BRCA1基因在早发性乳腺癌中的突变
作者：丁晓曼 郎景和
单位：(100730 中国协和医科大学中国医学科学院 北京协和医院)
关键词：乳腺肿瘤； 基因，BRCA1；突变
中华医学杂志000211 【摘要】 目的 了解早发性乳腺癌和BRCA1基因异常的关系。方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)，研究了10例早发性乳腺癌患者BRCA1在外显子2，11和20的基因突变情况。结果 10例患者PCR扩增产物均显示单一条带，与正常对照的相应片断长度一致。1例24岁发病的乳腺癌患者第3 732 bp碱基“G”被“C”取代，从而使密码子1 205编码的甘氨酸被精氨酸取代。结论 BRCA1在早发性乳腺癌中可能具有一定作用。
BRCA1 gene mutations in early-onset breast cancer
, http://www.100md.com
DING Xiaoman, LANG Jinghe.
(Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730， China)
【Abstract】 Objective To detect BRCA1 gene mutations in early-onset breast cancer. Methods We use polymerase chain reaction and single strand conformation polymorphism analysis (PCR-SSCP) to examine the mutation at BRCA1 gene exon 2, 11 and 20 in 10 patients with early-onset breast cancer. Results Mutation was found in one cases (24 years old at diaganosis) at nucleotide 3 732, the substitution of a “G” to a “C” in codon 1 205 changed a Gly to a Arg. Conclusions Our data suggest that BRCA1 may have effect on early-onset breast cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Breast neoplasms; Genes, BRCA1; Mutation
乳腺癌在发达国家是最常见的恶性肿瘤之一。连锁分析表明，遗传性乳腺癌和卵巢癌的易感基因BRCA1可解释45%的乳腺癌家系(67%的早发性乳腺癌和90%的遗传性乳腺癌和卵巢癌家系)。早发性乳腺癌患者更易具有家族遗传性。为了解BRCA1基因与早发性乳腺癌的关系，我们利用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)研究了10例40岁以前发病的乳腺癌患者BRCA1在外显子2，11和20基因突变情况。
对象和方法
一、对象
选取1996～1998年在我院就诊的发病年龄在40岁以前的乳腺癌患者10例，10例患者均经病理诊断，均进行了详细病史采集，家族中无乳腺癌或卵巢癌患者及其他癌症患者。
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二、方法
取患者5 ml的外周静脉血，2%依地酸二钠抗凝。引物：用21对引物分别扩增BRCA1基因的外显子2，11和20。外显子11因含3 426个碱基，用19对引物扩增。引物根据国外文献资料设计，由军事医学科学院合成。碱基序列和扩增片断长度见表1。DNA提取：按常规酚-氯仿抽提法或盐析法提取患者和正常对照外周血白细胞DNA，DNA用TE稀释，4℃保存。PCR扩增：25 μl反应体系中含：基因组DNA 0.1 ng，引物(25 μm)1 μl，dNTP 100 μmol/L，10×PCR缓冲液2.5 μl (1.5 mmol/L，MgCl2，10 mmol/L Tris-HCl pH 8.3，40 mmol/L KCl)，Taq DNA聚合酶1～2 U。外显子2的反应条件：95℃ 5 min→ 70℃ 1 min→50℃ 2 min →70℃ 3 min，进入主循环：94℃ 30 s，55℃ 30 s，70℃ 1 min，30个循环后，72℃延伸10 min。外显子11和20的反应条件：94℃变性3 min后，进入主循环：94℃ 30 s，55℃ 1 min，70℃ 2 min，30个循环后，72℃延伸10 min。PCR扩增产物经0.02 kg/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，4℃保存。SSCP分析：取PCR产物5～15 μl(视琼脂糖电泳检验的扩增效果而定)与3～5 μl加样液(0.95 kg/L甲酰胺，0.000 5 kg/L溴酚兰，0.000 5 kg/L二甲苯兰)混匀，98℃变性10 min后，水浴骤冷，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。引物e2，11.1、11.3、11.9、11.13、11.17扩增产物采用0.06 kg/L丙烯酰胺-甘油溶液，电泳4 h；引物11.0、11.2、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.10、11.11、11.12、11.14、11.15、11.16、11.18的扩增产物采用0.08 kg/L的丙烯酰胺-甘油溶液，电泳5.5 h；引物e20采用0.08 kg/L的丙烯酰胺-甘油溶液，电泳10 h。银染：0.1 kg/L乙醇、0.005 kg/L冰醋酸固定20 min，0.002 kg/L硝酸银染色5 min，0.015 kg/L氢氧化钠、0.004 kg/L甲醛显色3～5 min。每一步骤完成之后，都要用去离子水冲洗凝胶2～3次。DNA序列分析：SSCP胶上出现异常带者，相应的DNA用同样的引物扩增测序。
