汞对大鼠肺泡巨噬细胞TNF-α和NO生成的影响
作者：朱心强 郑一凡 常艳 张群卫
单位：张群卫(日本福井医科大学环境保健研究室)；朱心强 郑一凡 常艳(浙江大学医学院卫生毒理研究室，杭州 310006)
关键词：氯化汞；肺泡巨噬细胞；肿瘤坏死因子-α；一氧化氮
卫生毒理学杂志000403 摘要 【目的】 比较Brown Norway(BN)和Levis(LE)两种品系大鼠肺泡巨噬细胞产生肿瘤坏死因子(TNF-α)和一氧化氮(NO)的能力及对氯化汞的反应是否存在差别。【方法】 用肺泡灌洗法收集肺泡巨噬细胞进行培养，加入不同浓度的氯化汞(0.1～30 μmol/L)，处理不同的时间(12～96 h)后，测定培养基中LDH的相对活性，以反映细胞毒性，并测定TNF-α和亚硝酸盐的含量。【结果】 氯化汞在3 μmol/L以下，培养48 h对肺泡巨噬细胞无明显细胞毒性。对照组BN和LW品系TNF-α的浓度分别为(609.45±111.94)pg/ml和(340.62±44.74)pg/ml，两者相比，差异有显著性。亚硝酸盐的浓度分别为(1.868±0.165)μmol/ml和(1.313±0.084)μmol/ml，差异也有显著性。氯化汞对TNF-α和NO的生成都有一定程度的抑制。【结论】 两种品系大鼠肺泡巨噬细胞体外生成TNF-α和NO的量有所不同，氯化汞能抑制两种品系大鼠的肺泡巨噬细胞产生TNF-α和NO，抑制作用以BN品系为明显，但总的趋势相似。
, 百拇医药
The effects of mercuric chloride on the production of TNF-α and nitric oxide of the alveolar macrophages originated from different strains of rats
ZHU Xin-qiang,ZHENG Yi-fan,CHANG Yan
(Department of Toxicology,Medical College,Zhejiang University,Hangzhou 310006,China)
Abstract:【Objective】 To compare the strain differences of tumor necrosis factor alpha(TNF-α) and nitric oxide (NO)production of alveolar macrophages(AMs)originated from Brown Norway(BN) and Lewis(LW)rats.【Methods】 The AMs were collected by the bronchoalveolar lavage method,and exposed to concentrations of HgCl2(0.1～30 μmol/L) for fifferent times(12～96 h).The relative LDH activities in the medium were measured to assess the cytotoxicity.The TNF-α concentration was measured by an ELISA kit and the nitrite was detected with Griess regent.【Results】 The HgCl2 was not cytotoxic to the AMs at the concentration of 3 μmol/L within 72 h of incubation.In the control groups the concentrations of TNF-α and nitrite were (609.45±111.94)pg/m and (1.868±0.165)μmol/ml,respectively,in BN,which were significantly higher than those in LW strain[(340.62±44.7)pg/ml and (1.313±0.084)μmol/ml].The production of TNF-α and NO in both strains were inhibited to some extent by mercuric chloride.【Conclusion】 There are some strain differences in the production of TNF-α and NO between BN and LW strain of rats.Mercuric chloride inhibited the production of TNF-α and NO.The inhibitory trends were more serious in BN compared with those in LW.
