鼻粘膜纤毛细胞的分离及观察
作者：苏振伦 孙燕荣 杨伟炎 姜泗长
单位：：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科
关键词：；鼻粘膜；细胞分离；纤毛；细胞存活
中华耳鼻咽喉科杂志980403 【摘要】 目的 为从细胞水平研究鼻粘膜纤毛上皮的生理功能，建立豚鼠鼻粘膜纤毛细胞的分离方法，提出单离纤毛细胞活性鉴定标准。方法 利用木瓜蛋白酶消化及机械分离法分离出豚鼠鼻粘膜单个纤毛细胞，用配备相差或微分干涉相衬(differential interference contrast , DIC)装置的倒置显微镜在100倍油镜下(总放大率1 000倍)观察。结果 从每只豚鼠的鼻粘膜平均可分离出单离纤毛细胞(12 587±2 437)个。活性良好的单离纤毛细胞的纤毛运动活跃，双折射性良好，质膜光滑，细胞无水肿或皱缩，可存活2～9h以上。观察到纤毛呈来回摆动，具有快慢相，运动方向相同但不同步，运动速率为51～119次/min。结论 本实验建立了豚鼠鼻粘膜纤毛细胞分离方法和单离纤毛细胞活性判断标准，观察了纤毛运动方式和频率。
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Isolation and observation of ciliated cells from guinea pig's nasal epithelium Su Zhenlun, Sun Yanrong, Yang Weiyan, et al. PLA General Hospital, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To investigate nasal physiological function at a cellular level and to establish a method for isolating single ciliated cells from guinea pig's nasal epithelium. Methods The ciliated cells were isolated by means of mechanical dissociation after papain treatment and a differential interference contrast (DIC) microscope was used for 1000-fold observation ( objective lens:100-fold; eye piece:10-fold) . Results A total of 12 587 single ciliated cells could be isolated from nasal epithelium of each guinea pig. The criteria for good viability of isolated nasal ciliated cells include: (1) actively motile cilia; (2) a smooth cytoplasmic membrane; (3) cytoplasm in a state of translucence (birefringence); (4) cells neither swollen nor shrunk. With short term culture at room temperature ,the isolated nasal ciliated cells retained a good viability for 2～9 hours or longer. The living ciliated cells showed swing motions of cilia with fast and slow phases at a rate of 51～119 times per minute. Conclusion A method for isolating ciliated cells from guinea pig's nasal epithelium and a criteria for good viability of isolated ciliated cells have been established. Ciliary motion pattern and ciliary beating frequency were also studied.
, 百拇医药
【Key words】 Nasal mucosa Cell separation Cilia Cell survival
鼻粘膜纤毛上皮通过其纤毛和粘液毡的活动对上呼吸道有重要的清洁和保护功能，并通过细胞顶膜上的钠和氯离子通道调节粘液毡的粘稠度和厚度，以保证鼻腔功能的正常进行[1,2]。为了从细胞水平研究鼻粘膜的上述功能，分离并初步观察了单个鼻粘膜纤毛细胞(以下简称单离纤毛细胞)的形态和纤毛活动。
材料与方法
一、细胞分离
实验动物为体重180～280 g白色健康豚鼠7只。戊巴比妥钠每公斤体重60 mg腹腔注射，断头后暴露鼻腔，取出鼻粘膜，剪碎后置入含木瓜蛋白酶(0.5 g/L, Calbiochem,美国)和L-半胱氨酸(0.33 g/L)的D-Hanks液(Sigma，美国)中。在37℃下连续轻微震荡消化1 h, Hanks液洗脱，用1 ml移液器吹打5 min，1 000 r/min离心1 min，弃上清液。沉淀物用4 ml Hanks液制成细胞悬液，移入培养皿进行光镜观察。
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二、光学显微镜观察
倒置显微镜(Axiovert 35, Zeiss，德国)配备有落射荧光、相差及微分干涉相衬(differential interference contrast , DIC)装置。用DIC在100倍油镜下观察(总放大率1 000倍)。
