体外受精-胚胎移植模型的建立
作者：沈宗姬 徐文新 华月琴 杨伟文
单位：苏州医学院附属一院妇产科，苏州，215006
关键词：体外受精-胚胎移植(IVF-ET)；动物实验
苏州医学院学报000911 摘要 目的 为临床治疗不孕症建立体外受精-胚胎移植(IVF-ET)动物模型。方法和结果 1995年11月开始对小鼠受精卵进行体外培养，至1998年6月成功地建立了动物模式。结论 根据小鼠受精卵的发育来检测培养液的质量，了解仪器设备、周围环境是否适合胚胎的生长，将此作为IVF-ET的质量控制。
中图法分类号 R714.13
Mouse Embryo Culture in Vitro-Setting up Animal Model
, 百拇医药
Shen Zongji, Xu Wenxing, Hua Yueqing, et al
(The First Hospital Affiliated to Suzhou University,Suzhou,215006)
Abstract Objective To put new technology of fertilization in vito and embryo transfer (IVF-ET) into clinic use for treating infertility.Method and Result We began mouse embryo culture in vitro from December 1995 and set up animal model successfully in June 1998.We analyze the culture medium,instruments and air condition with this animal model.Conclusion Mouse embryo culture is a good quality control for human fertilization in vitro and embryo transfer.
, 百拇医药
Key words in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET);animal experiment
自1978年国外首例人类卵细胞体外受精，胚胎移植(IVF-ET)成功，并足月分娩报道以来，IVF-ET已成为国内外治疗不孕症的有效方法。为了在临床开展这一技术，我们从1995年11月开始，对小白鼠受精卵进行了体外培养，以建立动物模式，熟练操作过程，检查培养液的质量，了解仪器设备和周围环境是否适合胚胎生长。现将自1995年11月～1998年6月进行的动物实验报告如下。
1 材料、方法与结果
1.1 动物来源及饲养方法 性成熟昆明小白鼠(苏州医学院动物实验室提供)，体重25～30g，鼠龄6～8周。领取后在实验室饲养1周，熟悉新环境。雌鼠3～4只1笼，雄鼠1只1笼，室温20℃，维持12h灯照，12h黑暗。喂新鲜自来水，混合干饲料，适量熟鸡蛋黄。
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1.2 培养液的准备 细胞培养液使用Earle's试剂(sigma公司)，使用前按说明配制。加入2.2g碳酸氢钠或者29.3ml碳酸氢钠，加入一定量双蒸水混匀，将pH调至7.4，渗透压284～285mmol/L,配制之溶液用0.22microns过滤膜过滤消毒，置0～5℃冰箱内备用。在取小白鼠受精卵前日下午根据已交配的雌鼠数准备消毒平皿(Falcon公司)。每一组由3只平皿组成。第1号平皿内置1ml培养液，放入剪下的小白鼠输卵管，将卵细胞冲洗出来；第2号平皿内置1ml培养液及检出来的已分裂成2细胞的卵细胞，将在其内冲洗2～3次；第3号平皿内置数滴50μl的培养液，上面覆盖植物油(Sigma公司，M-8410)，将冲洗过的2细胞置其中。1个卵细胞1滴。不同的小白鼠卵细胞不能置同一平皿中。将准备好的平皿置CO2培养箱(37℃，5% CO2)内过夜，CO2化。
1.3 小白鼠超排卵方法 每只雌鼠腹腔内注射人绝经期促性腺激素(hMG))(hMG75IU/支，上海生化药物公司)10IU，48h后腹腔内注射绒毛膜促性腺激素(hCG,500IU/支，上海生化药物公司)10 IU,与雄鼠(1∶1)合笼交配[1]，将雌鼠放入雄鼠笼中。
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1.4 鼠卵细胞的取出 交配后42～46h,选择有阴道粘液栓的雌鼠，脱颈椎处死。无菌操作下，迅速取出双侧输卵管(附图)[2]，置第1号培养皿中，用细小的钝头吸管插入输卵管的一端，注入培养液，将受精卵冲洗出来。若冲洗困难，可将输卵管撕开。
1.5 鼠胚的培养 在实体(解剖)显微镜下寻找受精卵细胞，将已分裂成2细胞的鼠胚吸出，在第2号平皿培养液中吸洗2～3次，放入第3号平皿培养液中，并在平皿上标号，置CO2培养箱中。