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Key words：Mercuric chloride; Alveolar macrophages; TNF-α; Nitric oxide
汞是最古老的毒物之一，除了能引起中枢神经系统、血液、肾脏等多种器官损害之外，还具有免疫毒性。汞的免疫毒性主要表现在两个方面，大剂量急性接触可以引起免疫抑制，使机体抗感染能力降低；小剂量反复接触则可以引起自身免疫性疾病，如自身免疫性肾炎等[1]。汞引起的自身免疫反应的敏感性与实验动物的遗传因素密切相关，不同品系的大鼠或小鼠敏感性相差很大，如Brown Norway大鼠非常敏感，而Lewis大鼠则不敏感。因此这两种品系的大鼠也是研究汞引起的自身免疫反应最常用的动物模型。但这种敏感性差异的机制至今尚未完全明了。一般认为辅助T细胞亚群Th1/Th2失衡是主要原因，即在敏感品系主要引起Th2型反应，而在耐受品系主要引起Th1型反应[2]。但最近发现Th1\,Th2型反应在汞引起的自身免疫反应中均起作用[3]，还与干扰素-γ等多种细胞因子的调节有关[4]。由于各种细胞因子之间的关系极为复杂，目前尚缺乏对经过汞处理的动物体内各种细胞因子总体情况的了解，因此限制了对有关机制的进一步认识。许多研究表明肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)与自身免疫反应有密切关系[5，6]。因此，不同品系动物之间这两种前炎症反应因子的产生也可能存在着差异。因为汞的职业性接触主要通过呼吸道，所以肺泡巨噬细胞往往是首先接触。而且巨噬细胞在免疫反应中起重要作用，不仅与抗感染、抗肿瘤和抗原呈递有关，还分泌多种细胞因子，调节淋巴细胞的免疫反应。本试验的目的就是比较这两种品系大鼠的肺泡巨噬细胞体外产生TNF-α和NO的能力，以及氯化汞对它们的影响是否存在明显的差别。
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1 材料与方法
1.1 实验动物 雄性SPF Brown Norway(BN)和Lewis(IW)大鼠，均为10～12周龄，体重分别为200～250 g和250～300 g。
1.2 主要试剂 氯化汞(纯度99.5%)、亚硝酸钠、硫酸胺(sulfamide)和萘乙烯二胺二盐酸盐(N-1-Naphthylethylene-diamine dihydrochloride)均为分析试剂。大鼠TNF-αELISA试剂盒为美国BioSource Int公司产品。LDH细胞毒性测定试剂盒由日本TaKaRa Biomedicals公司生产。
1.3 试验方法 大鼠腹腔注射苯巴比妥纳麻醉后，放血处死，用10 ml生理盐水进行肺泡灌洗，每只动物重复灌洗4次，同时按摩肺脏。灌洗液合并后，经1 000 r/min离心10 min。沉淀的细胞用RPMI 1640培养液清洗2遍，计数，并用培养液配成2×10浓度的细胞悬液，在24孔培养板中预培养3 h，使细胞贴壁。评价剂量-效应关系，在各孔中分别加入终浓度为0、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0和30.0 μmol/L的氯化汞，培养48 h。评价时间-效应关系，在各孔中加入终浓度为0或3 μmol/L的氯化汞，分别培养12、24、48、72和96 h。收集细胞及培养液，1 000 r/min离心10 min收集上清液，按试剂盒要求的方法分别测定LDH相对活性和TNF-α含量。NO生成量用亚硝酸盐含量表示，按Green法[7]测定。比色用分子生物学用微量全自动紫外-可见分光光度仪(Spectra MAX 250)。每次每种处理设3个平行孔，整个实验重复两次，取平均值。用方差分析比较各组之间差异的显著性。
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2 结果
2.1 细胞毒性 对照组两种品系大鼠的巨噬细胞培养12～72 h，LDH活性都没有明显改变，但96 h的相对LDH活性增加20%～40%。说明在本试验条件下，培养72 h以内，对巨噬细胞无明显影响，而培养96 h则可引起一定的细胞损伤。接触终浓度为0.1～3 μmol/L的氯化汞48 h，相对LDH活性均在110%以内，与对照组比较，差异无显著性。但当氯化汞浓度为10 μmol/L或以上时，相对LDH活性明显增高(60%～80%)。说明肺泡巨噬细胞接触3 μmol/L以下的氯化汞48 h无明显细胞毒性，而10 μmol/L以上则有明显的细胞毒性。
2.2 对TNF-α生成的影响 来自两种品系大鼠的肺泡巨噬细胞TNF-α的生成量均随着培养时间的延长而逐渐减少。对照组培养12 h，BN巨噬细胞产生的TNF-α量比LW多1倍。但这种差异随着培养时间的延长而逐渐缩小，72 h以后基本消失。接触氯化汞48 h后TNF-α的生成量明显减少，并呈剂量-效应关系。当浓度达1 μmol/L以上时，与对照组比较，差异有显著性(P<0.05)。对BN的抑制作用比对LW的为大，接触3 μmol/L氯化汞12 h的抑制率分别为54.4%和35.4%(表1和表2)。
, 百拇医药
表1 接触氯化汞不同时间对TNF-α生成的影响 氯化汞浓度
(μmol/L)
培养时间
(h)
n
BN
TNF-α浓度(pg/ml)
LW
0
12
6
609.45±111.94
, 百拇医药
340.62±44.74＃
0
24
6
195.83±44.15
132.96±35.01
0
48
6
162.37±19.25
101.82±24.29＃
0
, 百拇医药
72
6
86.06±18.62
81.81±15.01
0
96
6
71.31±5.98
75.59±38.02
3
12
6
278.06±108.12*
, http://www.100md.com
220.19±75.22*
3
24
6
143.40±37.48
106.74±15.95
3
48
6
76.67±20.25*
62.58±16.17*
