干细胞移植后免疫重建淋巴细胞克隆的基因图谱分析
作者：朱平 李健为 马明信 岑溪南 许蔚林 张野坪 虞积仁
单位：100034 北京大学第一医院血液内科
关键词：受体；抗原；T细胞；γ-δ；造血干细胞；核苷酸图谱
中华医学杂志000910 【摘要】 目的 分析肿瘤患者干细胞移植后T淋巴细胞克隆重新形成的过程，了解免疫重建与临床缓解之间的关系。方法 利用不同γ/δ T淋巴细胞克隆具有各自不同的TCRγ基因重排方式的特点，PCR扩增TCRγ各个V区基因、变性胶电泳形成基因指纹图谱，观察8例患者异基因骨髓移植和自体外周血干细胞移植后不同时期的变化。结果 基因组DNA各个TCRγV区重排基因在60 cm测序胶上电泳可以形成由近百条基因片段条带组成的指纹图谱；移植后新出现的条带往往代表扩增的一个淋巴细胞克隆；基因指纹图谱可反映干细胞移植后淋巴细胞克隆由少到多，由小到大的免疫重建过程。移植后会出现一些扩增的T细胞克隆，在Genebank中比较分析1例多发性骨髓瘤移植后扩增的T细胞克隆的重排基因发现，与其同源的2个T细胞克隆都是识别同种抗原的。结论 基因指纹图谱法分析TCRγV区重排基因可以观察到干细胞移植患者免疫重建过程；移植患者预后与免疫重建过程相关；移植患者出现持续扩增的T细胞克隆可能与抗肿瘤功能有关。
, 百拇医药
Analysis of lymphocytic clone formation after stem cell transplantation and immunological reconstitution by gene fingerprinting
ZHU Ping
(Department of Hematology, The First Teaching Hospital, Beijing University , Beijing 100034, China)
LI Jianwei
(Department of Hematology, The First Teaching Hospital, Beijing University , Beijing 100034, China)
, 百拇医药
MA Mingxin, et al.
(Department of Hematology, The First Teaching Hospital, Beijing University , Beijing 100034, China)
【Abstract】 Objective To analyze T lymphocytic clone formation in patients with malignant disease after bone marrow or peripheral blood stem cell transplantation and to understand the relationship between immunological reconstitution and clinic remission. Methods Due to the different TCRγ gene rearrangements in different gamma/delta T cell clones, a gene fingerprinting was set up by PCR and denatured gel electrophoresis. The gene fingerprinting was used to analyze the gamma-delta T cell clone variations in 8 patients who received stem transplantation. In order to identify the source of the regenerated lymphocytes, the polymorphism of microsatellite was used at mean time. Results After PCR amplification and electrophoresis of each TCRγV region gene on a 60 cm sequence gel, a gene fingerprinting composed of about a hundred bands was set up. It showed the basic distribution of the dominant gamma/delta T cell clones in the body. Usually, a new band presenting after transplantation represented an expansive lymphocytic clone. Successful immunological reconstitution led to a good prognosis; and unsuccessful immunological reconstitution led to bad prognosis. After transplantation, some T cell clones expanded. Comparing the sequences of a expansive T cell clone in a multiple myeloma patient after auto-stem cell transplantation with 230 000 genes of immunoglobulin and T cell receptor in GeneBank, we found that two T cell line had homogenous sequences. Both T cell clones recognized homogeneous antigen. Conclusion A new method to observe the distribution of gamma/delta T cells called gene fingerprinting was set up. Gene fingerprinting is useful in the analysis of immunological reconstitution after stem cells transplantation. The effect of transplantation is correlated to immunological reconstitution. Transplantation patients may appear some expansive T cell clones; probably they have anti-tumor effect.
