成骨细胞培养及冻存复苏后生物学特性比较
作者：曾敬 丘钜世 徐栋梁 张萌 梁惠珍
单位：(中山医科大学病理学教研室，广州 510089)
关键词：成骨细胞；低温保藏；复苏术
临床与实验病理学杂志000216 摘要 目的:了解冻存复苏过程对保持成骨细胞生物学特性的影响。方法:通过细胞组化、免疫组化以及图像分析等方法对冻存和非冻存(新鲜制备)的细胞在其形态及功能方面进行了比较。结果：两组ALP染色、茜素红S法、V-G法、免疫组化法的结果均差异无显著性(P>0.05)。但细胞存活率与冻存时间密切相关；随冻存时间延长，其存活率下降。结论：两组细胞保持了某些相似的生物学行为，如细胞形态、生长过程、基质分泌等。冻存时间对保存的成骨细胞存活率有影响。
中图分类号 R329.2 文献标识码 A 文章编号 1001-7399(2000)02-0137-03
, 百拇医药
A comparison study on biologic phenotypes of cultured osteoblasts and which after cryopreservation
Zeng Jing， Qiu Jushi， Xu Dongliang， Zhang Meng， Liang Huizhen
Dept of Pathol,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510089
Dept of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of SUMS,Guangzhou 510089
ABSTRACT Purpose To study the effects of biological characters of osteoblasts after cryopreservation and resuscitation. Method The compared studies were done in cultured osteoblasts and those after cryopreservation by histochemistry, immunohistochemistry and image analysis in cytomorphology and functions. Results The results showed that there were no differences between two groups in ALP staining, alizarin red S staining, Van Gieson staining and immunohistochemistry(P>0.05). But the cell survival rate was related to the time after cryopreservation. As the time after cryopreservation went on, its survival rate was declining. Conclusion Two groups had some similar biological behaviors in cytomorphology, growth process and matrix secrete etc. The time after cryopreservation affected the survival rate of osteoblasts after cryopreservation.
, 百拇医药
KEY WORDS osteoblasts；cryopreservation；resuscitation
随着人口老龄化的加剧，对老年病的研究方兴未艾。目前，对于由机体衰老引起的老年性骨质疏松及其所致的骨折愈合困难，甚至不愈合，各种治疗疗效均不确切。如何促进衰老骨的骨重建修复，因密切关联老年人的生存质量和寿命，日渐成为人们关注的焦点。近年来，成骨细胞的同种异体移植〔1〕，因其独特的优点，被认为是解决这一问题的一种较为理想的方法。其中，经低温保存后〔2〕的成骨细胞是否能存活并保持其生物学特性是这一构想的关键。本实验在成功地建立成骨细胞培养的基础上，并与冻存复苏后成骨细胞进行了形态学、组织化学及免疫组化等方面的比较研究。
1 材料与方法
1.1 材料 取自5天龄SD乳鼠颅骨。
, http://www.100md.com 1.2 方法
1.2.1 颅骨成骨细胞分离及培养 无菌操作下，取5 天龄SD乳鼠颅骨，经无菌冷Hanks液洗涤2～3次，在含10%小牛血清DMEM培养基中将其反复剪碎至1 mm×1 mm大小的碎片，置37℃、5% CO2饱和湿度培养箱培养。当原代细胞融合成单层后，适时进行传代培养，所传代数在5代之内。
1.2.2 冻存 将生长旺盛之细胞消化离心后加入DMSO冻存液0.5 ml，吸入冻存管中，程序性逐级降温，最后投入液氮中。
1.2.3 复苏 将冻存管从液氮中取出，迅速投入42℃温水中， 不停搅动，直至管中液体完全溶解；超净台上将细胞悬液加入已加好培液的培养瓶中，37℃培养箱中静置24 h 。观察细胞贴壁情况，换全液。