3
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72
6
77.06±6.73
63.38±17.41
3
96
6
64.96±6.72
58.27±14.17
与同品系相同培养时间的对照组比较，P<0.05；与相应剂量和培养时间的BN品系比较，#P<0.05表2 接触不同浓度氯化汞对TNF-α生成的影响 氯化汞浓度
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(μmol/L)
培养时间
(h)
n
TNF-α浓度(pg/ml)
BN
LW
0
48
6
162.37±19.25
101.82±24.29＃
, 百拇医药
0.1
48
6
136.30±46.63
77.39±7.47＃
0.3
48
6
120.19±52.26
72.54±10.37
1.0
48
, http://www.100md.com
6
81.46±26.02*
69.15±6.90*
3.0
48
6
71.67±20.25
52.58±16.17
10.0
48
6
, 百拇医药 62.10±7.34
53.12±9.50
与同品系对照组比较，P<0.05，P<0.01；与相应剂量的BN品系比较，#P<0.05
2.3 对NO生成的影响 两种品系大鼠的巨噬细胞培养液中亚硝酸盐的含量都随着培养时间的延长而增加。对照组培养12 h，BN巨噬细胞产生的亚硝酸盐量比LW多30%，此后差异逐渐缩小，72 h后没有明显差异。接触氯化汞后产生亚硝酸盐的量明显减少，也有剂量-效应关系。接触48 h后，与各自的对照组比较，BN巨噬细胞从1 μmol/L开始明显减少，LW则在3 μmol/L才有明显差异。接触3 μmol/L氯化汞12 h，两种品系巨噬细胞产生亚硝酸盐的量都没有明显影响，24 h开始才有所减少。此后BN减少的幅度比LW略大(表3和表4)。
, 百拇医药
表3 接触氯化汞不同时间对NO生成的影响 氯化汞浓度
(μmol/L)
培养时间
(h)
n
NO浓度(μmol/ml)
BN
LW
0
12
6
1.868±0.165
, 百拇医药
1.313±0.084＃
0
24
6
2.065±0.139
1.729±0.317
0
48
6
2.813±0.121
2.352±0.554
0
, 百拇医药
72
6
3.285±0.391
3.249±0.128
0
96
6
3.467±0.533
3.449±0.357
3
12
6
2.056±0.165
, http://www.100md.com
1.577±0.320
3
24
6
1.604±0.209
1.194±0.121
3
48
6
1.974±0.243*
1.551±0.436*
, 百拇医药
3
72
6
1.485±0.209
2.161±0.433
3
96
6
1.987±0.230*
2.105±0.158*
与同品系相同培养时间的对照组比较，P<0.05，P<0.01；与相应剂量和培养时间的BN品系比较，#P<0.05表4 接触不同浓度氯化汞对NO生成的影响 氯化汞浓度
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(μmol/L)
培养时间
(h)
n
NO浓度(pg/ml)
BN
LW
0
48
6
2.813±0.121
2.352±0.554
0.1
, 百拇医药
48
6
2.945±0.347
2.404±0.237
0.3
48
6
2.580±0.209
2.184±0.158
1.0
48
6
1.696±0.406*
, http://www.100md.com
1.655±0.516
3.0
48
6
1.947±0.209
1.340±0.121
10.0
48
6
0.680±0.137
1.393±0.253
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与同品系对照组比较，P<0.05，P<0.013 讨论
本试验观察到氯化汞浓度为10 μmol/L时，对两种品系大鼠的肺泡巨噬细胞都有细胞毒性，这与Shenker等人[8]报道的结果相似，即氯化汞在10-5 mol 开始出现明显的细胞毒性。在接触氧化汞之前，来自BN的肺泡巨噬细胞产生TNF-α和NO的量都高于LW，尤以12 h为明显。但随着培养时间的延长，两者之间的差异逐渐缩小到消失。可能是因为某些与这种差异有关的因子在体外培养条件下逐渐减少或消失，因此不足以维持这种差异。由于各种细胞因子、化学因子之间在体内的相互关系远比体外的情况复杂，因此，不能肯定两种品系大鼠肺泡巨噬细胞在体内生成TNF-α和NO的能力是否也存在差别，以及这种差别(如果存在)是否与两种品系大鼠对氯化汞诱发的自身免疫反应敏感性不同有关。这些都有待进一步进行体内试验加以验证。
我们以前发现镍、钴等金属粉尘对大鼠肺泡巨噬细胞具有刺激作用，可以明显地促进TNF-α和NO的生成[9]。而本试验中却发现氯化汞可以抑制肺泡巨噬细胞产生TNF-α和NO。这可能与重金属的化学形态和在培养基中的溶解度有关。不溶性的金属粉尘很容易通过吞噬作用被巨噬细胞摄入细胞内，其细胞毒性可能较小，却可以激活巨噬细胞。而巨噬细胞对可溶性的金属离子可能难以进行吞噬。相反，Hg2+可以抑制多种酶的活性，其中可能包括与TNF-α和NO生成有关的酶，如可诱导一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)。两价重金属离子可以与含巯基的蛋白质或小分子的含巯基化合物，如谷光甘肽(GSH)结合并失活。而细胞内的还原型GSH与iNOS的表达和TNF-α的产生都有关系[10，11]。因此，氯化汞可能通过消耗培养基和细胞内的GSH(当然还可能通过其他途径)，抑制肺泡巨噬细胞在体外产生TNF-α和NO。有报道氯化汞可能通过消耗GSH抑制大鼠T淋巴细胞产生干扰素-γ，但只对BN大鼠的T淋巴细胞有作用，而对LW大鼠的T淋巴细胞却无明显抑制[12]。而本实验结果显示，氯化汞对BN和LW两种品系大鼠肺泡巨噬细胞产生TNF-α和NO的抑制作用，只有程度上的差别，即对BN品系的抑制作用更加明显，但在总的趋势上看，没有质的不同。同样，氯化汞的这种抑制作用也有待通过体内试验证实。这两种品系动物体内GSH及其氧化还原状态(GSH/GSSG)是否存在差异也值得研究。