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【Key words】 Receptors antigen, T cell, gamma-delta； Hematopoietic stem cell； Nucleotide
干细胞移植治疗肿瘤和白血病已经取得较好疗效,但是移植后发生移植物抗宿主病、感染、肿瘤复发仍然是导致干细胞移植治疗失败的主要因素。正常人的淋巴细胞有多种克隆，能够识别各种各样不同的外来抗原，如果丧失了某些克隆，意味着患者出现某种免疫缺陷。但是移植后少数干细胞是怎样重新发展成完整的能够识别各种抗原并发生反应的淋巴细胞群落，迄今没有完整分析。我们试图用TCRγ基因指纹图谱的方式显示T细胞克隆，以了解正常人γ/δT细胞的克隆是怎样分布的，以确定病理条件下不同克隆的变化。我们通过干细胞移植患者了解免疫重建后T细胞克隆形成规律，一些T细胞克隆与疾病缓解之间是否有关。
对象和方法
一、对象
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8例患血液系统肿瘤接受干细胞移植治疗的患者。其中例1男，40岁，多发性骨髓瘤(MM)Ⅲ期B组，两次自身外周血干细胞移植(APBSCT)；例2男，50岁，非霍奇金淋巴瘤(NHL)Ⅲ期A组，APBSCT；例3女，28岁，慢性髓细胞白血病(CML), 异基因骨髓移植(allo-BMT)；例4男，40岁，CML, 移植物抗宿主病(GVHD)；例5男，31岁，CML, GVHD，间质性肺炎；例6女，21岁，急性髓细胞白血病(AML)M4型，APBSCT，4个月后肿瘤复发死亡；例7女，35岁，NHLIV期B组，APBSCT，1年后肿瘤复发；例8男，19岁，急性淋巴细胞白血病(ALL)allo-BMT 6个月后感染,肿瘤复发。另外选择3例 NHL化疗前患者；CEM人淋巴细胞白血病/淋巴瘤细胞系；20例正常人。
二、方法
1.常规提取基因组DNA。
2.建立TCRγ基因指纹图谱：设计6个V区与J区引物: V2: TCCAGGGAAGTATTATACTTAC；V3：TACTATGACGTCTCCACCGGTT；V4：GGAATCAGGAAT-CAGC；V5: AGCTGGATATTGATACTACGGTA；V8：GAAAATGCCGTCTACAC；V9：ACAGTTCCTGGTGTC-CATTTCAAG；Jγ1/2：TGTTGTTCCACTGCCAAA；分别进行PCR扩增。用同位素标记PCR产物后在60 cm的6%测序胶上电泳，长度不同的片段位置有差异，可得到由多条条带组成的基因指纹图谱。
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3.不同染色体的微卫星选择：利用微卫星多态性证实4例异基因骨髓移植后成活的淋巴细胞来源于供者。选择8个微卫星位点(表1)。
4.同位素标记：用Promega公司pGEM-T克隆试剂盒：pGEM-T(50 ng/μl)、T4DNA连接酶(3 U/μl)、10×T4 DNA连接酶缓冲液; Amersham生命科学公司测序试剂盒, 同位素标记法测序。
结果
1.基因指纹图谱能显示体内多种淋巴细胞克隆分布：扩增正常人基因组 DNA TCRγV区家族, 在60cm测序胶上电泳,不同V区出现大小不等的条带(图1)。组合各个 TCRγV区家族可以形成有不同长度的近百条V区基因片段组成的指纹图谱。由于已知每种TCRγ重排基因代表一个淋巴细胞克隆，指纹图谱上每一条带可代表一些优势淋巴细胞克隆。用指纹图谱分析不同时间采集的正常人标本发现，同一正常个体不同时间的各条带大小基本稳定。
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表1 不同染色体上的微卫星选择 微卫星
染色体位置
D11s1356
11q23
D1s209
1p23
D8s559
8q22
D9s179
9q23
D12s89
12p13
, 百拇医药
D12s269
12p13
D15s131
15q21
D16s515
16q22
D17s798
