中国人群凝血因子Ⅴ基因多态性与冠心病关系的研究
作者：乐玮 于金德 陆林 陶蓉 尤蓓 蔡煦 曹文俊 龚兰生
单位：乐玮 于金德 陆林 陶蓉 尤蓓 蔡煦 龚兰生(200025 上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科)；曹文俊(上海第二医科大学附属瑞金医院血液研究所、人类基因组研究重点实验室)
关键词：
中华医学杂志000219 迄今已在某些疾病中发现FV基因存在一些突变和多态性[1，2]。其中，Leiden突变[1691G→A(Arg506Gln)]恰巧位于活性蛋白C(APC)降解凝血因子V(FV)的特殊位点Arg506，其结果导致FV灭活障碍，造成高凝遗传基础[3]。研究发现家族性高凝患者中约40%～60%有Leiden突变[4]。另有报道称白种女性心肌梗死发病(388例)与Leiden突变相关[5]。但这种遗传缺陷在亚洲人种中很少见[6]。本研究在138例冠心病和173例正常对照中，运用PCR-DGGE技术对FV基因全部25个外显子进行筛查，以期明确中国人群FV基因的多态情况，并探讨该多态性与冠心病发病的关系。
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一、对象和方法
1.对象：冠心病组138例，来自上海瑞金医院心血管病房，经冠状动脉造影证实，冠状动脉内径狭窄≥70%作为诊断标准，年龄64.8岁±7.73岁，合并高血压88例，空腹血糖6.2 mmol/L±2.1 mmol/L，总胆固醇4.7 mmol/L±1.0 mmol/L，甘油三酯1.5 mmol/L±0.7 mmol/L。对照组173例，来自门诊常规体检者，经病史体检和实验室检查正常者。
2.模板DNA置备：采集冠心病组和正常对照组成员外周血10 ml，按Sambrook方法，24 h内分离并抽提白细胞DNA[7]。
3.FV全部外显子PCR扩增：FV基因全长80 kb，包括25个外显子和24个内含子。应用美国Bio-Rad公司MacMelt软件对DNA序列进行分析，设计35对引物，扩增FV基因每一外显子及其两翼部分内含子序列。根据PCR扩增片段的模拟电泳解离行为，决定在一侧引物的5’端加由40 bp碱基组成的“GC-夹”，使PCR产物一端形成Tm较高不易解链的“夹子”，DNA扩增在Perkin-Elmer 9600 PCR仪上进行，100 μl体系中含1 μg基因组DNA、1×PCR反应缓冲液[10 mmol/L Tris-HCl , pH 8.3 , 1.5 mmol/L MgCl2，和体积分数0.01%明胶]，400 μmol/L dNTP、30 pmol/L的一对引物、2.5 U Taq DNA聚合酶(Promega)。反应条件：94℃变性5 min，然后94℃45 s；46℃～53℃ 1 min；72℃ 1 min，共35个循环，72℃延伸10 min。
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4.DGGE分析：应用D GENETM System(Bio-Rad公司)，DGGE条件，聚丙烯酰胺凝胶浓度为7.5%，变形剂浓度梯度范围40%～70%(40%甲酰胺加7 mol/L尿素为100%变性剂浓度)，电泳温度50℃～60℃，电压70 V，电泳时间16～18 h。
5.受检PCR片段的测序：在DGGE电泳中发现异常条带后，将条带割下，溶于双蒸水中，用同样条件进行PCR扩增。PCR产物经QIA quick试剂盒(德国QIAGEN公司)纯化后，在ABI 377测序仪上进行直接测序。
6.统计分析：应用χ2检验。
二、结果
138例冠心病和173例对照经PCR-DGGE检测发现5种FV基因多态性。测序证实这些多态性为：2号外显子327A→G(Gln51)，4号外显子642G→T(Ser156)，10号外显子1628G→A(Arg485Lys)，13号外显子4070A→G(His1299Arg)，16号外显子5380G→A(Val1736Met)。其中1628G→A导致氨基酸置换Arg→Lys，在138例冠心病患者和173例正常对照之间多态等位基因频率差异有非常显著意义(χ2=6.908，P<0.01)。其他多态性327A→G、642G→T、4070A→G、5380G→A的分布在冠心病和正常对照之间无差异。327A→G多态性为首次报道。
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三、讨论
FV基因位于1q21-25，其蛋白结构有6个结构域：3个A区、1个B区和2个C区，排列顺序为A1-A2-B-A3-C1-C2[8]，每一A区结构域中含有一个由26个相同氨基酸残基组成的α环。另外，FV有7个二硫键，其中3个位于α环上：即α1环(139-165)、α2环(472-492)和α3环(1697-1723)，这些二硫键区域均高度保守。
Leiden突变位于APC降解FV的位点，导致FV灭活障碍，引起APC抵抗。与之相吻合的是，研究发现Leiden突变杂合子的血栓形成危险性比正常人高5～10倍，而突变纯合子则高50～100倍。还有报道称FV的Leiden突变与冠心病、心肌梗死发病存在相关性[5]，但FV Leiden突变主要分布于欧洲人群，在亚洲人群中几乎不存在[6]。我们在138例冠心病患者和173例正常对照中也未检测到 Leiden突变，此结果支持上述报导。
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本研究发现了5个FV基因多态性。统计表明在冠心病组和正常对照组之间，1628G→A (Arg→Lys)多态等位基因频率差异有显著意义，此多态性氨基酸置换位点位于A2结构域的α2环上，毗邻APC灭活FV的位点Arg506，推测1628G→A(Arg485lys)可能一定程度上改变了特定区域的空间构象，使APC灭活FV受到影响，从而对冠心病的发生发展起促进作用。据此认为该多态性与冠心病发病有关，可能是冠心病的危险因素之一，这些假设有待进一步研究证实。
本研究所检测到的327A→G是新发现多态性，未引起氨基酸改变，在冠心病和对照组之间等位基因频率无差异，其余3个多态性等位基因频率也无差异。我们未检测到其他研究小组报告的1090A→G突变[2]及3844T→C、3943C→A多态性[1]。
基金项目：上海市科委重大基础研究基金资助项目
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参考文献
[1]Lunghi B, Lacoviello L, Germmati D, et al. Detection of new polymorphic markers in the factor V gene: Association with factor V levels in plasma. Thromb Haemostasis, 1996,75:45-48.
