CD15mRNA、CD44v6mRNA及nm23H1mRNA在乳腺癌组织中的表达及其临床意义
作者：谷化平 倪灿荣 詹熔洲 尚培中
单位：谷化平(中国人民解放军第251医院 张家口075000)；尚培中(中国人民解放军第251医院 张家口075000)；倪灿荣(第二军医大学基础部)；詹熔洲(第二军医大学基础部)
关键词：乳腺肿瘤；抗原；CD15；抗原；CD44；原位杂交；免疫组织化学
中华医学杂志001116
【摘要】 目的 探讨CD15 mRNA及其蛋白、CD44v6mRNA和nm23H1 mRNA在乳腺癌组织中的表达及与乳腺癌患者预后的关系。方法 应用催化信号放大(CSA)原位杂交和免疫组织化学方法，对94例乳腺癌患者的癌组织进行了CD15 mRNA及其蛋白、CD44v6 mRNA和nm23H1 mRNA表达的检测。结果 CD15 mRNA及其蛋白、CD44v6 mRNA高表达及nm23H1 mRNA低表达均与乳腺癌患者的组织学分级、临床分期、淋巴结转移、复发和预后密切相关。CD15 mRNA和CD44v6mRNA高表达及nm23H1 mRNA低表达患者淋巴结转移率高、生存率低。结论 CD15 mRNA表达与CD44v6 mRNA和nm23H1mRNA表达具有正、负调节的协同作用。联合检测3个基因，能更准确地判断乳腺癌的转移和预后状态。
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The expression of CD15 mRNA、CD44v6 mRNA and nm23H1 mRNA in breast cancer and their clinical significance
GU Huaping NI Canrong ZHAN Rongzhou
(Department of Pathology， Chinese PLA 251 Hospital, Zhangjiakou 075000, China)
【Abstract】 Objective To study the relationship of the expression of CD15 mRNA and its protein, CD44v6 mRNA and nm23H1 mRNA with the clinical pathology parameter and prognosis of breast cancer, and to investigate the correlation of the expression of CD15 mRNA with CD44v6 mRNA and nm23H1 mRNA. Methods Catalyzed signal amplification (CSA) method of in situ hybridization and immunohistochemistry were used to detect the expression of CD15 mRNA and its protein, CD44v6 mRNA and nm23H1 mRNA in 94 cases of breast cancer. Results The overexpression of CD15 mRNA and its protein and CD44v6 mRNA and the low expression nm23H1 mRNA were correlated with the grading, clinical stage, lymph node metastasis, recurrence and prognosis of breast cancer. Patients who had overexpression of CD15 mRNA and CD44v6 mRNA and low expression of nm23H1 mRNA had a higher lymph node metastatic rate and a lower survival rate. Conclusion The expression of CD15 mRNA has a synergistic action in positive and negative regulation with that of CD44v6 mRNA and nm23H1 mRNA. Combining detection of the expression of these three mRNA is a reliable index to evaluate the matastasis, recurrence and prognosis of breast cancer.
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【Key words】 Breast neoplasms； Antigens, CD15； Antigens, CD44； In situ hybridization； Immunohistochemistry