17q21
DCC(MS)
18q23
D21s1252
21q22
, 百拇医药
D22s315
22q11
图1 8例不同正常人的TCRγ V3区的60 cm测序胶上电泳
可以形成有不同长度基因片段的指纹图谱
2.基因指纹图谱扫描后可得到各条带的强度分布曲线：可定量比较TCRγ基因片段代表的淋巴细胞克隆的大小。不同V区片段大致都呈正态分布。
3.指纹图谱上新出现的条带通常代表一个优势淋巴细胞克隆： 将例1移植患者0月、12月、20月稳定出现的条带(图2)切下，克隆条带中的基因片段做测序分析，结果获得的8个克隆中6个基因片段(0月1/2、12月3/4、20月 1/2)序列一致。
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注：箭头标示出1个移植后明显扩增的新条带
图2 例1两次自体外周血干细胞移植的MM的
V3区图谱
4.指纹图谱分析移植后患者T淋巴细胞克隆的变化：移植后不同时间的基因指纹图谱反映了移植后淋巴细胞克隆由少到多，由弱到强的免疫重建过程。患者预后与免疫重建过程相关，5例患者获得免疫重建则预后好，3例患者免疫重建障碍则预后差,半年后白血病或者淋巴瘤复发，例6死亡。异基因移植患者用微卫星证实骨髓淋巴细胞来源于供者。
5.患者移植后扩增的克隆与临床的关系：异基因移植后出现供者的克隆并可出现个别较大的克隆(图3); 例1 MM患者自身干细胞移植后出现一个新克隆并持续扩增,结合临床表现和检测指标，发现这个克隆的扩增与疾病缓解同步(图4)。如前所述从3个不同时段获得的8个克隆中有6个基因片段序列一致,将此序列送国际基因库分析比较，与基因库230 000个Ig/TCR序列作比较分析，在Genebank中与这个T细胞克隆基因序列最相似的8个T细胞克隆仅2个有已知功能，分别为Flament等报道的人T细胞i细胞系，它识别的抗原是HLA-DR[1]；另一个是Mami-Chouaib等[2]报道的人外周血T细胞克隆，它识别的抗原是TCT.1/CD48，均为识别同种抗原的T细胞系，由此推测扩增的T细胞克隆与抗自身肿瘤有关。
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D为供者，箭头所指为新出现的较大的克隆
图3 例3异基因骨髓移植后2、3月各个V区家族出现
一些较大的淋巴细胞克隆
注：纵坐标每格代表血红蛋白40 g/L；骨髓浆细胞5%；克隆强度积分0.2；IgD 100 IU/ml
图4 例1 MM患者自身外周血干细胞移植后，有一个
克隆随移植后时间逐渐增大，同时患者Hb升高，髓浆细胞、血沉、M蛋白降低
讨论
γ/δ T细胞的功能与肿瘤抑制有关[3，4]，了解这一亚群细胞在干细胞移植后功能重建的过程将对改善移植后的治疗有很大帮助[5，6]。可是迄今为止，移植后γ/δ T细胞的功能恢复过程仍然不清楚。我们建立了一种分析TCRγ基因的指纹图谱法，又称为长度谱型法[7]。这种方法的基础是每个γ/δ T淋巴细胞克隆都有自己特征性的TCRγ基因重排，重排片段大小和构象存在微小的差异。通过区分代表这些片段的条带可以识别淋巴细胞克隆，条带浓度大代表其中的淋巴细胞克隆较大。尽管同一条带可能存在TCRγ序列不同而PCR产物的长度相同的克隆，可是由于机体淋巴细胞各个克隆的大小并不均一，显现的条带往往代表淋巴细胞中的少数经常利用的优势克隆。我们将移植后患者新显现的条带切割下来测序的实际结果表明，新条带通常代表的是一个克隆。这一条带的浓度定量可以作为衡量克隆大小的尺度，浓度增高就是克隆扩增的标志。这样就可以区分一些干细胞移植患者的扩增淋巴细胞克隆，进一步了解这些克隆扩增的意义。在实验中我们选用ras基因作为参照，以排除DNA模板加样量引起的误差和操作原因引起的PCR扩增失败。Garderet等[8]用所谓的Genescan的方法分析正常人的αβT细胞和我们用基因指纹图谱分析γδ T细胞都表明，不同人的淋巴细胞的克隆大小总体分布是大致相似的。如果某一条带的强度相对于正常分布增加(或降低)，提示条带代表的个别淋巴细胞克隆扩增(或缩小)。计算机扫描分析条带的强度可以比较克隆间的大小。