1.2.4 分组 (1) 实验组：液氮冷冻3个月细胞；(2) 对照组：新鲜收获的成骨细胞：两者分别接种于50 ml培养瓶中， DMEM含10%小牛血清的培养液，置37℃、5% CO2培养箱。
, 百拇医药
1.2.5 成活细胞计数 复苏24 h后计数到的贴壁细胞数作为复苏后的成活细胞数。成活细胞数与冻存前计数细胞数的比值作为细胞的存活率。
1.2.6 细胞爬片的制备 在已消毒的载玻片上分别滴入两组细胞密度适量的细胞悬液，待细胞贴壁后取出，用4℃冷Hanks液冲洗2次，4℃冷丙酮固定15 min，备用。
1.2.7 形态学观察
1.2.7.1 动态观察 每日定时分别观察两组细胞的形态及生长过程，并摄影记录。
1.2.7.2 HE及组织化学 对两组细胞爬片分别行HE、ALP染色,茜素红S法、V-G法胶原染色。
1.2.8 免疫组化
1.2.8.1 试剂 Ⅰ抗(VEGF,TGF-β1,bFGF和Ⅰ型胶原)购自北京中山公司，S-P超敏广谱试剂盒(福州迈新公司)，DAB显色试剂盒(福州迈新公司)。
, 百拇医药
1.2.8.2 方法 两组细胞爬片分别于蒸馏水中洗2次，胰酶消化30 min，PBS 5 min×3次；加入Ⅰ抗4℃过夜；PBS 5 min×3次，加Ⅱ抗，PBS 洗5 min×3次，加Ⅲ抗；PBS 洗5 min×3次，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。
1.2.8.3 图像分析 分别对两组免疫组化染色片子进行图像分析。
2 结果
2.1 细胞存活率 成骨细胞冻存复苏的细胞存活率与冻存的时间密切相关；随冻存时间延长，其存活率下降；冻存1周存活率96%～98%，2周95%；1月90%；3月87%～88%；6月84%～85%。
2.2 细胞形态学观察
2.2.1 倒置显微镜动态观察 (1)新鲜植块培养的最初3天，其周围有大量小而圆的细胞，以造血细胞为主，随培养时间延长，这些细胞逐渐坏死碎破或随换液清除。植块周围3～7天有细胞长出，植块初长出的细胞呈长梭形，围绕在植块周围形成所谓“生长晕”。细胞胞浆透亮，有核及明显的核仁，细胞整体形态与成纤维细胞相似，胞浆内颗粒少，核圆，位于细胞中间，核仁多见1个，也有2～3个者。随培养时间延长，有些植块细胞生长快，植块周围细胞已开始融合成片，分界较为模糊，细胞明显变短变宽，胞浆中出现黑色颗粒，随时间而逐渐变成黑色斑块物。细胞持续生长可密集重叠形成编织骨状(图1)。 (2) 冻存复苏后的细胞，镜下形态与上述差异不大，大部分于24 h内贴壁，贴壁后1～3天其生命活动缓慢，细胞分裂象少见，一般3天后其生命活动方始与新鲜培养者差异不大。两组均符合成骨细胞的形态特征〔3，4〕。
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图1 新制备成骨细胞形态。×100
2.2.2 HE及组化染色 (1) HE染色：显示两组成骨细胞形态呈多角形或菱形，细胞核为圆形，多有1个核仁，也有2～3个者。胞浆内可见嗜苏木精之蓝色颗粒。(2) ALP细胞化学染色： 两组细胞经ALP孵育液孵育和苏木精复染，大部分细胞的胞质中可见褐色的细小颗粒，有些融合成块状。阴性细胞仅见染成淡蓝色的核(图2)。计算10个视野两组之间的阴性、阳性细胞数(阴性对照采用人胚肺成纤维细胞)，结果见表1。(3) 茜素红S法钙染色：两组均可见桔红色的钙盐沉淀(图3)。(4) V-G法示胶原：两组均可见红色的胶原，蓝色的胞核和黄色的胞质。
图2 冻存细胞ALP染色呈强阳性。×100表1 ALP细胞化学染色结果 片 号
+
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-
阳性率(%)
1(冻存1月后复苏)
809
91
89.89
2(冻存1周后复苏)
764
62
92.49
3(新鲜制备)
789
74
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91.43
合 计
2362
227
91.23
进行三组间两两比较，P>0.05
图3 冻存细胞连续培养4周后钙染色(+)。×100
2.2.3 免疫组化染色〔5〕 两组VEGF、TGF-β1、bFGF和Ⅰ型胶原均有阳性，经计算机灰度扫描图像分析，认为两者含量差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
, http://www.100md.com
在本实验中我们培养的细胞表达较高的ALP活性，并有钙结节形成，这些均是成骨细胞的典型特征。我们知道同种异体细胞移植的成功，不仅要求细胞能耐受冻存复苏的过程，更重要的是要求存活的细胞必须保持该细胞原有的生物学特性，包括其正常的形态和功能。从上述实验中我们不难看出，除只有冻存时间与细胞存活率之间有一定关系之外(随冻存时间延长，其存活率下降)，两组细胞无论在细胞形态、生长过程、基质分泌、钙结节形成、胶原合成以及促生长因子的合成分泌等方面都不存在显著的差异。两组细胞在实验过程中均呈成纤维细胞样的梭形细胞形态，两者均有高ALP活性，有形成钙结节的能力和分泌胶原的能力。因此，两组细胞在本实验中仍保持了成骨细胞的某些生物学特性，并能在体外分裂增殖，且本方法周期性短、重复性好，不仅为研究成骨细胞培养模型提供了一种新的手段；也为今后同种异体骨细胞移植的开展奠定了一定实验室的依据。