1.单离纤毛细胞计数：每只豚鼠取细胞悬液10 μ1共8～10份，以活跃的纤毛运动为标志，计算每10 μl溶液中的单离纤毛细胞数，求出平均值，再按细胞悬液容积4 ml算出单离纤毛细胞总数。
2.纤毛动态观察：由于纤毛数目多，其活动又不同步而呈交错状态，纤毛运动频率用以下三种方法测定：①聚焦于边缘部的一根或一束纤毛，测定其运动频率；②扫描电镜下纤毛上段附有一球形膨大部[2]，在光镜下则呈一致密黑点，聚焦于其中一点测量运动频率；③在某些条件下纤毛运动同步化，则细胞呈心脏搏动状，根据细胞搏动测量运动频率。每个细胞共测定3次，每次1min，取每分钟完成来回运动次数的平均值作为纤毛运动频率。
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结果
一、 单离纤毛细胞的数目及形态
从每只动物可分出鼻粘膜单离纤毛细胞约(12 587±2 437)个(
±s，n=3)。另外尚有未分离的丛状聚集的纤毛细胞，数量更多，未予计数。
单离纤毛细胞呈椭圆形，直径约10～12 μm，其顶膜与底侧膜界限分明，顶膜上伸出数目众多的不停摆动的纤毛(图1)。图1中尚有其它多种单离细胞，根据活体形态初步判断有：①肥大细胞：圆形，质膜光滑，直径约10 μm，胞质中有相当多的分泌颗粒；②杯状细胞：有极性，其分泌极有密集的分泌颗粒；③吞噬细胞、红细胞和淋巴细胞。准确定性尚需特殊染色，如爱先蓝(alcian blue)染色(杯状细胞)和甲苯胺蓝(toluidine blue)染色(肥大细胞)。
, 百拇医药 二、单离纤毛细胞活性鉴定及存活时间
单离纤毛细胞活性良好的最主要标志为纤毛运动活跃，若细胞活性减退，则纤毛运动逐渐减弱，最终运动中止。此后即陆续出现细胞变性的形态学表现：①双折射性减弱，活性良好的细胞具有双折射性，即在相差或DIC光学系统下细胞呈半透明状态，若变性则细胞透明度增加；②活性良好的细胞质膜光滑，变性时细胞表面出现水泡状或颗粒状物；③细胞变性时出现皱缩或水肿，纤毛分布散乱(图2)。曾试用荧光素二乙酸酯( fluoresceindi acetate，FDA)和普匹碘铵(propidium iodide, PI)双重荧光标记法鉴定细胞活性，因仅有部分标本染色成功，故未采用此项标准。
对25个单离纤毛细胞进行连续观察，以纤毛运动活跃1 000倍光镜下纤毛呈快速摆动为指标，见细胞在分离后保持良好活性的时间持续至2 h者计有2个，3 h 1个，4 h 2个，6 h 2个，7 h 4个，8 h 8个，9h以上6个。当纤毛停止运动后约 1 h，细胞出现双折射现象减弱及质膜上小泡状改变。6 h后细胞变为圆形，透明，核清晰可见，变性严重者质膜上有大泡状隆起，或呈皱缩状，但纤毛仍存在。最终细胞崩解死亡。
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三、纤毛活动
纤毛从细胞顶膜伸出，数目众多。在光镜下从上面观时纤毛如丝绒状，呈和谐的颤动。从侧面观时因纤毛运动多不同步而呈此起彼伏状，若聚焦于一根或一束纤毛则见其来回摆动，具有快慢相，快相为“效验期(effective stroke)”, 慢相为“恢复期(recovery stroke) ”，所有纤毛的快相均指向同一方向。测量了5个细胞的纤毛运动频率，分别为每分钟51、83、91、92及119次。纤毛运动活跃与否除与运动频率有关外，主要与活动纤毛的数目有关，即当细胞活性减退时，活动纤毛数减少，但每根纤毛的运动频率并不一定减小。观察到一个搏动细胞的运动频率在5min内从108次/分渐减至78次/分，再减至62次/分, 很快停止搏动，1 h后发生变性。在几个FDA染色成功(呈绿色荧光)的细胞观察到用450～490 nm激发光照射时纤毛运动立即停止；而FDA染色不成功或FDA荧光退色后，光照不能影响纤毛运动。
讨论
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鼻腔纤毛上皮具有重要的保护和清洁功能，利用单离纤毛细胞进行实验将能补充对在体或离体组织进行实验所得的资料，并从细胞水平研究鼻粘膜纤毛上皮的生理活动及其功能。本实验对单离纤毛细胞进行了活性鉴定，连续观察到其存活时间达2～9 h以上，其中大部分(72%)可存活7～9 h以上，可望用于单细胞电生理急性实验。若要观察长期的生理和病理现象则需进行细胞培养[4]。少数细胞存活时间较短可能与分离过程中的损伤有关，但更可能的因素是纤毛运动为一耗能过程，尤其在细胞呈搏动状时所需能量更大，本实验中即观察到一个搏动细胞运动频率在5 min内从108次/分渐减至0，1 h后发生变性，即可能为能量耗竭所致。
本实验观察了单离纤毛细胞的形态和纤毛运动，发现其顶膜上突起的纤毛数目众多，光镜下无法计数。据文献报道每个细胞的纤毛数可多达300根[3]，为了准确计数尚需进行扫描电镜观察。本实验还研究了纤毛运动方式和运动频率，观察到了文献报道的纤毛运动的“效验期”和“恢复期”两相，但所测出的纤毛运动频率较文献报道的250次/分为慢，其原因可能是测量方法不同，文献中采用的方法是用40倍镜头聚焦于一簇细胞，记录纤毛整体运动，本实验则用100倍油镜(总放大率1 000倍)在DIC光学系统下聚焦于一根或一束纤毛，测量其来回摆动。由于其来回摆动不同步，呈此起彼伏状，整体运动频率显然会快得多。
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图1 活性良好的鼻粘膜单离纤毛细胞，顶漠与底侧膜界限分明，箭头所指为从顶膜突起的纤毛，正朝相同方向运动。其它单离细胞可能有肥大细胞(1)、杯状细胞(2)和吞噬细胞(3)(确切定性尚需特殊染色)，以及红细胞和淋巴细胞 图2 变性的鼻粘膜单离纤毛细胞，纤毛运动停止，细胞水肿，双折射性减弱，细胞透明度增加，核清晰可见。标尺长度10μm(图1和图2适用同一标尺)
参考文献