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参考文献
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[12] van der Meide PH,de Labie MC,Botman CA,et al.Mercuric chloride down-regulates T cell inerferon-γ production in Brown Norway but not in Lewis rats;role of glutathione.Eur J Immunol,1993,23:675-681.
(收稿日期：2000-02-18), 百拇医药
单位：张群卫(日本福井医科大学环境保健研究室)；朱心强 郑一凡 常艳(浙江大学医学院卫生毒理研究室，杭州 310006)
关键词：氯化汞；肺泡巨噬细胞；肿瘤坏死因子-α；一氧化氮
卫生毒理学杂志000403 摘要 【目的】 比较Brown Norway(BN)和Levis(LE)两种品系大鼠肺泡巨噬细胞产生肿瘤坏死因子(TNF-α)和一氧化氮(NO)的能力及对氯化汞的反应是否存在差别。【方法】 用肺泡灌洗法收集肺泡巨噬细胞进行培养，加入不同浓度的氯化汞(0.1～30 μmol/L)，处理不同的时间(12～96 h)后，测定培养基中LDH的相对活性，以反映细胞毒性，并测定TNF-α和亚硝酸盐的含量。【结果】 氯化汞在3 μmol/L以下，培养48 h对肺泡巨噬细胞无明显细胞毒性。对照组BN和LW品系TNF-α的浓度分别为(609.45±111.94)pg/ml和(340.62±44.74)pg/ml，两者相比，差异有显著性。亚硝酸盐的浓度分别为(1.868±0.165)μmol/ml和(1.313±0.084)μmol/ml，差异也有显著性。氯化汞对TNF-α和NO的生成都有一定程度的抑制。【结论】 两种品系大鼠肺泡巨噬细胞体外生成TNF-α和NO的量有所不同，氯化汞能抑制两种品系大鼠的肺泡巨噬细胞产生TNF-α和NO，抑制作用以BN品系为明显，但总的趋势相似。
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The effects of mercuric chloride on the production of TNF-α and nitric oxide of the alveolar macrophages originated from different strains of rats
ZHU Xin-qiang,ZHENG Yi-fan,CHANG Yan
(Department of Toxicology,Medical College,Zhejiang University,Hangzhou 310006,China)
Abstract:【Objective】 To compare the strain differences of tumor necrosis factor alpha(TNF-α) and nitric oxide (NO)production of alveolar macrophages(AMs)originated from Brown Norway(BN) and Lewis(LW)rats.【Methods】 The AMs were collected by the bronchoalveolar lavage method,and exposed to concentrations of HgCl2(0.1～30 μmol/L) for fifferent times(12～96 h).The relative LDH activities in the medium were measured to assess the cytotoxicity.The TNF-α concentration was measured by an ELISA kit and the nitrite was detected with Griess regent.【Results】 The HgCl2 was not cytotoxic to the AMs at the concentration of 3 μmol/L within 72 h of incubation.In the control groups the concentrations of TNF-α and nitrite were (609.45±111.94)pg/m and (1.868±0.165)μmol/ml,respectively,in BN,which were significantly higher than those in LW strain[(340.62±44.7)pg/ml and (1.313±0.084)μmol/ml].The production of TNF-α and NO in both strains were inhibited to some extent by mercuric chloride.【Conclusion】 There are some strain differences in the production of TNF-α and NO between BN and LW strain of rats.Mercuric chloride inhibited the production of TNF-α and NO.The inhibitory trends were more serious in BN compared with those in LW.