恶性肿瘤形成和转移的发生是多基因、多因子共同作用的结果。探究肿瘤发生和转移的分子机制，寻找其相关的生物标志物是多年来肿瘤学基础与临床研究的主题之一。我们应用原位杂交(ISH)和免疫组织化学(IHC)方法，研究CD15 mRNA及其蛋白、CD44v6 mRNA和nm23H1 mRNA的表达与乳腺癌患者转移、复发和预后之间的相关性，并结合临床和随访资料分析，评价CD15 mRNA可否作为预测乳腺癌转移、复发和患者预后的生物学指标。
对象和方法
一、对象
标本取自中国人民解放军251医院和第二军医大学长海医院手术切除的女性乳腺癌患者癌组织，共94例。94例中浸润性导管癌50例，单纯癌20例，髓样癌7例，硬癌4例，导管内癌3例，炎性乳腺癌2例，大汗腺癌、分泌型癌和富脂质细胞癌各1例。同时取癌旁组织20例(距癌灶<2 cm)。乳腺癌诊断分型、分期及组织学分级按文献[1]介绍的方法。标本均经体积分数为10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。
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二、方法
1.试剂：鼠抗CD15s mAb、生物素化酪胺分子(BT)和催化信号放大(CSA)kit盒均购自丹麦Dako公司。生物素化抗地高辛(DIG)二抗、末端标记和Sp6/T7体外转录标记盒购自德国宝灵曼公司。nm23 H1 cDNA质粒(PGEH-42)由广州军区总医院陈晓东博士转赠。CD44v6 cDNA由英国皇家癌症研究所Ursula Gunthert博士惠赠。CD15寡核苷酸探针由中国科学院上海细胞研究所按文献[2]报道方法合成。
2.染色方法：(1)IHC染色：采用CSA法，按文献[3]报道的方法操作，H2O2-DAB显色。(2)ISH染色：①探针标记：CD15 cDNA寡核苷酸探针按末端标记试剂盒说明书操作，末端标记上DIG。 CD44v6 cDNA载体质粒PGEX-2T中CD44V2-V10，cDNA插入ECOR Ⅰ酶切位点。探针用聚合酶链反应(PCR)合成，标记上生物素，CD44v6引物参照文献[4]介绍的方法。nm23 H1 cDNA质粒(PGEH-42)经转化扩增，抽提后得到的质粒DNA经酶切使其线性化，回收DNA片段；按Sp6/T7体外转录标记kit说明书操作，并标记上DIG。②杂交前准备：新鲜组织标本用体积分数为4%多聚甲醛固定[以下一切均用焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理]24 h，新鲜系列乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，贴在涂有切片粘合剂(质量分数为1%的多聚赖氨酸)的载玻片上，58℃烤片24 h。常规脱蜡至水，磷酸盐缓冲液(PBS)洗，20 μg/ml蛋白酶K 37℃20 min，PBS洗3×3 min，0.2×柠檬酸盐缓冲液(SSC)洗 2×5 min。用体积分数为4%多聚甲醛后固定10 min，系列乙醇脱水，PBS洗3×3 min，0.2×SSC洗2×5 min。③杂交和检测：操作按文献[5]介绍的方法。H2O2-DAB显色。(3)对照设计：ISH阳性对照均按Gen Point kit内配置阳性切片为标准。经RUAase消化1 h后，作杂交为阴性对照。杂交液中不加探针结果为阴性。IHC阳性对照用CD15s阳性大肠癌作阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。(4)结果判断：IHC和ISH染色，阳性信号呈棕黄色。根据阳性细胞染色范围及强度分为3级：Ⅰ级：无明显阳性反应细胞为阴性(-);Ⅱ级：阳性细胞<50%、染色较弱者为弱阳性(+);Ⅲ级：阳性细胞>50%、染色较强者为强阳性(++)。
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3.统计学处理：差异显著性检验采用χ2检验和相关分析。差异显著性标准P<0.05。
结果
一、癌及癌旁组织中CD15 mRNA及其蛋白、CD44v6 mRNA和nm23H1mRNA的表达
IHC和ISH染色显示，CD15蛋白、CD15mRNA、CD44v6mRNA和nm23H1mRNA阳性表达产物呈棕黄色或棕褐色颗粒状或团块状，位于细胞浆内(图1～3)。94例患者的乳腺癌组织中CD15蛋白、CD15mRNA 、CD44v6mRNA和nm23H1mRNA阳性表达率分别为80%(75/94)、84%(79/94)、81%(76/94)和59%(55/94)。20例癌旁组织中其阳性表达率分别为40%(8/20)、45%(9/20)、10%(2/20)和90%(18/20)，CD15蛋白、CD15mRNA和CD44v6mRNA阳性表达率在癌组织和癌旁组织中差异有显著意义(x2=13.2, x2=17.7, x2=11.3,P值均<0.01)，nm23H1 mRNA阳性表达率在癌组织和癌旁组织中差异有显著意义(x2=5.8,P<0.01)。
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图1 乳腺癌组织CD15寡核苷酸探针染色阳性CSA-ISH法 ×400 图2 乳腺癌组织CD44 cDNA探针-b染色阳性CSA-ISH法 ×200 图3 乳腺癌组织nm23 cRNA探针-DIG染色阳性CSA-ISH法 ×200