1Jeffery PK, Li D. Airway mucosa: secretory cells, mucus and mucin genes. Eur Respir J ,1997, 10: 1655-1662.
2Benali R, Pierrot D, Zahm JM, et al. Effect of extracellular ATP and UTP on fluid transport by human nasal epithelial cells in culture. Am J Respir Cell Mol Biol , 1994, 10: 363-368.
, 百拇医药
3Friedmann I. Nose, Throat and Ears. First edition. Edinburgh: Churchill Livingstone, 1986. 3-13.
4Wu R, Yankaskas J, Cheng E, et al. Growth and differentiation of human nasal epithelial cells in culture. Serum-free, hormone-supplemented medium and proteoglycan synthesis. Am Rev Respir Dis, 1985, 132: 311-320.
(收稿：1997-08-07 修回：1998-03-06), http://www.100md.com
单位：：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科
关键词：；鼻粘膜；细胞分离；纤毛；细胞存活
中华耳鼻咽喉科杂志980403 【摘要】 目的 为从细胞水平研究鼻粘膜纤毛上皮的生理功能，建立豚鼠鼻粘膜纤毛细胞的分离方法，提出单离纤毛细胞活性鉴定标准。方法 利用木瓜蛋白酶消化及机械分离法分离出豚鼠鼻粘膜单个纤毛细胞，用配备相差或微分干涉相衬(differential interference contrast , DIC)装置的倒置显微镜在100倍油镜下(总放大率1 000倍)观察。结果 从每只豚鼠的鼻粘膜平均可分离出单离纤毛细胞(12 587±2 437)个。活性良好的单离纤毛细胞的纤毛运动活跃，双折射性良好，质膜光滑，细胞无水肿或皱缩，可存活2～9h以上。观察到纤毛呈来回摆动，具有快慢相，运动方向相同但不同步，运动速率为51～119次/min。结论 本实验建立了豚鼠鼻粘膜纤毛细胞分离方法和单离纤毛细胞活性判断标准，观察了纤毛运动方式和频率。
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Isolation and observation of ciliated cells from guinea pig's nasal epithelium Su Zhenlun, Sun Yanrong, Yang Weiyan, et al. PLA General Hospital, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To investigate nasal physiological function at a cellular level and to establish a method for isolating single ciliated cells from guinea pig's nasal epithelium. Methods The ciliated cells were isolated by means of mechanical dissociation after papain treatment and a differential interference contrast (DIC) microscope was used for 1000-fold observation ( objective lens:100-fold; eye piece:10-fold) . Results A total of 12 587 single ciliated cells could be isolated from nasal epithelium of each guinea pig. The criteria for good viability of isolated nasal ciliated cells include: (1) actively motile cilia; (2) a smooth cytoplasmic membrane; (3) cytoplasm in a state of translucence (birefringence); (4) cells neither swollen nor shrunk. With short term culture at room temperature ,the isolated nasal ciliated cells retained a good viability for 2～9 hours or longer. The living ciliated cells showed swing motions of cilia with fast and slow phases at a rate of 51～119 times per minute. Conclusion A method for isolating ciliated cells from guinea pig's nasal epithelium and a criteria for good viability of isolated ciliated cells have been established. Ciliary motion pattern and ciliary beating frequency were also studied.