1.6 鼠胚的观察和结果评定 24h后在倒置显微镜下观察2细胞鼠胚的发育情况。正常情况下，小白鼠2细胞胚胎于24h后发育成4～8细胞胚胎，36h后发育成桑椹胚，48h后发育成早期胚胎。如果2细胞胚胎停止发育，或细胞内出现碎片，说明生长环境不利于胚胎发育，应该逐步分析影响因素。
1.7 结果 我们从1995年11月～1998年6月共进行了10次动物实验，每次选择6只雌鼠进行交配。在实体和倒置显微镜下，找到了2细胞鼠胚，看到了2细胞发育成4～8细胞，发育成桑椹胚的过程，熟练了操作过程，检查了CO2培养箱的质量，改进了细胞培养液的配制，逐渐建立了动物模式。
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附图 小白鼠的内生殖器官司及取输卵管方法从cut2-cut3这间切下输卵管
2 讨论
利用小白鼠2细胞胚胎作为IVF-ET的质量控制，来检测细胞培养液的pH、渗透压，所含成份是否对胚胎有毒性，检测CO2培养箱的温度、浓度，检测实验室的空气含量等等。国外已有大量的报道，这一方法已成为公认的检测手段[3，4]。
我们从1995年11月开始至1998年6月间断地(由于客观原因)进行了10次动物实验，成功地建立了动物模式。分析了失败原因，检测了实验仪器和设备，分析了培养液，最后在显微镜下清晰地观察到2细胞鼠胚的发育过程。
在实验过程中，我们有一些体会。首先是小白鼠的选择和饲养很重要。一定要选择性成熟期的小白鼠，有足够的重量。领取的小白鼠要在新环境中熟悉1周，室温要恒定，食物中要添加适量的鸡蛋黄增加营养，以获取更多的胚胎，取卵前要仔细观察雌鼠的阴道粘液栓。
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取卵时动作要轻柔、快、恒温和无菌操作，以保证培养液的pH变化不大。若输卵管太细，吸头不易插入，可将输卵管撕开，在培养液中冲洗，但这样显微镜下组织多，不易寻找受精卵，费时多。
应每天检查CO2培养箱的浓度、湿度和温度，箱门不宜多开。最好具2只CO2培养箱，1只放培养液、培养皿，另1只专放培养的卵细胞，这样可保证放卵细胞的CO2培养箱的稳定性。
我们将这动物模式作为IVF-ET的质量控制，目前仍在不断地进行动物实验，以检测新的培养液，寻找临床上IVF-ET失败的原因。国外目前将这种动物实验应用于单精子卵细胞内穿刺(ICSI)，胚胎冰冻，胚胎解溶的质量控制[5，6]，以提高受孕率，保证实验操作的可靠性和准确性。
参考文献
1，Davidson A,Vermesh M,Lobo RA,et al.Mouse embryo culture as quality control for human in vitro fertilization:the one-cea versus the two cell model.Ferfil Stenl,1988,49∶516
, http://www.100md.com
2，Wolf DP.In vitro fertilization and embryo transfer.New York:Plenum Press,1988∶66
3，QuinnP,Horstman FC.Is the mouse a goul model for the haman with respect to the development of the preimplantation embryo in vitro.Oxford:Oxford University Press，1988∶173
4，Condon-Mahony M,Wortham Jw Jr,Bundren Jc,et al.Evaluation of human fetal cord sera,Ham's F-10 medium and in vitro cultare materials with a mouse in vivo fertilizarion sysfem.Fertil Steril,1985,44∶521
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5，Krzyminska V,O'Neill C.The effects of cryopreservation and thawing on the development in vitro and in vivo of biopsied 8-cell mruse tmbryos.Hum Reprod,1991,6(6)∶832
6，Ahmadi A,NgSc.Fertilization and development of mouse oocyte injected with membrane damaged spermatozoz.Hum Reprod,1997,12(12)∶2797
2000年3月2日收稿, http://www.100md.com
单位：苏州医学院附属一院妇产科，苏州，215006