目前我们的病例仅仅观察了两年，还不知道移植后γ/δ T细胞克隆最终是否能够恢复与正常人相同的状态。有报道骨髓移植(BMT)后2～3年特异性免疫功能才恢复到正常水平[9]，还有人报道移植后16年患者的α/β T细胞功能仍然与正常人有差异[10]。移植后淋巴细胞克隆恢复的状态在一定程度上反映移植患者的预后。本组持续缓解的5例患者，淋巴细胞克隆数量均逐渐增加，另外3例移植后肿瘤复发的患者，尽管在移植后早期外周血也出现了一些γ/δ T细胞克隆，然而随着时间的延长，克隆的数量没有明显增加，一个患者的克隆数甚至逐渐减少。由于淋巴细胞克隆的多样性不能恢复，免疫功能持续低下，有可能导致机体不能够及时发现和清除残留的肿瘤细胞，最终肿瘤复发。成功移植患者的某些克隆可以明显扩增[11]，还可能出现一些新的克隆。本组异基因移植者这种克隆扩增现象非常明显。我们事先用微卫星多态性方法证实这些扩增的克隆的确来源于供者。很可能这些扩增的克隆代表移植后对宿主发生了免疫反应的T细胞克隆。为了更清楚地了解移植后这些T细胞克隆发生扩增的原因和临床意义，我们对其中一患者持续扩增的克隆进行了进一步的分析。此患者系多发性骨髓瘤，经两次自体PBSCT后获得长期缓解。在移植后出现一个明显扩增的条带。将相应位置的电泳胶切割下来测序分析发现，移植前该克隆已经存在。一个移植前的非优势克隆移植后明显扩增,显然免疫重建后患者机体的免疫系统发生了变化。值得注意的是，这个克隆扩增的时间与临床上患者肿瘤逐渐获得缓解的时间同步，缓解后并没有出现可能刺激淋巴细胞扩增(例如长期感染等)的合并症。将这个克隆的TCR γ基因序列传送到国际基因库分析比较发现，与这个克隆的DNA序列最相似的T细胞克隆中，有两个克隆已知其识别功能，它们识别的均是同种抗原的细胞[1，2]。故推测，这个T细胞克隆很可能具有识别肿瘤细胞抗原功能。如将患者淋巴细胞用有限稀释法做单细胞培养后用已获得的特异性TCR γ序列作为探针识别并分离出该克隆，有可能做进一步研究了解这个克隆的功能。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870354)；北京市自然科学基金资助项目(7992039)
参考文献
1，Flament C, Benmerah A, Bonneville M , et al .Human TCR-gamma/delta alloreactive response to HLA-DR molecules. Comparison with response of TCR-alpha/beta. J Immunol, 1994 , 153: 2890-2904 .
2，Mami-Chouaib F , Del Porto P, Delorme D , et al . Further evidence for a gamma/delta T cell receptor-mediated TCT.1/CD48 recognition. J Immunol, 1991, 147: 2864-2867.
, 百拇医药
3，Bluestone JA, Khattri R, Sciammas R, et al. TCR γ/δ cells: a specialized T-cell subset in the immune system. Annu Rev Cell Dev. Biol, 1995,11:307-353.
4，Kim HT, Nelson EL, Clayberger C, et al . γδ T Cell recognition of tumor Ig peptide. J Immunol, 1995,154: 1614-1623.
5，Koehne G, Zeller W, Stockschlaeder M, et al .Phenotype of lymphocyte subsets after autologous peripheral blood stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant ,1997, 19:149.