二、癌组织中CD15蛋白、CD15mRNA、CD44v6和nm23H1mRNA表达与临床病理指标的关系
CD15 mRNA、CD44v6 mRNA及nm23H1 mRNA阳性表达与乳腺癌肿瘤大小无关(x2=2.8,P>0.05)，而与乳腺癌临床分期、组织分级和淋巴结转移密切相关(表1)。
三、癌组织中CD15 mRNA、CD44v6 mRNA和nm23H1mRNA表达与患者预后的关系
94例乳腺癌中，获得术后随访满5年以上者83例，其中5年内复发转移者61例，无复发转移者22例。5年内死亡患者52例，生存>5年者31例。在CD15 mRNA及CD44v6mRNA阳性表达的病例中术后5年内复发转移率高，生存>5年率低。在nm23H1 mRNA表达阳性的病例中术后5年复发转移率低，生存>5年率高(表2)。
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四、癌组织中CD15 mRNA表达与CD44v6mRNA和nm23H1mRNA表达的关系
在79例CD15 mRNA阳性表达的乳腺癌组织中，CD44v6 mRNA和nm23H1mRNA阳性表达者分别为71例(90%)和40例(51%),在CD15mRNA阴性表达的15例乳腺癌组织中的CD44v6 mRNA和nm23H1mRNA阳性表达者分别为5例(33%)和15例(100%) 。CD15阳性表达者CD44v6 mRNA阳性表达率明显高于CD15阴性者(x2=26.0,P<0.001)，而nm23H1mRNA阳性表达率明显低于CD15阴性者(x2=92.6,P<0.005)。乳腺癌组织中CD15mRNA表达与CD44v6 mRNA表达呈显著正相关性(r=0.53),与nm23H1 mRNA表达呈显著负相关性(r=-0.34)。在CD15mRNA、CD44v6 mRNA阳性表达和nm23H1 mRNA阴性表达的39例患者中，淋巴结转移29例(74%),患者生存>5年者5例(15%),而CD15 mRNA、CD44v6 mRNA阴性和nm23H1 mRNA阳性的10例中,淋巴结转移3例(30%),患者生存>5年者9例(90.0%),差异均有显著意义(x2=4.9,P<0.05; x2=30.9,P<0.01)。
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讨论
一、CD15 mRNA及其蛋白、CD44v6 mRNA和nm23H1 mRNA表达与乳腺癌的关系
研究发现，CD15表达与肝癌、甲状腺髓样癌、肾癌及前列腺癌的发生发展，侵袭转移和患者预后密切相关，被视为具有肿瘤预后不良的标志[6]。CD44是一种整合膜糖蛋白。CD44v6是CD44的一种变异型，其表达有助于肿瘤细胞获得转移潜能。Kaufmann等[7]采用多克隆抗体和单克隆抗体，检测了100例原发性浸润型乳腺癌、12例局灶性复发性乳腺癌、18例有乳腺癌转移的淋巴结组织，用正常乳腺组织作对照，发现正常乳腺组织中无CD44v6 表达，而在84%的原发肿瘤及100%的复发病灶和转移的淋巴结中阳性，且CD44v6表达阳性的患者的预后差，认为CD44v6可作为独立的预后指标。nm23H1基因定位于17q1/21.3-22，包含5个外显子和4个内含子，编码核苷二磷酸激酶(NDPK)。一般认为nm23H1基因具有等位基因缺失，点突变，扩增等多种变异方式，并与恶性肿瘤的高转移潜能密切相关。nm23H1 mRNA表达与乳腺癌组织学分级和淋巴结转移均呈负相关，低nm23H1表达强烈提示预后不佳[8]。我们的研究结果显示，在乳腺癌组织中CD15蛋白、CD15 mRNA和CD44v6 mRNA阳性表达率均明显高于癌旁组织，nm23H1 mRNA阳性表达率明显低于癌旁组织。随着乳腺癌的临床分期、组织学分级的增高及淋巴结转移的发生，CD15 mRNA和CD44v6 mRNA阳性表达率均明显增高，nm23H1 mRNA阳性表达率明显降低。CD15 mRNA和CD44v6 mRNA高表达和nm23H1 mRNA低表达的患者术后5年内复发和转移的机会均明显增高，存活>5年率均明显降低。说明，CD15 mRNA、CD44v6 mRNA和nm23H1mRNA表达均参与乳腺癌的发生及细胞恶性转化过程，在乳腺癌的临床进展和转移过程中起着重要作用，是预测乳腺癌肿瘤复发、转移潜能及评估患者预后不良的病理生物学指标。
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表1 乳腺癌患者癌组织中CD15mRNA及其蛋白、CD44v6 mRNA和nm23H1 mRNA表达与临床病理指标的关系(例数) 临床病
理指标
总
例数
CD15蛋白表达
CD15 mRNA表达
CD44v6 mRNA表达
nm23H1 mRNA表达
+
++
阳性率(%)
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+
++
阳性率(%)
+
++
阳性率(%)
+
++
阳性率(%)
临床分期
Ⅰ～Ⅱ
54
14
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24