, 百拇医药
表1 PCR引物序列及长度 名称
引物序列(5′-3′)
长度
(bp)
e2
gaagttgtcattttataaaccttt，tgtcttttcttccctagtatgt
275
e20
atatgacgtgtctgctccac，gggaatccaaattacacagc
425
11.0
, 百拇医药
ccacctccaaggtgtatgaa，gagctggcatgagtatttgtg
200左右
11.1
agaggcatccagaaaagtatcagg，gggagtccgcctatcattacat
239
11.2
acagcctggcttagcaaggag，ccccatcatgtgagtcatcaga
278
11.3
agaaactgccatgctcagagaatc，atgaggatcactggccagtaagtc
, http://www.100md.com
245
11.4
tgtattggacgttctaaatgaggt，ttgtgaggggacgctcttgta
266
11.5
gcatttgttactgagccacagata，tctattgggttaggatttttctca
263
11.6
caaacggagcagaatggtca，gcctggtagaagacttcctcctc
244
, http://www.100md.com
11.7
tccacaattcaaaagcacctaaaa，ctctgggaaagtatcgctgtcat
299
11.8
gcaactggagccaagaagagtaac，tttgcaaaaccctttctccactta
256
11.9
ttgtcaatcctagccttccaagag，ttttgccttccctagagtgctaac
224
11.10
, http://www.100md.com
tatggcactcaggaaagtatctcg，gcgctttgaaaccttgaatgtat
270
11.11
acagtcgggaaacaagcatagaa，tttggcattatcaactggcttatc
314
11.12
aggctttcctgtggttggt，ttacggctaattgtgctcactg
306
11.13
aacattccaagtacagtgagcaca，agatgcatgactacttcccatagg
, http://www.100md.com
378
11.14
tcctggaagtaattgtaagcatcc，ggcccctcttcggtaacc
325
11.15
tcctagccctttcacccataca，agatgcctttgccaatattacctg
274
11.16
tgctaccgagtgtctgtctaagaa，agaaaggatcctgggtgtttgtat
209
, http://www.100md.com
11.17
gctagcttgttttcttcacagtgc，aagtttgaatccatgctttgctct
218
11.18
cagggagttggtctgagtgac，gctccccaaaagcataaaca
200左右
结果 1.PCR扩增：10例患者外显子2，11，20的PCR扩增结果显示：所有患者PCR扩增产物均显示单一条带，与正常对照的相应片断长度一致，说明患者BRCA1基因在所检测的片断上没有明显的插入或缺失。
2.SSCP分析结果：将患者与正常对照BRCA1基因外显子2，11和20的PCR产物分别进行SSCP分析，与同一胶中正常对照相比，单链DNA带发生泳动者，即视为有突变。结果显示：1例24岁发病的患者BRCA1基因的外显子11中11.15的PCR扩增片断在行SSCP分析时有泳动变位(图1)。
, 百拇医药
N.正常对照；B1.患者
图1 PCR产物SSCP分析图谱B1有泳动变位
3.DNA序列分析结果：对外显子11中引物11.15 PCR产物直接进行测定，结果显示：3 732碱基上“G”被“C”取代，从而使密码子1 205编码的甘氨酸被精氨酸替代。
讨论
BRCA1基因的22个外显子编码含有1 863个氨基酸的蛋白质，其具体的生物学功能目前还不清楚。有研究证实BRCA1可能抑制乳腺上皮细胞的生长[1]。现普遍认为BRCA1是一种肿瘤抑制基因(TSG)[2]，可抑制肿瘤的发生、发展。TSG失活可引起细胞无限制的生长，从而致癌。Knudson理论认为TSG位点的两个等位基因均可突变，从而诱发肿瘤的发生。在散发性乳腺癌中，这些突变发生于乳腺组织的上皮细胞内。而在遗传性乳腺癌中，基因组已获得1个等位基因的突变，在所有靶器官的TSG均可发生另外1个等位基因的突变，因此这些细胞易于癌变。所以遗传性乳腺癌患者的发病年龄明显低于散发性乳腺癌患者的发病年龄。
, 百拇医药
乳腺癌分为早发性和晚发性，以50岁为界。早发性乳腺癌患者易于具有遗传倾向。40岁以前发病的乳腺癌，约30%具有遗传倾向；而在60岁以后发病的乳腺癌，不足5%具有遗传倾向。早发性乳腺癌67%与BRCA1连锁；晚发性乳腺癌仅有28%与BRCA1连锁[3]。Langston等[4]在80例35岁以前发病的乳腺癌中发现6例突变。Fitzgerald在30岁以前发病的30例乳腺癌中发现5例突变[5]。