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Key words：Mercuric chloride; Alveolar macrophages; TNF-α; Nitric oxide
汞是最古老的毒物之一，除了能引起中枢神经系统、血液、肾脏等多种器官损害之外，还具有免疫毒性。汞的免疫毒性主要表现在两个方面，大剂量急性接触可以引起免疫抑制，使机体抗感染能力降低；小剂量反复接触则可以引起自身免疫性疾病，如自身免疫性肾炎等[1]。汞引起的自身免疫反应的敏感性与实验动物的遗传因素密切相关，不同品系的大鼠或小鼠敏感性相差很大，如Brown Norway大鼠非常敏感，而Lewis大鼠则不敏感。因此这两种品系的大鼠也是研究汞引起的自身免疫反应最常用的动物模型。但这种敏感性差异的机制至今尚未完全明了。一般认为辅助T细胞亚群Th1/Th2失衡是主要原因，即在敏感品系主要引起Th2型反应，而在耐受品系主要引起Th1型反应[2]。但最近发现Th1\,Th2型反应在汞引起的自身免疫反应中均起作用[3]，还与干扰素-γ等多种细胞因子的调节有关[4]。由于各种细胞因子之间的关系极为复杂，目前尚缺乏对经过汞处理的动物体内各种细胞因子总体情况的了解，因此限制了对有关机制的进一步认识。许多研究表明肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)与自身免疫反应有密切关系[5，6]。因此，不同品系动物之间这两种前炎症反应因子的产生也可能存在着差异。因为汞的职业性接触主要通过呼吸道，所以肺泡巨噬细胞往往是首先接触。而且巨噬细胞在免疫反应中起重要作用，不仅与抗感染、抗肿瘤和抗原呈递有关，还分泌多种细胞因子，调节淋巴细胞的免疫反应。本试验的目的就是比较这两种品系大鼠的肺泡巨噬细胞体外产生TNF-α和NO的能力，以及氯化汞对它们的影响是否存在明显的差别。
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1 材料与方法
1.1 实验动物 雄性SPF Brown Norway(BN)和Lewis(IW)大鼠，均为10～12周龄，体重分别为200～250 g和250～300 g。
1.2 主要试剂 氯化汞(纯度99.5%)、亚硝酸钠、硫酸胺(sulfamide)和萘乙烯二胺二盐酸盐(N-1-Naphthylethylene-diamine dihydrochloride)均为分析试剂。大鼠TNF-αELISA试剂盒为美国BioSource Int公司产品。LDH细胞毒性测定试剂盒由日本TaKaRa Biomedicals公司生产。
1.3 试验方法 大鼠腹腔注射苯巴比妥纳麻醉后，放血处死，用10 ml生理盐水进行肺泡灌洗，每只动物重复灌洗4次，同时按摩肺脏。灌洗液合并后，经1 000 r/min离心10 min。沉淀的细胞用RPMI 1640培养液清洗2遍，计数，并用培养液配成2×10浓度的细胞悬液，在24孔培养板中预培养3 h，使细胞贴壁。评价剂量-效应关系，在各孔中分别加入终浓度为0、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0和30.0 μmol/L的氯化汞，培养48 h。评价时间-效应关系，在各孔中加入终浓度为0或3 μmol/L的氯化汞，分别培养12、24、48、72和96 h。收集细胞及培养液，1 000 r/min离心10 min收集上清液，按试剂盒要求的方法分别测定LDH相对活性和TNF-α含量。NO生成量用亚硝酸盐含量表示，按Green法[7]测定。比色用分子生物学用微量全自动紫外-可见分光光度仪(Spectra MAX 250)。每次每种处理设3个平行孔，整个实验重复两次，取平均值。用方差分析比较各组之间差异的显著性。
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2 结果