70
8
34
78
8
30
70
14
23
69
Ⅲ～Ⅳ
40
6
, 百拇医药
31
93
9
30
98
10
28
95
7
11
45
组织学分级
, 百拇医药
Ⅰ
39
8
19
69
7
22
74
9
17
67
15
14
74
, 百拇医药
Ⅱ～Ⅲ
55
12
36
87△
10
40
91△
9
41
91△
6
20
, 百拇医药
47△
淋巴结转移
无
43
5
26
72
11
21
74
8
22
70
, 百拇医药
13
17
70
有
51
15
29
90▲
6
41
92▲
10
36
, 百拇医药
90▲
8
17
49▲
注:与Ⅰ～Ⅱ期比较χ2=7.7,χ2=5.9,χ2=7.5,χ2=4.3,P均<0.05；与Ⅰ级比较△χ2=4.6,χ2=4.7,χ2=8.7,χ2=6.9,P均<0.05；与无淋巴结转移比较▲χ2=5.2,χ2=4.2,χ2=6.3,χ2=4.1,P均<0.05表2 乳腺癌患者癌组织中CD15 mRNA、CD44v6 mRNA和nm23H1 mRNA表达与预后的关系(例数) 组别
, 百拇医药
总
例数
CD15mRNA
CD44v6mRNA
nm23H1mRNA
阴性
阳性
χ2值
P值
阴性
阳性
χ2值
, 百拇医药 P值
阴性
阳性
χ2值
P值
术后复发转移组
61
6
55
5.9
<0.05
9
52
, 百拇医药
6.5
<0.05
46
15
10.8
<0.05
生存>5年组
31
9
22
6.7
<0.05
11
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20
5.5
<0.05
26
5
7.7
<0.05
二、CD15mRNA、CD44v6mRNA和nm23H1mRNA在乳腺癌组织中表达的相关性及其意义
在恶性肿瘤发生的癌基因研究中，许多学者提出了基因协同作用假说，认为在恶性肿瘤发生，发展和转移的各阶段，至少有两个或两个以上功能不同的异常激活的基因各自发挥不同作用，并在时间和空间上相互配合，协同促进了细胞的癌变。CAM的功能除介导细胞间相互识别外，还参与了细胞信息传递或成为细胞内的第二信使，并行使辅助分子的功能，可将细胞内的信息传递到细胞质或细胞核。CD15与CD44v6一样同属CAM成员。本研究显示，在乳腺癌组织中CD15 mRNA表达与CD44v6 mRNA表达呈正相关，而与nm23H1mRNA表达呈负相关。CD15mRNA和CD44v6 mRNA高表达伴nm23H1mRNA低表达，与乳腺癌的复发、转移和患者的存活率关系更为密切,表明在乳腺癌的系列病理过程中，CD15与CD44v6及nm23H1具有相互影响的调节或负调节的协同作用可能。因此认为，深入探讨它们之间的作用机制，将对阐明和阻断肿瘤转移的形成具有重要价值。参考文献
, 百拇医药
1，李树玲.中国常见恶性肿瘤诊治规范.乳腺癌.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1990.59.
2，Bolos CD, Garrido M, Real FX. Mucb apomucin shows a distinct normal tisswe distribwtivn that corkelater with lewis amtigen expression in the human stomach. Gastroenterology,1995,109:723- 734.
3，倪灿荣，范森，许炳基.CSA系统在免疫组织化学中的应用.临床与实验病理学杂志，1999，15：267-269.
4，Kay F, Folker F, Lisboa BW. CD44 isoforms correlate with cellular differentiation but not with prognosis in human breast cancer. Cancer Res,1995，55:5424-5433.
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5，倪灿荣，朱明华，马大烈.催化信号放大系统在原位杂交检测中的应用研究.中国组织化学与细胞化学杂志，2000，9：110-112.
6，谷化平，尚培中，纪小龙.甲状腺肿瘤中CD15抗原的表达及临床意义.中华内分泌代谢杂志，2000，16:31-33.
7，Karfmann M,Heider KH,Sinn HP,et al. CD44 variant exon epitopes in primary breast cancer and length of survival. Lancet,1995,345: 615-619.
8，Caligo MA, Cipollini G Berti A,et al.nm23 gene expression in human breast carcinoma: loss of correlation with cell proliferation in the advanced phase of tumor progression.Int Cancer,1997,74:102-111.