[2]Chan WP, Lee CK, Kwong YL, et al. A novel mutation of Arg306 of factor V gene in Hong Kong Chinese. Blood, 1998,91:1135-1139.
[3]Griffin JH, Evatt B, Wideman C, et al. Anticoagulant protein C pathway defective in majority of thrombophilic patients. Blood, 1993,82:1989-1993.
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[4]Dahlback B. Resistance to activated protein C as a risk factor for thrombosis. Semin-Hematol, 1997,34:217-234.
[5]Rosendaal RF, Siscovick DS, Schwartz SM, et al. Factor V Leiden (resistance to activated protein C) increases the risk of myocardial infarction in young women. Blood, 1997,89:2817-2821.
[6]Rees DC, Cox M, Clegg JB. World distribution of factor V leiden. Lancet, 1995,346:1133-1134.
[7]Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
[8]Kalafatis M, Mann KG. Factor V Leiden and thrombophilia. Arteriosclero Thromb Vasc Biol, 1997,17:620-627.
收稿日期：1999-05-26, http://www.100md.com
单位：乐玮 于金德 陆林 陶蓉 尤蓓 蔡煦 龚兰生(200025 上海第二医科大学附属瑞金医院心脏科)；曹文俊(上海第二医科大学附属瑞金医院血液研究所、人类基因组研究重点实验室)
关键词：
中华医学杂志000219 迄今已在某些疾病中发现FV基因存在一些突变和多态性[1，2]。其中，Leiden突变[1691G→A(Arg506Gln)]恰巧位于活性蛋白C(APC)降解凝血因子V(FV)的特殊位点Arg506，其结果导致FV灭活障碍，造成高凝遗传基础[3]。研究发现家族性高凝患者中约40%～60%有Leiden突变[4]。另有报道称白种女性心肌梗死发病(388例)与Leiden突变相关[5]。但这种遗传缺陷在亚洲人种中很少见[6]。本研究在138例冠心病和173例正常对照中，运用PCR-DGGE技术对FV基因全部25个外显子进行筛查，以期明确中国人群FV基因的多态情况，并探讨该多态性与冠心病发病的关系。
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一、对象和方法
1.对象：冠心病组138例，来自上海瑞金医院心血管病房，经冠状动脉造影证实，冠状动脉内径狭窄≥70%作为诊断标准，年龄64.8岁±7.73岁，合并高血压88例，空腹血糖6.2 mmol/L±2.1 mmol/L，总胆固醇4.7 mmol/L±1.0 mmol/L，甘油三酯1.5 mmol/L±0.7 mmol/L。对照组173例，来自门诊常规体检者，经病史体检和实验室检查正常者。
2.模板DNA置备：采集冠心病组和正常对照组成员外周血10 ml，按Sambrook方法，24 h内分离并抽提白细胞DNA[7]。
3.FV全部外显子PCR扩增：FV基因全长80 kb，包括25个外显子和24个内含子。应用美国Bio-Rad公司MacMelt软件对DNA序列进行分析，设计35对引物，扩增FV基因每一外显子及其两翼部分内含子序列。根据PCR扩增片段的模拟电泳解离行为，决定在一侧引物的5’端加由40 bp碱基组成的“GC-夹”，使PCR产物一端形成Tm较高不易解链的“夹子”，DNA扩增在Perkin-Elmer 9600 PCR仪上进行，100 μl体系中含1 μg基因组DNA、1×PCR反应缓冲液[10 mmol/L Tris-HCl , pH 8.3 , 1.5 mmol/L MgCl2，和体积分数0.01%明胶]，400 μmol/L dNTP、30 pmol/L的一对引物、2.5 U Taq DNA聚合酶(Promega)。反应条件：94℃变性5 min，然后94℃45 s；46℃～53℃ 1 min；72℃ 1 min，共35个循环，72℃延伸10 min。
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4.DGGE分析：应用D GENETM System(Bio-Rad公司)，DGGE条件，聚丙烯酰胺凝胶浓度为7.5%，变形剂浓度梯度范围40%～70%(40%甲酰胺加7 mol/L尿素为100%变性剂浓度)，电泳温度50℃～60℃，电压70 V，电泳时间16～18 h。
5.受检PCR片段的测序：在DGGE电泳中发现异常条带后，将条带割下，溶于双蒸水中，用同样条件进行PCR扩增。PCR产物经QIA quick试剂盒(德国QIAGEN公司)纯化后，在ABI 377测序仪上进行直接测序。