2.1 细胞毒性 对照组两种品系大鼠的巨噬细胞培养12～72 h，LDH活性都没有明显改变，但96 h的相对LDH活性增加20%～40%。说明在本试验条件下，培养72 h以内，对巨噬细胞无明显影响，而培养96 h则可引起一定的细胞损伤。接触终浓度为0.1～3 μmol/L的氯化汞48 h，相对LDH活性均在110%以内，与对照组比较，差异无显著性。但当氯化汞浓度为10 μmol/L或以上时，相对LDH活性明显增高(60%～80%)。说明肺泡巨噬细胞接触3 μmol/L以下的氯化汞48 h无明显细胞毒性，而10 μmol/L以上则有明显的细胞毒性。
2.2 对TNF-α生成的影响 来自两种品系大鼠的肺泡巨噬细胞TNF-α的生成量均随着培养时间的延长而逐渐减少。对照组培养12 h，BN巨噬细胞产生的TNF-α量比LW多1倍。但这种差异随着培养时间的延长而逐渐缩小，72 h以后基本消失。接触氯化汞48 h后TNF-α的生成量明显减少，并呈剂量-效应关系。当浓度达1 μmol/L以上时，与对照组比较，差异有显著性(P<0.05)。对BN的抑制作用比对LW的为大，接触3 μmol/L氯化汞12 h的抑制率分别为54.4%和35.4%(表1和表2)。
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表1 接触氯化汞不同时间对TNF-α生成的影响 氯化汞浓度
(μmol/L)
培养时间
(h)
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BN
TNF-α浓度(pg/ml)
LW
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12
6
609.45±111.94
, 百拇医药
340.62±44.74＃
0
24
6
195.83±44.15
132.96±35.01
0
48
6
162.37±19.25
101.82±24.29＃
0
, 百拇医药
72
6
86.06±18.62
81.81±15.01
0
96
6
71.31±5.98
75.59±38.02
3
12
6
278.06±108.12*
, http://www.100md.com
220.19±75.22*
3
24
6
143.40±37.48
106.74±15.95
3
48
6
76.67±20.25*
62.58±16.17*
3
, 百拇医药
72
6
77.06±6.73
63.38±17.41
3
96
6
64.96±6.72
58.27±14.17
与同品系相同培养时间的对照组比较，P<0.05；与相应剂量和培养时间的BN品系比较，#P<0.05表2 接触不同浓度氯化汞对TNF-α生成的影响 氯化汞浓度
, http://www.100md.com
(μmol/L)
培养时间
(h)
n
TNF-α浓度(pg/ml)
BN
LW
0
48
6
162.37±19.25
101.82±24.29＃
, 百拇医药
0.1
48
6
136.30±46.63
77.39±7.47＃
0.3
48
6
120.19±52.26
72.54±10.37
1.0
48
, http://www.100md.com
6
81.46±26.02*
69.15±6.90*
3.0
48
6
71.67±20.25
52.58±16.17
10.0
48
6
, 百拇医药 62.10±7.34
53.12±9.50
与同品系对照组比较，P<0.05，P<0.01；与相应剂量的BN品系比较，#P<0.05
2.3 对NO生成的影响 两种品系大鼠的巨噬细胞培养液中亚硝酸盐的含量都随着培养时间的延长而增加。对照组培养12 h，BN巨噬细胞产生的亚硝酸盐量比LW多30%，此后差异逐渐缩小，72 h后没有明显差异。接触氯化汞后产生亚硝酸盐的量明显减少，也有剂量-效应关系。接触48 h后，与各自的对照组比较，BN巨噬细胞从1 μmol/L开始明显减少，LW则在3 μmol/L才有明显差异。接触3 μmol/L氯化汞12 h，两种品系巨噬细胞产生亚硝酸盐的量都没有明显影响，24 h开始才有所减少。此后BN减少的幅度比LW略大(表3和表4)。
, 百拇医药
表3 接触氯化汞不同时间对NO生成的影响 氯化汞浓度
(μmol/L)
培养时间
(h)
n
NO浓度(μmol/ml)
BN
LW
0
12
6
1.868±0.165
, 百拇医药
1.313±0.084＃