(收稿日期：2000-04-26), 百拇医药
单位：谷化平(中国人民解放军第251医院 张家口075000)；尚培中(中国人民解放军第251医院 张家口075000)；倪灿荣(第二军医大学基础部)；詹熔洲(第二军医大学基础部)
关键词：乳腺肿瘤；抗原；CD15；抗原；CD44；原位杂交；免疫组织化学
中华医学杂志001116
【摘要】 目的 探讨CD15 mRNA及其蛋白、CD44v6mRNA和nm23H1 mRNA在乳腺癌组织中的表达及与乳腺癌患者预后的关系。方法 应用催化信号放大(CSA)原位杂交和免疫组织化学方法，对94例乳腺癌患者的癌组织进行了CD15 mRNA及其蛋白、CD44v6 mRNA和nm23H1 mRNA表达的检测。结果 CD15 mRNA及其蛋白、CD44v6 mRNA高表达及nm23H1 mRNA低表达均与乳腺癌患者的组织学分级、临床分期、淋巴结转移、复发和预后密切相关。CD15 mRNA和CD44v6mRNA高表达及nm23H1 mRNA低表达患者淋巴结转移率高、生存率低。结论 CD15 mRNA表达与CD44v6 mRNA和nm23H1mRNA表达具有正、负调节的协同作用。联合检测3个基因，能更准确地判断乳腺癌的转移和预后状态。
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The expression of CD15 mRNA、CD44v6 mRNA and nm23H1 mRNA in breast cancer and their clinical significance
GU Huaping NI Canrong ZHAN Rongzhou
(Department of Pathology， Chinese PLA 251 Hospital, Zhangjiakou 075000, China)
【Abstract】 Objective To study the relationship of the expression of CD15 mRNA and its protein, CD44v6 mRNA and nm23H1 mRNA with the clinical pathology parameter and prognosis of breast cancer, and to investigate the correlation of the expression of CD15 mRNA with CD44v6 mRNA and nm23H1 mRNA. Methods Catalyzed signal amplification (CSA) method of in situ hybridization and immunohistochemistry were used to detect the expression of CD15 mRNA and its protein, CD44v6 mRNA and nm23H1 mRNA in 94 cases of breast cancer. Results The overexpression of CD15 mRNA and its protein and CD44v6 mRNA and the low expression nm23H1 mRNA were correlated with the grading, clinical stage, lymph node metastasis, recurrence and prognosis of breast cancer. Patients who had overexpression of CD15 mRNA and CD44v6 mRNA and low expression of nm23H1 mRNA had a higher lymph node metastatic rate and a lower survival rate. Conclusion The expression of CD15 mRNA has a synergistic action in positive and negative regulation with that of CD44v6 mRNA and nm23H1 mRNA. Combining detection of the expression of these three mRNA is a reliable index to evaluate the matastasis, recurrence and prognosis of breast cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Breast neoplasms； Antigens, CD15； Antigens, CD44； In situ hybridization； Immunohistochemistry
恶性肿瘤形成和转移的发生是多基因、多因子共同作用的结果。探究肿瘤发生和转移的分子机制，寻找其相关的生物标志物是多年来肿瘤学基础与临床研究的主题之一。我们应用原位杂交(ISH)和免疫组织化学(IHC)方法，研究CD15 mRNA及其蛋白、CD44v6 mRNA和nm23H1 mRNA的表达与乳腺癌患者转移、复发和预后之间的相关性，并结合临床和随访资料分析，评价CD15 mRNA可否作为预测乳腺癌转移、复发和患者预后的生物学指标。