, 百拇医药
6，Kaur I, Voss SD, Gupta RS, et al. Human peripheral γδ T cells recognize hsp60 molecules on Daudi Brukitts's lymphoma cells. J Immunol ,1993, 150:2046-2055.
7，李健为, 朱平. 建立TCRγ长度谱型方法分析疾病中淋巴细胞克隆的消长.中华血液学杂志, 1999， 20：604-605.
8，Garderet L, Dilphy N , Douay C ,et al. The umbilical cord blood αβ T-cell repertoire: characteristics of a polyclonal and naive but completely formed repertoire. Blood ,1998, 91: 340-346.
, 百拇医药
9，Mackall CL, Gress RE. Pathways of T-cell regeration in mice and humans: implications for bone marrow transplantation and immunotherapy . Immunol Rev ,1997, 157:61-72.
10，Gaschet J，Denis C，Milpied N，et al. Alterations of T call repertoire after bone marrow transplantation: characterization of over-represented subsets. Bone Marrow Transplantation ,1995, 15: 427-435.
11，Liu X, Chesnokova V, Forman SJ ,et al .Molecular analysis of T-cell receptor repertoire in bone marrow transplant recipients: evidence for oligoclonal T-cell expansion in graft-versus-host disease lesions. Blood ,1996, 87:3032-3044.
(收稿日期：1999-10-08), 百拇医药
单位：100034 北京大学第一医院血液内科
关键词：受体；抗原；T细胞；γ-δ；造血干细胞；核苷酸图谱
中华医学杂志000910 【摘要】 目的 分析肿瘤患者干细胞移植后T淋巴细胞克隆重新形成的过程，了解免疫重建与临床缓解之间的关系。方法 利用不同γ/δ T淋巴细胞克隆具有各自不同的TCRγ基因重排方式的特点，PCR扩增TCRγ各个V区基因、变性胶电泳形成基因指纹图谱，观察8例患者异基因骨髓移植和自体外周血干细胞移植后不同时期的变化。结果 基因组DNA各个TCRγV区重排基因在60 cm测序胶上电泳可以形成由近百条基因片段条带组成的指纹图谱；移植后新出现的条带往往代表扩增的一个淋巴细胞克隆；基因指纹图谱可反映干细胞移植后淋巴细胞克隆由少到多，由小到大的免疫重建过程。移植后会出现一些扩增的T细胞克隆，在Genebank中比较分析1例多发性骨髓瘤移植后扩增的T细胞克隆的重排基因发现，与其同源的2个T细胞克隆都是识别同种抗原的。结论 基因指纹图谱法分析TCRγV区重排基因可以观察到干细胞移植患者免疫重建过程；移植患者预后与免疫重建过程相关；移植患者出现持续扩增的T细胞克隆可能与抗肿瘤功能有关。
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Analysis of lymphocytic clone formation after stem cell transplantation and immunological reconstitution by gene fingerprinting
ZHU Ping
(Department of Hematology, The First Teaching Hospital, Beijing University , Beijing 100034, China)
LI Jianwei
(Department of Hematology, The First Teaching Hospital, Beijing University , Beijing 100034, China)
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MA Mingxin, et al.
(Department of Hematology, The First Teaching Hospital, Beijing University , Beijing 100034, China)
【Abstract】 Objective To analyze T lymphocytic clone formation in patients with malignant disease after bone marrow or peripheral blood stem cell transplantation and to understand the relationship between immunological reconstitution and clinic remission. Methods Due to the different TCRγ gene rearrangements in different gamma/delta T cell clones, a gene fingerprinting was set up by PCR and denatured gel electrophoresis. The gene fingerprinting was used to analyze the gamma-delta T cell clone variations in 8 patients who received stem transplantation. In order to identify the source of the regenerated lymphocytes, the polymorphism of microsatellite was used at mean time. Results After PCR amplification and electrophoresis of each TCRγV region gene on a 60 cm sequence gel, a gene fingerprinting composed of about a hundred bands was set up. It showed the basic distribution of the dominant gamma/delta T cell clones in the body. Usually, a new band presenting after transplantation represented an expansive lymphocytic clone. Successful immunological reconstitution led to a good prognosis; and unsuccessful immunological reconstitution led to bad prognosis. After transplantation, some T cell clones expanded. Comparing the sequences of a expansive T cell clone in a multiple myeloma patient after auto-stem cell transplantation with 230 000 genes of immunoglobulin and T cell receptor in GeneBank, we found that two T cell line had homogenous sequences. Both T cell clones recognized homogeneous antigen. Conclusion A new method to observe the distribution of gamma/delta T cells called gene fingerprinting was set up. Gene fingerprinting is useful in the analysis of immunological reconstitution after stem cells transplantation. The effect of transplantation is correlated to immunological reconstitution. Transplantation patients may appear some expansive T cell clones; probably they have anti-tumor effect.
