
3.实验方法：(1)骨组织形态计量学分析：经固定，脱水和非脱钙塑料包埋后，分别切取5 μm切片作Von Kossa 和Goldner Trichrome染色，10 μm切片不染色供荧光分析。测量范围为近端胫骨生长板下1～4 mm内的次级松质骨，经与计算机相连摄像装置转化为数字化图像，采用Image 1.49，KSS Stereology analysis和KSS Stereology Image软件进行骨计量学静态和动态指标的测量和分析。直接和派生的指标均采用国际通用的标准骨组织形态计量学术语命名和计算[7]；(2)股骨外周定量CT骨密度测定：使用Stratec XCT 960 CAT扫描仪(Germany)在股骨远端6.5～7.5 mm处扫描1 mm厚。选用的测量指标有小梁骨矿含量(Trab.BMC)和小梁骨密度(Trab.BMD)；(3)股骨远端凹入实验生物力学测定[8]：用低速锯自股骨远端股骨髁处，截取4 mm厚的股骨，置于物质测试系统(Model 810,MTS Systems Corp, MN,USA)，记录载荷-位移曲线，计算开始最大载荷(Can.Load, N)和刚度(Can.Stiff, N/mm2)；(4)血尿骨转换生化指标的测定：尿脱氧吡啶啉/肌酐比率(UDpd/Cr)，采用酶联免疫分析法(ELISA)，药盒为Metra Biosystems, Inc产品，测量的批内和批间系数分别为1.1%和4.2%。血钙采用自动生化分析仪，在医院检验科同批完成测定。
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4.统计学方法：所有的测定指标的结果均采用均数加减标准误(
±s)来表示，组间比较采用单因素ANOVA分析，进行Fisher检验和t检验，以P<0.05表示具有统计学意义。结果
1.骨组织形态计量学指标的变化：(1)胫骨近端次级骨小梁静态指标的变化：OVX后骨小梁面积比率(Cn-BV/TV)显著减少，经阿法骨化醇治疗后，O+VD比OVXe增加106.7%(P<0.01)，但仍显著低于Sham(P<0.01)。O+E的Cn-BV/TV比OVXe增加122.3%，而与O+VD之间差异无显著意义(P>0.05)。同时O+VD和O+E的松质骨的结构改善明显(表1，图1)。
表1 阿法骨化醇对胫骨近端次级骨小梁静态
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指标的影响(
±s) 组别鼠数
Cn-BV/TV
(%)
Tb.Th
(μm)
Tb.Sp
(μm)
Tb.N
(/mm2)
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Base
8
25.1±
2.2
53.5±
2.4
170±
21
4.70±
0.40
Sham
8
19.5±
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1.5*
54.5±
2.4
236±
27
3.60±
0.30**
OVXb
8
10.5±
2.1**△△
43.4±
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4.1
467±
93*
2.30±
0.30**△△
OVXe
8
5.8±
1.3**△△▲
48.5±
5.8
1 121±
, 百拇医药
273**△△▲▲
1.20±
0.20**△△▲▲
O+E
9
12.9±
0.8**△△^^
55.6±
2.7
381±
21^^
2.30±
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0.10**△△
O+VD
12
12.0±
1.1*△△^^
58.3±
4.3
459±
50*^^
2.20±
0.20**△△^^
注：与Base比较*P<0.05，**P<0.01；与Sham比较△△P<0.01，▲P<0.05，与OVXb比较▲▲P<0.01，与OVXe比较^^P<0.01(表2～3同)。Base：基线组，Sham:假手术组，OVXb:OVX治疗前对照组，OVXe:OVX治疗后对照组，O+E:17β雌二醇治疗组，O+VD：阿法骨化醇治疗组(下同)；Cn-BV/TV：松质骨骨小梁面积，Tb.Th:骨小梁厚度，Tb.Sp:骨小梁分离度，Tb.N:骨小梁数目
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2.反映骨转换和骨矿化的计量学指标的变化：OVX后侵蚀(ES/BS)、类骨质周径(O.Pm)、荧光标记周径(MS/BS)和骨形成率(BFR/S)均显著增加，OVXb较OVXe更为显著。O+VD使以上骨转换和骨矿化指标降低，但不如O+E显著。O+VD和O+E均未使延迟时间(Mlt)发生显著改变(表2)。
3.股骨松质骨骨矿含量(Trab.BMC)和骨密度(Trab.BMD)的变化(pQCT)： O+VD和O+E的Trab.BMC较OVXe分别增加109.2%和69.5%(P<0.01和P<0.05)。OVXe 的Trab.BMD较Sham下降63.2%(P<0.01)，O+VD组和O+E的Trab.BMD较OVXe分别增加133.1%(P<0.01)和119.7%(P<0.01，表3)。
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图1 大鼠右侧近端胫骨切片，可见A.(Base)和B.9
月龄(Sham)组次级骨小梁致密，结构完整；C.7月龄(OVXb)和D.9月龄(OVXe)组的骨小梁稀疏，尤其是OVXe更明显；E.9月龄(O+E)和F.9 月龄(O+VD)组的骨小梁数目比OVX组有显著增加，结构改善 Von Kossa染色 ×10表2 阿法骨化醇对骨转换和骨矿化的动态指标的影响(
±s) 组别, 百拇医药
鼠数
ES/BS(%)
O.Pm(%)
MS/BS(%)
MAR(μm/d)
MLT(d)
BFRs
Base
8
2.3±0.4
6.5±1.1