关键词：体外受精-胚胎移植(IVF-ET)；动物实验
苏州医学院学报000911 摘要 目的 为临床治疗不孕症建立体外受精-胚胎移植(IVF-ET)动物模型。方法和结果 1995年11月开始对小鼠受精卵进行体外培养，至1998年6月成功地建立了动物模式。结论 根据小鼠受精卵的发育来检测培养液的质量，了解仪器设备、周围环境是否适合胚胎的生长，将此作为IVF-ET的质量控制。
中图法分类号 R714.13
Mouse Embryo Culture in Vitro-Setting up Animal Model
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Shen Zongji, Xu Wenxing, Hua Yueqing, et al
(The First Hospital Affiliated to Suzhou University,Suzhou,215006)
Abstract Objective To put new technology of fertilization in vito and embryo transfer (IVF-ET) into clinic use for treating infertility.Method and Result We began mouse embryo culture in vitro from December 1995 and set up animal model successfully in June 1998.We analyze the culture medium,instruments and air condition with this animal model.Conclusion Mouse embryo culture is a good quality control for human fertilization in vitro and embryo transfer.
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Key words in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET);animal experiment
自1978年国外首例人类卵细胞体外受精，胚胎移植(IVF-ET)成功，并足月分娩报道以来，IVF-ET已成为国内外治疗不孕症的有效方法。为了在临床开展这一技术，我们从1995年11月开始，对小白鼠受精卵进行了体外培养，以建立动物模式，熟练操作过程，检查培养液的质量，了解仪器设备和周围环境是否适合胚胎生长。现将自1995年11月～1998年6月进行的动物实验报告如下。
1 材料、方法与结果
1.1 动物来源及饲养方法 性成熟昆明小白鼠(苏州医学院动物实验室提供)，体重25～30g，鼠龄6～8周。领取后在实验室饲养1周，熟悉新环境。雌鼠3～4只1笼，雄鼠1只1笼，室温20℃，维持12h灯照，12h黑暗。喂新鲜自来水，混合干饲料，适量熟鸡蛋黄。
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1.2 培养液的准备 细胞培养液使用Earle's试剂(sigma公司)，使用前按说明配制。加入2.2g碳酸氢钠或者29.3ml碳酸氢钠，加入一定量双蒸水混匀，将pH调至7.4，渗透压284～285mmol/L,配制之溶液用0.22microns过滤膜过滤消毒，置0～5℃冰箱内备用。在取小白鼠受精卵前日下午根据已交配的雌鼠数准备消毒平皿(Falcon公司)。每一组由3只平皿组成。第1号平皿内置1ml培养液，放入剪下的小白鼠输卵管，将卵细胞冲洗出来；第2号平皿内置1ml培养液及检出来的已分裂成2细胞的卵细胞，将在其内冲洗2～3次；第3号平皿内置数滴50μl的培养液，上面覆盖植物油(Sigma公司，M-8410)，将冲洗过的2细胞置其中。1个卵细胞1滴。不同的小白鼠卵细胞不能置同一平皿中。将准备好的平皿置CO2培养箱(37℃，5% CO2)内过夜，CO2化。
1.3 小白鼠超排卵方法 每只雌鼠腹腔内注射人绝经期促性腺激素(hMG))(hMG75IU/支，上海生化药物公司)10IU，48h后腹腔内注射绒毛膜促性腺激素(hCG,500IU/支，上海生化药物公司)10 IU,与雄鼠(1∶1)合笼交配[1]，将雌鼠放入雄鼠笼中。
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1.4 鼠卵细胞的取出 交配后42～46h,选择有阴道粘液栓的雌鼠，脱颈椎处死。无菌操作下，迅速取出双侧输卵管(附图)[2]，置第1号培养皿中，用细小的钝头吸管插入输卵管的一端，注入培养液，将受精卵冲洗出来。若冲洗困难，可将输卵管撕开。