对象和方法
一、对象
标本取自中国人民解放军251医院和第二军医大学长海医院手术切除的女性乳腺癌患者癌组织，共94例。94例中浸润性导管癌50例，单纯癌20例，髓样癌7例，硬癌4例，导管内癌3例，炎性乳腺癌2例，大汗腺癌、分泌型癌和富脂质细胞癌各1例。同时取癌旁组织20例(距癌灶<2 cm)。乳腺癌诊断分型、分期及组织学分级按文献[1]介绍的方法。标本均经体积分数为10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。
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二、方法
1.试剂：鼠抗CD15s mAb、生物素化酪胺分子(BT)和催化信号放大(CSA)kit盒均购自丹麦Dako公司。生物素化抗地高辛(DIG)二抗、末端标记和Sp6/T7体外转录标记盒购自德国宝灵曼公司。nm23 H1 cDNA质粒(PGEH-42)由广州军区总医院陈晓东博士转赠。CD44v6 cDNA由英国皇家癌症研究所Ursula Gunthert博士惠赠。CD15寡核苷酸探针由中国科学院上海细胞研究所按文献[2]报道方法合成。
2.染色方法：(1)IHC染色：采用CSA法，按文献[3]报道的方法操作，H2O2-DAB显色。(2)ISH染色：①探针标记：CD15 cDNA寡核苷酸探针按末端标记试剂盒说明书操作，末端标记上DIG。 CD44v6 cDNA载体质粒PGEX-2T中CD44V2-V10，cDNA插入ECOR Ⅰ酶切位点。探针用聚合酶链反应(PCR)合成，标记上生物素，CD44v6引物参照文献[4]介绍的方法。nm23 H1 cDNA质粒(PGEH-42)经转化扩增，抽提后得到的质粒DNA经酶切使其线性化，回收DNA片段；按Sp6/T7体外转录标记kit说明书操作，并标记上DIG。②杂交前准备：新鲜组织标本用体积分数为4%多聚甲醛固定[以下一切均用焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理]24 h，新鲜系列乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，贴在涂有切片粘合剂(质量分数为1%的多聚赖氨酸)的载玻片上，58℃烤片24 h。常规脱蜡至水，磷酸盐缓冲液(PBS)洗，20 μg/ml蛋白酶K 37℃20 min，PBS洗3×3 min，0.2×柠檬酸盐缓冲液(SSC)洗 2×5 min。用体积分数为4%多聚甲醛后固定10 min，系列乙醇脱水，PBS洗3×3 min，0.2×SSC洗2×5 min。③杂交和检测：操作按文献[5]介绍的方法。H2O2-DAB显色。(3)对照设计：ISH阳性对照均按Gen Point kit内配置阳性切片为标准。经RUAase消化1 h后，作杂交为阴性对照。杂交液中不加探针结果为阴性。IHC阳性对照用CD15s阳性大肠癌作阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。(4)结果判断：IHC和ISH染色，阳性信号呈棕黄色。根据阳性细胞染色范围及强度分为3级：Ⅰ级：无明显阳性反应细胞为阴性(-);Ⅱ级：阳性细胞<50%、染色较弱者为弱阳性(+);Ⅲ级：阳性细胞>50%、染色较强者为强阳性(++)。
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3.统计学处理：差异显著性检验采用χ2检验和相关分析。差异显著性标准P<0.05。
结果
一、癌及癌旁组织中CD15 mRNA及其蛋白、CD44v6 mRNA和nm23H1mRNA的表达
IHC和ISH染色显示，CD15蛋白、CD15mRNA、CD44v6mRNA和nm23H1mRNA阳性表达产物呈棕黄色或棕褐色颗粒状或团块状，位于细胞浆内(图1～3)。94例患者的乳腺癌组织中CD15蛋白、CD15mRNA 、CD44v6mRNA和nm23H1mRNA阳性表达率分别为80%(75/94)、84%(79/94)、81%(76/94)和59%(55/94)。20例癌旁组织中其阳性表达率分别为40%(8/20)、45%(9/20)、10%(2/20)和90%(18/20)，CD15蛋白、CD15mRNA和CD44v6mRNA阳性表达率在癌组织和癌旁组织中差异有显著意义(x2=13.2, x2=17.7, x2=11.3,P值均<0.01)，nm23H1 mRNA阳性表达率在癌组织和癌旁组织中差异有显著意义(x2=5.8,P<0.01)。
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图1 乳腺癌组织CD15寡核苷酸探针染色阳性CSA-ISH法 ×400 图2 乳腺癌组织CD44 cDNA探针-b染色阳性CSA-ISH法 ×200 图3 乳腺癌组织nm23 cRNA探针-DIG染色阳性CSA-ISH法 ×200
二、癌组织中CD15蛋白、CD15mRNA、CD44v6和nm23H1mRNA表达与临床病理指标的关系