迄今为止已发现的100余种BRCA1基因突变分布在整个基因组上，没有突变热点。其主要分为：81%可产生BRCA1的截状蛋白；4%是与疾病相关的错义突变；15%的生物学功能不清[6]。本研究中所发现的突变，第3 732 bp碱基“G”被“C”取代，从而使密码子1 205编码的甘氨酸被精氨酸取代。这种突变在以往的文献中尚少见报道。
目前，BRCA1基因突变的研究主要集中在有乳腺癌或卵巢癌家族史的高危妇女中，但早发性乳腺癌在乳腺癌中的比例在逐渐升高。BRCA1突变携带者终生外显率在乳腺癌>80%，流行病学资料证实，人群中相当一部分早发性乳腺癌应归结于BRCA1基因突变[7]。本研究亦提示BRCA1基因突变并不仅局限在有卵巢癌或乳腺癌家族史的妇女。因此不能单纯根据家族史来判断有无BRCA1基因突变。现有的BRCA1基因突变检测手段还存有缺陷，不能普遍应用。BRCA1基因突变没有突变热点，需对整个基因组进行检测。但即使直接进行DNA测序，也不能检测到所有的突变；另外有些突变的生物学功能还不清楚。只有进一步了解BRCA1的结构及其蛋白质的生物学功能，方可制定有效的突变检测手段，为高危妇女提供可靠的遗传咨询。
, http://www.100md.com
参考文献
[1]Holt JT, Thompson ME, Szabo C, et al. Growth retardation and tumor inhibition by BRCA1. Nat Genet, 1996,12：298-302.
[2]Feunteun J, Lenoir GM. BRCA1, a gene involved in inherited predisposition to breast and ovarian cancer. BBA, 1996,1242：177-180.
[3]Friedman LS, Ostermeyre EA, Lynch ED, et al. The search for BRCA1. Cancer Res, 1994,54：6374-6382.
[4]Langston AA, Malone KE, Thompson TD, et al. BRCA1 mutations in a population-based sample of young women with breast cancer. N Engl J Med, 1996,334：137-142.
, 百拇医药
[5]Szabo CI, King MC. Population genetics of BRCA1 and BRCA2. Am J Hum Genet, 1997,60：1013-1020.
[6]Cropp CA, Nevanlinna HA, Pyrhonen S, et al. Evidence for involvement of BRCA1 in sporadic breast carcinomas. Cancer Res, 1994,54：2548-2551.
[7]Easton DF, Ford D, Bishop DT, et al. Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1 mutation carriers. Am J Hum Genet, 1995,56：265-271.
收稿日期：1999-03-15, 百拇医药
单位：(100730 中国协和医科大学中国医学科学院 北京协和医院)
关键词：乳腺肿瘤； 基因，BRCA1；突变
中华医学杂志000211 【摘要】 目的 了解早发性乳腺癌和BRCA1基因异常的关系。方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)，研究了10例早发性乳腺癌患者BRCA1在外显子2，11和20的基因突变情况。结果 10例患者PCR扩增产物均显示单一条带，与正常对照的相应片断长度一致。1例24岁发病的乳腺癌患者第3 732 bp碱基“G”被“C”取代，从而使密码子1 205编码的甘氨酸被精氨酸取代。结论 BRCA1在早发性乳腺癌中可能具有一定作用。
BRCA1 gene mutations in early-onset breast cancer
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DING Xiaoman, LANG Jinghe.
(Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730， China)
【Abstract】 Objective To detect BRCA1 gene mutations in early-onset breast cancer. Methods We use polymerase chain reaction and single strand conformation polymorphism analysis (PCR-SSCP) to examine the mutation at BRCA1 gene exon 2, 11 and 20 in 10 patients with early-onset breast cancer. Results Mutation was found in one cases (24 years old at diaganosis) at nucleotide 3 732, the substitution of a “G” to a “C” in codon 1 205 changed a Gly to a Arg. Conclusions Our data suggest that BRCA1 may have effect on early-onset breast cancer.