6.统计分析：应用χ2检验。
二、结果
138例冠心病和173例对照经PCR-DGGE检测发现5种FV基因多态性。测序证实这些多态性为：2号外显子327A→G(Gln51)，4号外显子642G→T(Ser156)，10号外显子1628G→A(Arg485Lys)，13号外显子4070A→G(His1299Arg)，16号外显子5380G→A(Val1736Met)。其中1628G→A导致氨基酸置换Arg→Lys，在138例冠心病患者和173例正常对照之间多态等位基因频率差异有非常显著意义(χ2=6.908，P<0.01)。其他多态性327A→G、642G→T、4070A→G、5380G→A的分布在冠心病和正常对照之间无差异。327A→G多态性为首次报道。
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三、讨论
FV基因位于1q21-25，其蛋白结构有6个结构域：3个A区、1个B区和2个C区，排列顺序为A1-A2-B-A3-C1-C2[8]，每一A区结构域中含有一个由26个相同氨基酸残基组成的α环。另外，FV有7个二硫键，其中3个位于α环上：即α1环(139-165)、α2环(472-492)和α3环(1697-1723)，这些二硫键区域均高度保守。
Leiden突变位于APC降解FV的位点，导致FV灭活障碍，引起APC抵抗。与之相吻合的是，研究发现Leiden突变杂合子的血栓形成危险性比正常人高5～10倍，而突变纯合子则高50～100倍。还有报道称FV的Leiden突变与冠心病、心肌梗死发病存在相关性[5]，但FV Leiden突变主要分布于欧洲人群，在亚洲人群中几乎不存在[6]。我们在138例冠心病患者和173例正常对照中也未检测到 Leiden突变，此结果支持上述报导。
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本研究发现了5个FV基因多态性。统计表明在冠心病组和正常对照组之间，1628G→A (Arg→Lys)多态等位基因频率差异有显著意义，此多态性氨基酸置换位点位于A2结构域的α2环上，毗邻APC灭活FV的位点Arg506，推测1628G→A(Arg485lys)可能一定程度上改变了特定区域的空间构象，使APC灭活FV受到影响，从而对冠心病的发生发展起促进作用。据此认为该多态性与冠心病发病有关，可能是冠心病的危险因素之一，这些假设有待进一步研究证实。
本研究所检测到的327A→G是新发现多态性，未引起氨基酸改变，在冠心病和对照组之间等位基因频率无差异，其余3个多态性等位基因频率也无差异。我们未检测到其他研究小组报告的1090A→G突变[2]及3844T→C、3943C→A多态性[1]。
基金项目：上海市科委重大基础研究基金资助项目
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参考文献
[1]Lunghi B, Lacoviello L, Germmati D, et al. Detection of new polymorphic markers in the factor V gene: Association with factor V levels in plasma. Thromb Haemostasis, 1996,75:45-48.
[2]Chan WP, Lee CK, Kwong YL, et al. A novel mutation of Arg306 of factor V gene in Hong Kong Chinese. Blood, 1998,91:1135-1139.
[3]Griffin JH, Evatt B, Wideman C, et al. Anticoagulant protein C pathway defective in majority of thrombophilic patients. Blood, 1993,82:1989-1993.
, 百拇医药
[4]Dahlback B. Resistance to activated protein C as a risk factor for thrombosis. Semin-Hematol, 1997,34:217-234.
[5]Rosendaal RF, Siscovick DS, Schwartz SM, et al. Factor V Leiden (resistance to activated protein C) increases the risk of myocardial infarction in young women. Blood, 1997,89:2817-2821.
[6]Rees DC, Cox M, Clegg JB. World distribution of factor V leiden. Lancet, 1995,346:1133-1134.
[7]Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
[8]Kalafatis M, Mann KG. Factor V Leiden and thrombophilia. Arteriosclero Thromb Vasc Biol, 1997,17:620-627.
收稿日期：1999-05-26, http://www.100md.com