CD15 mRNA、CD44v6 mRNA及nm23H1 mRNA阳性表达与乳腺癌肿瘤大小无关(x2=2.8,P>0.05)，而与乳腺癌临床分期、组织分级和淋巴结转移密切相关(表1)。
三、癌组织中CD15 mRNA、CD44v6 mRNA和nm23H1mRNA表达与患者预后的关系
94例乳腺癌中，获得术后随访满5年以上者83例，其中5年内复发转移者61例，无复发转移者22例。5年内死亡患者52例，生存>5年者31例。在CD15 mRNA及CD44v6mRNA阳性表达的病例中术后5年内复发转移率高，生存>5年率低。在nm23H1 mRNA表达阳性的病例中术后5年复发转移率低，生存>5年率高(表2)。
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四、癌组织中CD15 mRNA表达与CD44v6mRNA和nm23H1mRNA表达的关系
在79例CD15 mRNA阳性表达的乳腺癌组织中，CD44v6 mRNA和nm23H1mRNA阳性表达者分别为71例(90%)和40例(51%),在CD15mRNA阴性表达的15例乳腺癌组织中的CD44v6 mRNA和nm23H1mRNA阳性表达者分别为5例(33%)和15例(100%) 。CD15阳性表达者CD44v6 mRNA阳性表达率明显高于CD15阴性者(x2=26.0,P<0.001)，而nm23H1mRNA阳性表达率明显低于CD15阴性者(x2=92.6,P<0.005)。乳腺癌组织中CD15mRNA表达与CD44v6 mRNA表达呈显著正相关性(r=0.53),与nm23H1 mRNA表达呈显著负相关性(r=-0.34)。在CD15mRNA、CD44v6 mRNA阳性表达和nm23H1 mRNA阴性表达的39例患者中，淋巴结转移29例(74%),患者生存>5年者5例(15%),而CD15 mRNA、CD44v6 mRNA阴性和nm23H1 mRNA阳性的10例中,淋巴结转移3例(30%),患者生存>5年者9例(90.0%),差异均有显著意义(x2=4.9,P<0.05; x2=30.9,P<0.01)。
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讨论
一、CD15 mRNA及其蛋白、CD44v6 mRNA和nm23H1 mRNA表达与乳腺癌的关系
研究发现，CD15表达与肝癌、甲状腺髓样癌、肾癌及前列腺癌的发生发展，侵袭转移和患者预后密切相关，被视为具有肿瘤预后不良的标志[6]。CD44是一种整合膜糖蛋白。CD44v6是CD44的一种变异型，其表达有助于肿瘤细胞获得转移潜能。Kaufmann等[7]采用多克隆抗体和单克隆抗体，检测了100例原发性浸润型乳腺癌、12例局灶性复发性乳腺癌、18例有乳腺癌转移的淋巴结组织，用正常乳腺组织作对照，发现正常乳腺组织中无CD44v6 表达，而在84%的原发肿瘤及100%的复发病灶和转移的淋巴结中阳性，且CD44v6表达阳性的患者的预后差，认为CD44v6可作为独立的预后指标。nm23H1基因定位于17q1/21.3-22，包含5个外显子和4个内含子，编码核苷二磷酸激酶(NDPK)。一般认为nm23H1基因具有等位基因缺失，点突变，扩增等多种变异方式，并与恶性肿瘤的高转移潜能密切相关。nm23H1 mRNA表达与乳腺癌组织学分级和淋巴结转移均呈负相关，低nm23H1表达强烈提示预后不佳[8]。我们的研究结果显示，在乳腺癌组织中CD15蛋白、CD15 mRNA和CD44v6 mRNA阳性表达率均明显高于癌旁组织，nm23H1 mRNA阳性表达率明显低于癌旁组织。随着乳腺癌的临床分期、组织学分级的增高及淋巴结转移的发生，CD15 mRNA和CD44v6 mRNA阳性表达率均明显增高，nm23H1 mRNA阳性表达率明显降低。CD15 mRNA和CD44v6 mRNA高表达和nm23H1 mRNA低表达的患者术后5年内复发和转移的机会均明显增高，存活>5年率均明显降低。说明，CD15 mRNA、CD44v6 mRNA和nm23H1mRNA表达均参与乳腺癌的发生及细胞恶性转化过程，在乳腺癌的临床进展和转移过程中起着重要作用，是预测乳腺癌肿瘤复发、转移潜能及评估患者预后不良的病理生物学指标。
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表1 乳腺癌患者癌组织中CD15mRNA及其蛋白、CD44v6 mRNA和nm23H1 mRNA表达与临床病理指标的关系(例数) 临床病
理指标
总
例数
CD15蛋白表达
CD15 mRNA表达
CD44v6 mRNA表达
nm23H1 mRNA表达
+
++
阳性率(%)
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+
++
阳性率(%)
+
++
阳性率(%)
+
++
阳性率(%)
临床分期
Ⅰ～Ⅱ
54
14
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24
70
8
34
78
8
30
70
14
23
69
Ⅲ～Ⅳ
40
6
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31
93
9
30
98
10
28
95
7
11
45