0
24
6
2.065±0.139
1.729±0.317
0
48
6
2.813±0.121
2.352±0.554
0
, 百拇医药
72
6
3.285±0.391
3.249±0.128
0
96
6
3.467±0.533
3.449±0.357
3
12
6
2.056±0.165
, http://www.100md.com
1.577±0.320
3
24
6
1.604±0.209
1.194±0.121
3
48
6
1.974±0.243*
1.551±0.436*
, 百拇医药
3
72
6
1.485±0.209
2.161±0.433
3
96
6
1.987±0.230*
2.105±0.158*
与同品系相同培养时间的对照组比较，P<0.05，P<0.01；与相应剂量和培养时间的BN品系比较，#P<0.05表4 接触不同浓度氯化汞对NO生成的影响 氯化汞浓度
, 百拇医药
(μmol/L)
培养时间
(h)
n
NO浓度(pg/ml)
BN
LW
0
48
6
2.813±0.121
2.352±0.554
0.1
, 百拇医药
48
6
2.945±0.347
2.404±0.237
0.3
48
6
2.580±0.209
2.184±0.158
1.0
48
6
1.696±0.406*
, http://www.100md.com
1.655±0.516
3.0
48
6
1.947±0.209
1.340±0.121
10.0
48
6
0.680±0.137
1.393±0.253
, 百拇医药
与同品系对照组比较，P<0.05，P<0.013 讨论
本试验观察到氯化汞浓度为10 μmol/L时，对两种品系大鼠的肺泡巨噬细胞都有细胞毒性，这与Shenker等人[8]报道的结果相似，即氯化汞在10-5 mol 开始出现明显的细胞毒性。在接触氧化汞之前，来自BN的肺泡巨噬细胞产生TNF-α和NO的量都高于LW，尤以12 h为明显。但随着培养时间的延长，两者之间的差异逐渐缩小到消失。可能是因为某些与这种差异有关的因子在体外培养条件下逐渐减少或消失，因此不足以维持这种差异。由于各种细胞因子、化学因子之间在体内的相互关系远比体外的情况复杂，因此，不能肯定两种品系大鼠肺泡巨噬细胞在体内生成TNF-α和NO的能力是否也存在差别，以及这种差别(如果存在)是否与两种品系大鼠对氯化汞诱发的自身免疫反应敏感性不同有关。这些都有待进一步进行体内试验加以验证。
我们以前发现镍、钴等金属粉尘对大鼠肺泡巨噬细胞具有刺激作用，可以明显地促进TNF-α和NO的生成[9]。而本试验中却发现氯化汞可以抑制肺泡巨噬细胞产生TNF-α和NO。这可能与重金属的化学形态和在培养基中的溶解度有关。不溶性的金属粉尘很容易通过吞噬作用被巨噬细胞摄入细胞内，其细胞毒性可能较小，却可以激活巨噬细胞。而巨噬细胞对可溶性的金属离子可能难以进行吞噬。相反，Hg2+可以抑制多种酶的活性，其中可能包括与TNF-α和NO生成有关的酶，如可诱导一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)。两价重金属离子可以与含巯基的蛋白质或小分子的含巯基化合物，如谷光甘肽(GSH)结合并失活。而细胞内的还原型GSH与iNOS的表达和TNF-α的产生都有关系[10，11]。因此，氯化汞可能通过消耗培养基和细胞内的GSH(当然还可能通过其他途径)，抑制肺泡巨噬细胞在体外产生TNF-α和NO。有报道氯化汞可能通过消耗GSH抑制大鼠T淋巴细胞产生干扰素-γ，但只对BN大鼠的T淋巴细胞有作用，而对LW大鼠的T淋巴细胞却无明显抑制[12]。而本实验结果显示，氯化汞对BN和LW两种品系大鼠肺泡巨噬细胞产生TNF-α和NO的抑制作用，只有程度上的差别，即对BN品系的抑制作用更加明显，但在总的趋势上看，没有质的不同。同样，氯化汞的这种抑制作用也有待通过体内试验证实。这两种品系动物体内GSH及其氧化还原状态(GSH/GSSG)是否存在差异也值得研究。
, http://www.100md.com
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(收稿日期：2000-02-18), 百拇医药