1.5 鼠胚的培养 在实体(解剖)显微镜下寻找受精卵细胞，将已分裂成2细胞的鼠胚吸出，在第2号平皿培养液中吸洗2～3次，放入第3号平皿培养液中，并在平皿上标号，置CO2培养箱中。
1.6 鼠胚的观察和结果评定 24h后在倒置显微镜下观察2细胞鼠胚的发育情况。正常情况下，小白鼠2细胞胚胎于24h后发育成4～8细胞胚胎，36h后发育成桑椹胚，48h后发育成早期胚胎。如果2细胞胚胎停止发育，或细胞内出现碎片，说明生长环境不利于胚胎发育，应该逐步分析影响因素。
1.7 结果 我们从1995年11月～1998年6月共进行了10次动物实验，每次选择6只雌鼠进行交配。在实体和倒置显微镜下，找到了2细胞鼠胚，看到了2细胞发育成4～8细胞，发育成桑椹胚的过程，熟练了操作过程，检查了CO2培养箱的质量，改进了细胞培养液的配制，逐渐建立了动物模式。
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附图 小白鼠的内生殖器官司及取输卵管方法从cut2-cut3这间切下输卵管
2 讨论
利用小白鼠2细胞胚胎作为IVF-ET的质量控制，来检测细胞培养液的pH、渗透压，所含成份是否对胚胎有毒性，检测CO2培养箱的温度、浓度，检测实验室的空气含量等等。国外已有大量的报道，这一方法已成为公认的检测手段[3，4]。
我们从1995年11月开始至1998年6月间断地(由于客观原因)进行了10次动物实验，成功地建立了动物模式。分析了失败原因，检测了实验仪器和设备，分析了培养液，最后在显微镜下清晰地观察到2细胞鼠胚的发育过程。
在实验过程中，我们有一些体会。首先是小白鼠的选择和饲养很重要。一定要选择性成熟期的小白鼠，有足够的重量。领取的小白鼠要在新环境中熟悉1周，室温要恒定，食物中要添加适量的鸡蛋黄增加营养，以获取更多的胚胎，取卵前要仔细观察雌鼠的阴道粘液栓。
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取卵时动作要轻柔、快、恒温和无菌操作，以保证培养液的pH变化不大。若输卵管太细，吸头不易插入，可将输卵管撕开，在培养液中冲洗，但这样显微镜下组织多，不易寻找受精卵，费时多。
应每天检查CO2培养箱的浓度、湿度和温度，箱门不宜多开。最好具2只CO2培养箱，1只放培养液、培养皿，另1只专放培养的卵细胞，这样可保证放卵细胞的CO2培养箱的稳定性。
我们将这动物模式作为IVF-ET的质量控制，目前仍在不断地进行动物实验，以检测新的培养液，寻找临床上IVF-ET失败的原因。国外目前将这种动物实验应用于单精子卵细胞内穿刺(ICSI)，胚胎冰冻，胚胎解溶的质量控制[5，6]，以提高受孕率，保证实验操作的可靠性和准确性。
参考文献
1，Davidson A,Vermesh M,Lobo RA,et al.Mouse embryo culture as quality control for human in vitro fertilization:the one-cea versus the two cell model.Ferfil Stenl,1988,49∶516
, http://www.100md.com
2，Wolf DP.In vitro fertilization and embryo transfer.New York:Plenum Press,1988∶66
3，QuinnP,Horstman FC.Is the mouse a goul model for the haman with respect to the development of the preimplantation embryo in vitro.Oxford:Oxford University Press，1988∶173
4，Condon-Mahony M,Wortham Jw Jr,Bundren Jc,et al.Evaluation of human fetal cord sera,Ham's F-10 medium and in vitro cultare materials with a mouse in vivo fertilizarion sysfem.Fertil Steril,1985,44∶521
, http://www.100md.com
5，Krzyminska V,O'Neill C.The effects of cryopreservation and thawing on the development in vitro and in vivo of biopsied 8-cell mruse tmbryos.Hum Reprod,1991,6(6)∶832
6，Ahmadi A,NgSc.Fertilization and development of mouse oocyte injected with membrane damaged spermatozoz.Hum Reprod,1997,12(12)∶2797
2000年3月2日收稿, http://www.100md.com