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【Key words】 Nasal mucosa Cell separation Cilia Cell survival
鼻粘膜纤毛上皮通过其纤毛和粘液毡的活动对上呼吸道有重要的清洁和保护功能，并通过细胞顶膜上的钠和氯离子通道调节粘液毡的粘稠度和厚度，以保证鼻腔功能的正常进行[1,2]。为了从细胞水平研究鼻粘膜的上述功能，分离并初步观察了单个鼻粘膜纤毛细胞(以下简称单离纤毛细胞)的形态和纤毛活动。
材料与方法
一、细胞分离
实验动物为体重180～280 g白色健康豚鼠7只。戊巴比妥钠每公斤体重60 mg腹腔注射，断头后暴露鼻腔，取出鼻粘膜，剪碎后置入含木瓜蛋白酶(0.5 g/L, Calbiochem,美国)和L-半胱氨酸(0.33 g/L)的D-Hanks液(Sigma，美国)中。在37℃下连续轻微震荡消化1 h, Hanks液洗脱，用1 ml移液器吹打5 min，1 000 r/min离心1 min，弃上清液。沉淀物用4 ml Hanks液制成细胞悬液，移入培养皿进行光镜观察。
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二、光学显微镜观察
倒置显微镜(Axiovert 35, Zeiss，德国)配备有落射荧光、相差及微分干涉相衬(differential interference contrast , DIC)装置。用DIC在100倍油镜下观察(总放大率1 000倍)。
1.单离纤毛细胞计数：每只豚鼠取细胞悬液10 μ1共8～10份，以活跃的纤毛运动为标志，计算每10 μl溶液中的单离纤毛细胞数，求出平均值，再按细胞悬液容积4 ml算出单离纤毛细胞总数。
2.纤毛动态观察：由于纤毛数目多，其活动又不同步而呈交错状态，纤毛运动频率用以下三种方法测定：①聚焦于边缘部的一根或一束纤毛，测定其运动频率；②扫描电镜下纤毛上段附有一球形膨大部[2]，在光镜下则呈一致密黑点，聚焦于其中一点测量运动频率；③在某些条件下纤毛运动同步化，则细胞呈心脏搏动状，根据细胞搏动测量运动频率。每个细胞共测定3次，每次1min，取每分钟完成来回运动次数的平均值作为纤毛运动频率。
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结果
一、 单离纤毛细胞的数目及形态
从每只动物可分出鼻粘膜单离纤毛细胞约(12 587±2 437)个(
±s，n=3)。另外尚有未分离的丛状聚集的纤毛细胞，数量更多，未予计数。单离纤毛细胞呈椭圆形，直径约10～12 μm，其顶膜与底侧膜界限分明，顶膜上伸出数目众多的不停摆动的纤毛(图1)。图1中尚有其它多种单离细胞，根据活体形态初步判断有：①肥大细胞：圆形，质膜光滑，直径约10 μm，胞质中有相当多的分泌颗粒；②杯状细胞：有极性，其分泌极有密集的分泌颗粒；③吞噬细胞、红细胞和淋巴细胞。准确定性尚需特殊染色，如爱先蓝(alcian blue)染色(杯状细胞)和甲苯胺蓝(toluidine blue)染色(肥大细胞)。
, 百拇医药 二、单离纤毛细胞活性鉴定及存活时间
单离纤毛细胞活性良好的最主要标志为纤毛运动活跃，若细胞活性减退，则纤毛运动逐渐减弱，最终运动中止。此后即陆续出现细胞变性的形态学表现：①双折射性减弱，活性良好的细胞具有双折射性，即在相差或DIC光学系统下细胞呈半透明状态，若变性则细胞透明度增加；②活性良好的细胞质膜光滑，变性时细胞表面出现水泡状或颗粒状物；③细胞变性时出现皱缩或水肿，纤毛分布散乱(图2)。曾试用荧光素二乙酸酯( fluoresceindi acetate，FDA)和普匹碘铵(propidium iodide, PI)双重荧光标记法鉴定细胞活性，因仅有部分标本染色成功，故未采用此项标准。
对25个单离纤毛细胞进行连续观察，以纤毛运动活跃1 000倍光镜下纤毛呈快速摆动为指标，见细胞在分离后保持良好活性的时间持续至2 h者计有2个，3 h 1个，4 h 2个，6 h 2个，7 h 4个，8 h 8个，9h以上6个。当纤毛停止运动后约 1 h，细胞出现双折射现象减弱及质膜上小泡状改变。6 h后细胞变为圆形，透明，核清晰可见，变性严重者质膜上有大泡状隆起，或呈皱缩状，但纤毛仍存在。最终细胞崩解死亡。
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三、纤毛活动