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【Key words】 Breast neoplasms; Genes, BRCA1; Mutation
乳腺癌在发达国家是最常见的恶性肿瘤之一。连锁分析表明，遗传性乳腺癌和卵巢癌的易感基因BRCA1可解释45%的乳腺癌家系(67%的早发性乳腺癌和90%的遗传性乳腺癌和卵巢癌家系)。早发性乳腺癌患者更易具有家族遗传性。为了解BRCA1基因与早发性乳腺癌的关系，我们利用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)研究了10例40岁以前发病的乳腺癌患者BRCA1在外显子2，11和20基因突变情况。
对象和方法
一、对象
选取1996～1998年在我院就诊的发病年龄在40岁以前的乳腺癌患者10例，10例患者均经病理诊断，均进行了详细病史采集，家族中无乳腺癌或卵巢癌患者及其他癌症患者。
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二、方法
取患者5 ml的外周静脉血，2%依地酸二钠抗凝。引物：用21对引物分别扩增BRCA1基因的外显子2，11和20。外显子11因含3 426个碱基，用19对引物扩增。引物根据国外文献资料设计，由军事医学科学院合成。碱基序列和扩增片断长度见表1。DNA提取：按常规酚-氯仿抽提法或盐析法提取患者和正常对照外周血白细胞DNA，DNA用TE稀释，4℃保存。PCR扩增：25 μl反应体系中含：基因组DNA 0.1 ng，引物(25 μm)1 μl，dNTP 100 μmol/L，10×PCR缓冲液2.5 μl (1.5 mmol/L，MgCl2，10 mmol/L Tris-HCl pH 8.3，40 mmol/L KCl)，Taq DNA聚合酶1～2 U。外显子2的反应条件：95℃ 5 min→ 70℃ 1 min→50℃ 2 min →70℃ 3 min，进入主循环：94℃ 30 s，55℃ 30 s，70℃ 1 min，30个循环后，72℃延伸10 min。外显子11和20的反应条件：94℃变性3 min后，进入主循环：94℃ 30 s，55℃ 1 min，70℃ 2 min，30个循环后，72℃延伸10 min。PCR扩增产物经0.02 kg/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，4℃保存。SSCP分析：取PCR产物5～15 μl(视琼脂糖电泳检验的扩增效果而定)与3～5 μl加样液(0.95 kg/L甲酰胺，0.000 5 kg/L溴酚兰，0.000 5 kg/L二甲苯兰)混匀，98℃变性10 min后，水浴骤冷，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。引物e2，11.1、11.3、11.9、11.13、11.17扩增产物采用0.06 kg/L丙烯酰胺-甘油溶液，电泳4 h；引物11.0、11.2、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.10、11.11、11.12、11.14、11.15、11.16、11.18的扩增产物采用0.08 kg/L的丙烯酰胺-甘油溶液，电泳5.5 h；引物e20采用0.08 kg/L的丙烯酰胺-甘油溶液，电泳10 h。银染：0.1 kg/L乙醇、0.005 kg/L冰醋酸固定20 min，0.002 kg/L硝酸银染色5 min，0.015 kg/L氢氧化钠、0.004 kg/L甲醛显色3～5 min。每一步骤完成之后，都要用去离子水冲洗凝胶2～3次。DNA序列分析：SSCP胶上出现异常带者，相应的DNA用同样的引物扩增测序。
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表1 PCR引物序列及长度 名称
引物序列(5′-3′)
长度
(bp)
e2
gaagttgtcattttataaaccttt，tgtcttttcttccctagtatgt
275
e20
atatgacgtgtctgctccac，gggaatccaaattacacagc
425
11.0
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ccacctccaaggtgtatgaa，gagctggcatgagtatttgtg
200左右
11.1
agaggcatccagaaaagtatcagg，gggagtccgcctatcattacat
239
11.2
acagcctggcttagcaaggag，ccccatcatgtgagtcatcaga
278
11.3
agaaactgccatgctcagagaatc，atgaggatcactggccagtaagtc
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11.4
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266
11.5
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263
11.6
caaacggagcagaatggtca，gcctggtagaagacttcctcctc
244
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11.7
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299
11.8
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256
11.9
ttgtcaatcctagccttccaagag，ttttgccttccctagagtgctaac
224
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tatggcactcaggaaagtatctcg，gcgctttgaaaccttgaatgtat
270
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acagtcgggaaacaagcatagaa，tttggcattatcaactggcttatc