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【Key words】 Receptors antigen, T cell, gamma-delta； Hematopoietic stem cell； Nucleotide
干细胞移植治疗肿瘤和白血病已经取得较好疗效,但是移植后发生移植物抗宿主病、感染、肿瘤复发仍然是导致干细胞移植治疗失败的主要因素。正常人的淋巴细胞有多种克隆，能够识别各种各样不同的外来抗原，如果丧失了某些克隆，意味着患者出现某种免疫缺陷。但是移植后少数干细胞是怎样重新发展成完整的能够识别各种抗原并发生反应的淋巴细胞群落，迄今没有完整分析。我们试图用TCRγ基因指纹图谱的方式显示T细胞克隆，以了解正常人γ/δT细胞的克隆是怎样分布的，以确定病理条件下不同克隆的变化。我们通过干细胞移植患者了解免疫重建后T细胞克隆形成规律，一些T细胞克隆与疾病缓解之间是否有关。
对象和方法
一、对象
, 百拇医药
8例患血液系统肿瘤接受干细胞移植治疗的患者。其中例1男，40岁，多发性骨髓瘤(MM)Ⅲ期B组，两次自身外周血干细胞移植(APBSCT)；例2男，50岁，非霍奇金淋巴瘤(NHL)Ⅲ期A组，APBSCT；例3女，28岁，慢性髓细胞白血病(CML), 异基因骨髓移植(allo-BMT)；例4男，40岁，CML, 移植物抗宿主病(GVHD)；例5男，31岁，CML, GVHD，间质性肺炎；例6女，21岁，急性髓细胞白血病(AML)M4型，APBSCT，4个月后肿瘤复发死亡；例7女，35岁，NHLIV期B组，APBSCT，1年后肿瘤复发；例8男，19岁，急性淋巴细胞白血病(ALL)allo-BMT 6个月后感染,肿瘤复发。另外选择3例 NHL化疗前患者；CEM人淋巴细胞白血病/淋巴瘤细胞系；20例正常人。
二、方法
1.常规提取基因组DNA。
2.建立TCRγ基因指纹图谱：设计6个V区与J区引物: V2: TCCAGGGAAGTATTATACTTAC；V3：TACTATGACGTCTCCACCGGTT；V4：GGAATCAGGAAT-CAGC；V5: AGCTGGATATTGATACTACGGTA；V8：GAAAATGCCGTCTACAC；V9：ACAGTTCCTGGTGTC-CATTTCAAG；Jγ1/2：TGTTGTTCCACTGCCAAA；分别进行PCR扩增。用同位素标记PCR产物后在60 cm的6%测序胶上电泳，长度不同的片段位置有差异，可得到由多条条带组成的基因指纹图谱。
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3.不同染色体的微卫星选择：利用微卫星多态性证实4例异基因骨髓移植后成活的淋巴细胞来源于供者。选择8个微卫星位点(表1)。
4.同位素标记：用Promega公司pGEM-T克隆试剂盒：pGEM-T(50 ng/μl)、T4DNA连接酶(3 U/μl)、10×T4 DNA连接酶缓冲液; Amersham生命科学公司测序试剂盒, 同位素标记法测序。
结果
1.基因指纹图谱能显示体内多种淋巴细胞克隆分布：扩增正常人基因组 DNA TCRγV区家族, 在60cm测序胶上电泳,不同V区出现大小不等的条带(图1)。组合各个 TCRγV区家族可以形成有不同长度的近百条V区基因片段组成的指纹图谱。由于已知每种TCRγ重排基因代表一个淋巴细胞克隆，指纹图谱上每一条带可代表一些优势淋巴细胞克隆。用指纹图谱分析不同时间采集的正常人标本发现，同一正常个体不同时间的各条带大小基本稳定。