基金项目：广东省重点科技攻关项目资助(No 9622050-03)
作者简介：曾 敬，29岁，女，博士生。研究方向：骨质疏松性骨折愈合
, 百拇医药
参考文献
1，姚振强，曾才铭，唐景清.骨膜成骨细胞修复缺损的实验研究.中国修复与重建外科杂志，1996；10(3):173～175
2，Tornford WW, Duff GP,Mankin HJ. Experimental freezepreservation of chondrocytes. Clin Orthop，1985；197:11
3，Marie PJ, Lomri A,SabbaghA et al. Culture and behavioral of osteoblastic cells isolated from normal trabecular bone surface. In Vitro Cell Dev Biol, 1989;25(4):373
4，Maniatoulous C, Sodek J, Melcher AH.Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res, 1988;254:314
5，丘钜世，文剑明，张 萌等.人骨髓间质细胞的培养及4-NQ诱发其恶性转化的实验.中华骨科杂志，1992；12(2)：144～147
收稿日期：, http://www.100md.com
单位：(中山医科大学病理学教研室，广州 510089)
关键词：成骨细胞；低温保藏；复苏术
临床与实验病理学杂志000216 摘要 目的:了解冻存复苏过程对保持成骨细胞生物学特性的影响。方法:通过细胞组化、免疫组化以及图像分析等方法对冻存和非冻存(新鲜制备)的细胞在其形态及功能方面进行了比较。结果：两组ALP染色、茜素红S法、V-G法、免疫组化法的结果均差异无显著性(P>0.05)。但细胞存活率与冻存时间密切相关；随冻存时间延长，其存活率下降。结论：两组细胞保持了某些相似的生物学行为，如细胞形态、生长过程、基质分泌等。冻存时间对保存的成骨细胞存活率有影响。
中图分类号 R329.2 文献标识码 A 文章编号 1001-7399(2000)02-0137-03
, 百拇医药
A comparison study on biologic phenotypes of cultured osteoblasts and which after cryopreservation
Zeng Jing， Qiu Jushi， Xu Dongliang， Zhang Meng， Liang Huizhen
Dept of Pathol,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510089
Dept of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of SUMS,Guangzhou 510089
ABSTRACT Purpose To study the effects of biological characters of osteoblasts after cryopreservation and resuscitation. Method The compared studies were done in cultured osteoblasts and those after cryopreservation by histochemistry, immunohistochemistry and image analysis in cytomorphology and functions. Results The results showed that there were no differences between two groups in ALP staining, alizarin red S staining, Van Gieson staining and immunohistochemistry(P>0.05). But the cell survival rate was related to the time after cryopreservation. As the time after cryopreservation went on, its survival rate was declining. Conclusion Two groups had some similar biological behaviors in cytomorphology, growth process and matrix secrete etc. The time after cryopreservation affected the survival rate of osteoblasts after cryopreservation.