纤毛从细胞顶膜伸出，数目众多。在光镜下从上面观时纤毛如丝绒状，呈和谐的颤动。从侧面观时因纤毛运动多不同步而呈此起彼伏状，若聚焦于一根或一束纤毛则见其来回摆动，具有快慢相，快相为“效验期(effective stroke)”, 慢相为“恢复期(recovery stroke) ”，所有纤毛的快相均指向同一方向。测量了5个细胞的纤毛运动频率，分别为每分钟51、83、91、92及119次。纤毛运动活跃与否除与运动频率有关外，主要与活动纤毛的数目有关，即当细胞活性减退时，活动纤毛数减少，但每根纤毛的运动频率并不一定减小。观察到一个搏动细胞的运动频率在5min内从108次/分渐减至78次/分，再减至62次/分, 很快停止搏动，1 h后发生变性。在几个FDA染色成功(呈绿色荧光)的细胞观察到用450～490 nm激发光照射时纤毛运动立即停止；而FDA染色不成功或FDA荧光退色后，光照不能影响纤毛运动。
讨论
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鼻腔纤毛上皮具有重要的保护和清洁功能，利用单离纤毛细胞进行实验将能补充对在体或离体组织进行实验所得的资料，并从细胞水平研究鼻粘膜纤毛上皮的生理活动及其功能。本实验对单离纤毛细胞进行了活性鉴定，连续观察到其存活时间达2～9 h以上，其中大部分(72%)可存活7～9 h以上，可望用于单细胞电生理急性实验。若要观察长期的生理和病理现象则需进行细胞培养[4]。少数细胞存活时间较短可能与分离过程中的损伤有关，但更可能的因素是纤毛运动为一耗能过程，尤其在细胞呈搏动状时所需能量更大，本实验中即观察到一个搏动细胞运动频率在5 min内从108次/分渐减至0，1 h后发生变性，即可能为能量耗竭所致。
本实验观察了单离纤毛细胞的形态和纤毛运动，发现其顶膜上突起的纤毛数目众多，光镜下无法计数。据文献报道每个细胞的纤毛数可多达300根[3]，为了准确计数尚需进行扫描电镜观察。本实验还研究了纤毛运动方式和运动频率，观察到了文献报道的纤毛运动的“效验期”和“恢复期”两相，但所测出的纤毛运动频率较文献报道的250次/分为慢，其原因可能是测量方法不同，文献中采用的方法是用40倍镜头聚焦于一簇细胞，记录纤毛整体运动，本实验则用100倍油镜(总放大率1 000倍)在DIC光学系统下聚焦于一根或一束纤毛，测量其来回摆动。由于其来回摆动不同步，呈此起彼伏状，整体运动频率显然会快得多。
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图1 活性良好的鼻粘膜单离纤毛细胞，顶漠与底侧膜界限分明，箭头所指为从顶膜突起的纤毛，正朝相同方向运动。其它单离细胞可能有肥大细胞(1)、杯状细胞(2)和吞噬细胞(3)(确切定性尚需特殊染色)，以及红细胞和淋巴细胞 图2 变性的鼻粘膜单离纤毛细胞，纤毛运动停止，细胞水肿，双折射性减弱，细胞透明度增加，核清晰可见。标尺长度10μm(图1和图2适用同一标尺)
参考文献
1Jeffery PK, Li D. Airway mucosa: secretory cells, mucus and mucin genes. Eur Respir J ,1997, 10: 1655-1662.
2Benali R, Pierrot D, Zahm JM, et al. Effect of extracellular ATP and UTP on fluid transport by human nasal epithelial cells in culture. Am J Respir Cell Mol Biol , 1994, 10: 363-368.
, 百拇医药
3Friedmann I. Nose, Throat and Ears. First edition. Edinburgh: Churchill Livingstone, 1986. 3-13.
4Wu R, Yankaskas J, Cheng E, et al. Growth and differentiation of human nasal epithelial cells in culture. Serum-free, hormone-supplemented medium and proteoglycan synthesis. Am Rev Respir Dis, 1985, 132: 311-320.
(收稿：1997-08-07 修回：1998-03-06), http://www.100md.com