组织学分级
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Ⅰ
39
8
19
69
7
22
74
9
17
67
15
14
74
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Ⅱ～Ⅲ
55
12
36
87△
10
40
91△
9
41
91△
6
20
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47△
淋巴结转移
无
43
5
26
72
11
21
74
8
22
70
, 百拇医药
13
17
70
有
51
15
29
90▲
6
41
92▲
10
36
, 百拇医药
90▲
8
17
49▲
注:与Ⅰ～Ⅱ期比较χ2=7.7,χ2=5.9,χ2=7.5,χ2=4.3,P均<0.05；与Ⅰ级比较△χ2=4.6,χ2=4.7,χ2=8.7,χ2=6.9,P均<0.05；与无淋巴结转移比较▲χ2=5.2,χ2=4.2,χ2=6.3,χ2=4.1,P均<0.05表2 乳腺癌患者癌组织中CD15 mRNA、CD44v6 mRNA和nm23H1 mRNA表达与预后的关系(例数) 组别
, 百拇医药
总
例数
CD15mRNA
CD44v6mRNA
nm23H1mRNA
阴性
阳性
χ2值
P值
阴性
阳性
χ2值
, 百拇医药 P值
阴性
阳性
χ2值
P值
术后复发转移组
61
6
55
5.9
<0.05
9
52
, 百拇医药
6.5
<0.05
46
15
10.8
<0.05
生存>5年组
31
9
22
6.7
<0.05
11
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20
5.5
<0.05
26
5
7.7
<0.05
二、CD15mRNA、CD44v6mRNA和nm23H1mRNA在乳腺癌组织中表达的相关性及其意义
在恶性肿瘤发生的癌基因研究中，许多学者提出了基因协同作用假说，认为在恶性肿瘤发生，发展和转移的各阶段，至少有两个或两个以上功能不同的异常激活的基因各自发挥不同作用，并在时间和空间上相互配合，协同促进了细胞的癌变。CAM的功能除介导细胞间相互识别外，还参与了细胞信息传递或成为细胞内的第二信使，并行使辅助分子的功能，可将细胞内的信息传递到细胞质或细胞核。CD15与CD44v6一样同属CAM成员。本研究显示，在乳腺癌组织中CD15 mRNA表达与CD44v6 mRNA表达呈正相关，而与nm23H1mRNA表达呈负相关。CD15mRNA和CD44v6 mRNA高表达伴nm23H1mRNA低表达，与乳腺癌的复发、转移和患者的存活率关系更为密切,表明在乳腺癌的系列病理过程中，CD15与CD44v6及nm23H1具有相互影响的调节或负调节的协同作用可能。因此认为，深入探讨它们之间的作用机制，将对阐明和阻断肿瘤转移的形成具有重要价值。参考文献
, 百拇医药
1，李树玲.中国常见恶性肿瘤诊治规范.乳腺癌.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1990.59.
2，Bolos CD, Garrido M, Real FX. Mucb apomucin shows a distinct normal tisswe distribwtivn that corkelater with lewis amtigen expression in the human stomach. Gastroenterology,1995,109:723- 734.
3，倪灿荣，范森，许炳基.CSA系统在免疫组织化学中的应用.临床与实验病理学杂志，1999，15：267-269.
4，Kay F, Folker F, Lisboa BW. CD44 isoforms correlate with cellular differentiation but not with prognosis in human breast cancer. Cancer Res,1995，55:5424-5433.
, 百拇医药
5，倪灿荣，朱明华，马大烈.催化信号放大系统在原位杂交检测中的应用研究.中国组织化学与细胞化学杂志，2000，9：110-112.
6，谷化平，尚培中，纪小龙.甲状腺肿瘤中CD15抗原的表达及临床意义.中华内分泌代谢杂志，2000，16:31-33.
7，Karfmann M,Heider KH,Sinn HP,et al. CD44 variant exon epitopes in primary breast cancer and length of survival. Lancet,1995,345: 615-619.
8，Caligo MA, Cipollini G Berti A,et al.nm23 gene expression in human breast carcinoma: loss of correlation with cell proliferation in the advanced phase of tumor progression.Int Cancer,1997,74:102-111.
(收稿日期：2000-04-26), 百拇医药