314
11.12
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306
11.13
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378
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11.15
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200左右
结果 1.PCR扩增：10例患者外显子2，11，20的PCR扩增结果显示：所有患者PCR扩增产物均显示单一条带，与正常对照的相应片断长度一致，说明患者BRCA1基因在所检测的片断上没有明显的插入或缺失。
2.SSCP分析结果：将患者与正常对照BRCA1基因外显子2，11和20的PCR产物分别进行SSCP分析，与同一胶中正常对照相比，单链DNA带发生泳动者，即视为有突变。结果显示：1例24岁发病的患者BRCA1基因的外显子11中11.15的PCR扩增片断在行SSCP分析时有泳动变位(图1)。
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N.正常对照；B1.患者
图1 PCR产物SSCP分析图谱B1有泳动变位
3.DNA序列分析结果：对外显子11中引物11.15 PCR产物直接进行测定，结果显示：3 732碱基上“G”被“C”取代，从而使密码子1 205编码的甘氨酸被精氨酸替代。
讨论
BRCA1基因的22个外显子编码含有1 863个氨基酸的蛋白质，其具体的生物学功能目前还不清楚。有研究证实BRCA1可能抑制乳腺上皮细胞的生长[1]。现普遍认为BRCA1是一种肿瘤抑制基因(TSG)[2]，可抑制肿瘤的发生、发展。TSG失活可引起细胞无限制的生长，从而致癌。Knudson理论认为TSG位点的两个等位基因均可突变，从而诱发肿瘤的发生。在散发性乳腺癌中，这些突变发生于乳腺组织的上皮细胞内。而在遗传性乳腺癌中，基因组已获得1个等位基因的突变，在所有靶器官的TSG均可发生另外1个等位基因的突变，因此这些细胞易于癌变。所以遗传性乳腺癌患者的发病年龄明显低于散发性乳腺癌患者的发病年龄。
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乳腺癌分为早发性和晚发性，以50岁为界。早发性乳腺癌患者易于具有遗传倾向。40岁以前发病的乳腺癌，约30%具有遗传倾向；而在60岁以后发病的乳腺癌，不足5%具有遗传倾向。早发性乳腺癌67%与BRCA1连锁；晚发性乳腺癌仅有28%与BRCA1连锁[3]。Langston等[4]在80例35岁以前发病的乳腺癌中发现6例突变。Fitzgerald在30岁以前发病的30例乳腺癌中发现5例突变[5]。
迄今为止已发现的100余种BRCA1基因突变分布在整个基因组上，没有突变热点。其主要分为：81%可产生BRCA1的截状蛋白；4%是与疾病相关的错义突变；15%的生物学功能不清[6]。本研究中所发现的突变，第3 732 bp碱基“G”被“C”取代，从而使密码子1 205编码的甘氨酸被精氨酸取代。这种突变在以往的文献中尚少见报道。
目前，BRCA1基因突变的研究主要集中在有乳腺癌或卵巢癌家族史的高危妇女中，但早发性乳腺癌在乳腺癌中的比例在逐渐升高。BRCA1突变携带者终生外显率在乳腺癌>80%，流行病学资料证实，人群中相当一部分早发性乳腺癌应归结于BRCA1基因突变[7]。本研究亦提示BRCA1基因突变并不仅局限在有卵巢癌或乳腺癌家族史的妇女。因此不能单纯根据家族史来判断有无BRCA1基因突变。现有的BRCA1基因突变检测手段还存有缺陷，不能普遍应用。BRCA1基因突变没有突变热点，需对整个基因组进行检测。但即使直接进行DNA测序，也不能检测到所有的突变；另外有些突变的生物学功能还不清楚。只有进一步了解BRCA1的结构及其蛋白质的生物学功能，方可制定有效的突变检测手段，为高危妇女提供可靠的遗传咨询。
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参考文献
[1]Holt JT, Thompson ME, Szabo C, et al. Growth retardation and tumor inhibition by BRCA1. Nat Genet, 1996,12：298-302.
[2]Feunteun J, Lenoir GM. BRCA1, a gene involved in inherited predisposition to breast and ovarian cancer. BBA, 1996,1242：177-180.
[3]Friedman LS, Ostermeyre EA, Lynch ED, et al. The search for BRCA1. Cancer Res, 1994,54：6374-6382.
[4]Langston AA, Malone KE, Thompson TD, et al. BRCA1 mutations in a population-based sample of young women with breast cancer. N Engl J Med, 1996,334：137-142.
, 百拇医药
[5]Szabo CI, King MC. Population genetics of BRCA1 and BRCA2. Am J Hum Genet, 1997,60：1013-1020.
[6]Cropp CA, Nevanlinna HA, Pyrhonen S, et al. Evidence for involvement of BRCA1 in sporadic breast carcinomas. Cancer Res, 1994,54：2548-2551.
[7]Easton DF, Ford D, Bishop DT, et al. Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1 mutation carriers. Am J Hum Genet, 1995,56：265-271.
收稿日期：1999-03-15, 百拇医药