22.8±3.3
, 百拇医药 1.40±0.10
3.2±0.3
31.2±3.6
Sham
8
2.4±0.4
5.4±0.9
20.7±4.0
1.20±0.10
3.8±0.5
22.6±3.7
OVXb
, 百拇医药
8
6.4±1.3**△△
11.7±1.5*△△
40.4±9.4**△△
1.70±0.10△
3.8±0.4
71.2±18.9**△△
OVXe
8
4.5±1.5*△▲
, 百拇医药
8.9±3.0△
29.5±5.2
1.50±0.10△
3.8±0.5
46.2±9.2△▲
O+E
9
2.0±0.3▲▲^
3.3±0.4▲▲^
13.8±1.6▲▲^
, 百拇医药 1.20±0.10▲
3.8±0.4
17.1±2.5▲▲^^
O+VD
12
3.1±0.3▲▲
7.1±1.5▲
19.9±3.2▲▲
1.50±0.10
3.3±0.5
30.9±6.5▲▲
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注：与Sham比较△P<0.05，与OVX6比较▲P<0.05；与O+E比较^P<0.05。ES/BS：侵蚀周径比率，O.Pm：类骨质周径，MS/BS：标记表面比率，MAR：矿盐沉积率，MLT：矿化延迟时间，BFRs：骨形成率(表面) 4.股骨骨生物力学特性的改变：OVX后松质骨最大载荷(Can.load)显著下降。O+VD组和O+E组的Can.load比OVXe组分别增加170.8%和211.3%(P均<0.05)。O+VD组和O+E组的松质骨刚度(Can.stiff)比Ovxe组分别增加138.4%和202.9%(P均>0.05)。O+VD和O+E 2组之间差异无显著意义(表3)。
5.血钙(Ca)和尿脱氧吡啶啉(UDpd/Cr)的变化：阿法骨化醇治疗组的血Ca值显著高于OVXe(3.28 mmol/L±0.10 mmol/L 比2.72 mmol/L+0.04 mmol/L, P<0.05)。UDpd/Cr 在OVX后显著增加，OVXb和OVXe显著高于Sham(169 mmol/L±22 mmol/L, 131 mmol/L±14 mmol/L 比 56 mmol/L±8 mmol/L, P<0.01)。O+VD(54 mmol/L±7 mmol/L)和O+E组(60 mmol/L±9 mmol/L)较OVXe显著降低(P均<0.01)，而与Sham差异无显著意义。O+VD和O+E 2组之间差异无显著意义。
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表3 阿法骨化醇对股骨松质骨骨密度和骨生物力学
特性的影响(
±s) 组别鼠数
Trab.BMC
(mg/mm)
Trab.BMD
(mg/mm2)
Can.Load
(N)
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Can.Stiff
(N/mm)
Base
8
2.80±
0.40
349±
48
54.0±
10.7
767±
170
Sham
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8
3.20±
0.50
320±
39
23.4±
3.2**
396±
72**
OVXb
8
1.40±
0.20**△△
, 百拇医药
136±
24**△△
13.2±
2.6**
236±
62**
OVXe
8
1.40±
0.40**△△
117±
30**△△
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7.9±
1.9**△
144±
31**△
O+E
9
2.40±
0.20▲^
259±
17*▲▲^^
24.5±
5.6**^
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436±
94*^
O+VD
12
3.00±
0.20▲▲^^
275±
16*▲▲^^
21.3±
4.0**^
343±
67**
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注：与O+E比较^P<0.05；Trab.BMC：小梁骨骨矿含量；Trab.BMD：小梁骨骨矿密度；Can.Load：松质骨最大载荷；Can.Stiff:松质骨刚度讨论
OVX大鼠被推荐作为研究绝经后骨质疏松症动物的模型，正如我们的结果所示，OVX后大鼠骨转换增加，胫骨近端次级骨小梁变薄，结构稀疏。经pQCT检查表明，股骨远端松质骨的骨量和骨密度均有显著减少。股骨远端最大载荷的强度也较对照组显著减低，OVX后14周比OVX后6周更明显。
骨计量学结果表明，经阿法骨化醇治疗后，次级骨小梁的面积(CnBV/TV)比未治疗组有显著增加，O+VD超过了治疗前的水平，骨小梁的厚度和数目增加。说明阿法骨化醇不仅有效地防止了OVX后大鼠小梁骨的进一步骨丢失，而且促使部分骨小梁得以重获。与以往的使用活性维生素D防治OVX大鼠骨量丢失的结果是一致的[9-11]，与O+E组比较可知，阿法骨化醇在改善骨小梁结构方面与17β雌二醇的作用相似。我们的结果表明，经阿法骨化醇干预后股骨远端松质骨骨量和骨密度均较非治疗组有明显增加，且超过了治疗前的水平。说明阿法骨化醇治疗后能有效地增加松质骨的骨量和骨密度。使骨质疏松症患者椎体和髋部骨密度增加[5]。此外，在本结果中未见到治疗后矿盐沉积率和矿化延迟时间的异常变化。有临床研究证明，阿法骨化醇治疗可以降低骨折的发生率[12]，说明该药有可能使骨骼的力学特性得到改善。本研究的股骨远端凹入实验结果表明，阿法骨化醇干预后松质骨的最大载荷显著增加。
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基金项目：国家“九五”科技攻关基金资助项目(96-906-01-06)
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(收稿日期：1999-10-18), 百拇医药