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表1 不同染色体上的微卫星选择 微卫星
染色体位置
D11s1356
11q23
D1s209
1p23
D8s559
8q22
D9s179
9q23
D12s89
12p13
, 百拇医药
D12s269
12p13
D15s131
15q21
D16s515
16q22
D17s798
17q21
DCC(MS)
18q23
D21s1252
21q22
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D22s315
22q11
图1 8例不同正常人的TCRγ V3区的60 cm测序胶上电泳
可以形成有不同长度基因片段的指纹图谱
2.基因指纹图谱扫描后可得到各条带的强度分布曲线：可定量比较TCRγ基因片段代表的淋巴细胞克隆的大小。不同V区片段大致都呈正态分布。
3.指纹图谱上新出现的条带通常代表一个优势淋巴细胞克隆： 将例1移植患者0月、12月、20月稳定出现的条带(图2)切下，克隆条带中的基因片段做测序分析，结果获得的8个克隆中6个基因片段(0月1/2、12月3/4、20月 1/2)序列一致。
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注：箭头标示出1个移植后明显扩增的新条带
图2 例1两次自体外周血干细胞移植的MM的
V3区图谱
4.指纹图谱分析移植后患者T淋巴细胞克隆的变化：移植后不同时间的基因指纹图谱反映了移植后淋巴细胞克隆由少到多，由弱到强的免疫重建过程。患者预后与免疫重建过程相关，5例患者获得免疫重建则预后好，3例患者免疫重建障碍则预后差,半年后白血病或者淋巴瘤复发，例6死亡。异基因移植患者用微卫星证实骨髓淋巴细胞来源于供者。
5.患者移植后扩增的克隆与临床的关系：异基因移植后出现供者的克隆并可出现个别较大的克隆(图3); 例1 MM患者自身干细胞移植后出现一个新克隆并持续扩增,结合临床表现和检测指标，发现这个克隆的扩增与疾病缓解同步(图4)。如前所述从3个不同时段获得的8个克隆中有6个基因片段序列一致,将此序列送国际基因库分析比较，与基因库230 000个Ig/TCR序列作比较分析，在Genebank中与这个T细胞克隆基因序列最相似的8个T细胞克隆仅2个有已知功能，分别为Flament等报道的人T细胞i细胞系，它识别的抗原是HLA-DR[1]；另一个是Mami-Chouaib等[2]报道的人外周血T细胞克隆，它识别的抗原是TCT.1/CD48，均为识别同种抗原的T细胞系，由此推测扩增的T细胞克隆与抗自身肿瘤有关。
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D为供者，箭头所指为新出现的较大的克隆
图3 例3异基因骨髓移植后2、3月各个V区家族出现
一些较大的淋巴细胞克隆
注：纵坐标每格代表血红蛋白40 g/L；骨髓浆细胞5%；克隆强度积分0.2；IgD 100 IU/ml
图4 例1 MM患者自身外周血干细胞移植后，有一个
克隆随移植后时间逐渐增大，同时患者Hb升高，髓浆细胞、血沉、M蛋白降低
讨论
γ/δ T细胞的功能与肿瘤抑制有关[3，4]，了解这一亚群细胞在干细胞移植后功能重建的过程将对改善移植后的治疗有很大帮助[5，6]。可是迄今为止，移植后γ/δ T细胞的功能恢复过程仍然不清楚。我们建立了一种分析TCRγ基因的指纹图谱法，又称为长度谱型法[7]。这种方法的基础是每个γ/δ T淋巴细胞克隆都有自己特征性的TCRγ基因重排，重排片段大小和构象存在微小的差异。通过区分代表这些片段的条带可以识别淋巴细胞克隆，条带浓度大代表其中的淋巴细胞克隆较大。尽管同一条带可能存在TCRγ序列不同而PCR产物的长度相同的克隆，可是由于机体淋巴细胞各个克隆的大小并不均一，显现的条带往往代表淋巴细胞中的少数经常利用的优势克隆。我们将移植后患者新显现的条带切割下来测序的实际结果表明，新条带通常代表的是一个克隆。这一条带的浓度定量可以作为衡量克隆大小的尺度，浓度增高就是克隆扩增的标志。这样就可以区分一些干细胞移植患者的扩增淋巴细胞克隆，进一步了解这些克隆扩增的意义。在实验中我们选用ras基因作为参照，以排除DNA模板加样量引起的误差和操作原因引起的PCR扩增失败。Garderet等[8]用所谓的Genescan的方法分析正常人的αβT细胞和我们用基因指纹图谱分析γδ T细胞都表明，不同人的淋巴细胞的克隆大小总体分布是大致相似的。如果某一条带的强度相对于正常分布增加(或降低)，提示条带代表的个别淋巴细胞克隆扩增(或缩小)。计算机扫描分析条带的强度可以比较克隆间的大小。目前我们的病例仅仅观察了两年，还不知道移植后γ/δ T细胞克隆最终是否能够恢复与正常人相同的状态。有报道骨髓移植(BMT)后2～3年特异性免疫功能才恢复到正常水平[9]，还有人报道移植后16年患者的α/β T细胞功能仍然与正常人有差异[10]。移植后淋巴细胞克隆恢复的状态在一定程度上反映移植患者的预后。本组持续缓解的5例患者，淋巴细胞克隆数量均逐渐增加，另外3例移植后肿瘤复发的患者，尽管在移植后早期外周血也出现了一些γ/δ T细胞克隆，然而随着时间的延长，克隆的数量没有明显增加，一个患者的克隆数甚至逐渐减少。由于淋巴细胞克隆的多样性不能恢复，免疫功能持续低下，有可能导致机体不能够及时发现和清除残留的肿瘤细胞，最终肿瘤复发。成功移植患者的某些克隆可以明显扩增[11]，还可能出现一些新的克隆。本组异基因移植者这种克隆扩增现象非常明显。我们事先用微卫星多态性方法证实这些扩增的克隆的确来源于供者。很可能这些扩增的克隆代表移植后对宿主发生了免疫反应的T细胞克隆。为了更清楚地了解移植后这些T细胞克隆发生扩增的原因和临床意义，我们对其中一患者持续扩增的克隆进行了进一步的分析。此患者系多发性骨髓瘤，经两次自体PBSCT后获得长期缓解。在移植后出现一个明显扩增的条带。将相应位置的电泳胶切割下来测序分析发现，移植前该克隆已经存在。一个移植前的非优势克隆移植后明显扩增,显然免疫重建后患者机体的免疫系统发生了变化。值得注意的是，这个克隆扩增的时间与临床上患者肿瘤逐渐获得缓解的时间同步，缓解后并没有出现可能刺激淋巴细胞扩增(例如长期感染等)的合并症。将这个克隆的TCR γ基因序列传送到国际基因库分析比较发现，与这个克隆的DNA序列最相似的T细胞克隆中，有两个克隆已知其识别功能，它们识别的均是同种抗原的细胞[1，2]。故推测，这个T细胞克隆很可能具有识别肿瘤细胞抗原功能。如将患者淋巴细胞用有限稀释法做单细胞培养后用已获得的特异性TCR γ序列作为探针识别并分离出该克隆，有可能做进一步研究了解这个克隆的功能。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870354)；北京市自然科学基金资助项目(7992039)
参考文献
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(收稿日期：1999-10-08), 百拇医药