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KEY WORDS osteoblasts；cryopreservation；resuscitation
随着人口老龄化的加剧，对老年病的研究方兴未艾。目前，对于由机体衰老引起的老年性骨质疏松及其所致的骨折愈合困难，甚至不愈合，各种治疗疗效均不确切。如何促进衰老骨的骨重建修复，因密切关联老年人的生存质量和寿命，日渐成为人们关注的焦点。近年来，成骨细胞的同种异体移植〔1〕，因其独特的优点，被认为是解决这一问题的一种较为理想的方法。其中，经低温保存后〔2〕的成骨细胞是否能存活并保持其生物学特性是这一构想的关键。本实验在成功地建立成骨细胞培养的基础上，并与冻存复苏后成骨细胞进行了形态学、组织化学及免疫组化等方面的比较研究。
1 材料与方法
1.1 材料 取自5天龄SD乳鼠颅骨。
, http://www.100md.com 1.2 方法
1.2.1 颅骨成骨细胞分离及培养 无菌操作下，取5 天龄SD乳鼠颅骨，经无菌冷Hanks液洗涤2～3次，在含10%小牛血清DMEM培养基中将其反复剪碎至1 mm×1 mm大小的碎片，置37℃、5% CO2饱和湿度培养箱培养。当原代细胞融合成单层后，适时进行传代培养，所传代数在5代之内。
1.2.2 冻存 将生长旺盛之细胞消化离心后加入DMSO冻存液0.5 ml，吸入冻存管中，程序性逐级降温，最后投入液氮中。
1.2.3 复苏 将冻存管从液氮中取出，迅速投入42℃温水中， 不停搅动，直至管中液体完全溶解；超净台上将细胞悬液加入已加好培液的培养瓶中，37℃培养箱中静置24 h 。观察细胞贴壁情况，换全液。
1.2.4 分组 (1) 实验组：液氮冷冻3个月细胞；(2) 对照组：新鲜收获的成骨细胞：两者分别接种于50 ml培养瓶中， DMEM含10%小牛血清的培养液，置37℃、5% CO2培养箱。
, 百拇医药
1.2.5 成活细胞计数 复苏24 h后计数到的贴壁细胞数作为复苏后的成活细胞数。成活细胞数与冻存前计数细胞数的比值作为细胞的存活率。
1.2.6 细胞爬片的制备 在已消毒的载玻片上分别滴入两组细胞密度适量的细胞悬液，待细胞贴壁后取出，用4℃冷Hanks液冲洗2次，4℃冷丙酮固定15 min，备用。
1.2.7 形态学观察
1.2.7.1 动态观察 每日定时分别观察两组细胞的形态及生长过程，并摄影记录。
1.2.7.2 HE及组织化学 对两组细胞爬片分别行HE、ALP染色,茜素红S法、V-G法胶原染色。
1.2.8 免疫组化
1.2.8.1 试剂 Ⅰ抗(VEGF,TGF-β1,bFGF和Ⅰ型胶原)购自北京中山公司，S-P超敏广谱试剂盒(福州迈新公司)，DAB显色试剂盒(福州迈新公司)。
, 百拇医药
1.2.8.2 方法 两组细胞爬片分别于蒸馏水中洗2次，胰酶消化30 min，PBS 5 min×3次；加入Ⅰ抗4℃过夜；PBS 5 min×3次，加Ⅱ抗，PBS 洗5 min×3次，加Ⅲ抗；PBS 洗5 min×3次，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固。
1.2.8.3 图像分析 分别对两组免疫组化染色片子进行图像分析。
2 结果
2.1 细胞存活率 成骨细胞冻存复苏的细胞存活率与冻存的时间密切相关；随冻存时间延长，其存活率下降；冻存1周存活率96%～98%，2周95%；1月90%；3月87%～88%；6月84%～85%。
2.2 细胞形态学观察
2.2.1 倒置显微镜动态观察 (1)新鲜植块培养的最初3天，其周围有大量小而圆的细胞，以造血细胞为主，随培养时间延长，这些细胞逐渐坏死碎破或随换液清除。植块周围3～7天有细胞长出，植块初长出的细胞呈长梭形，围绕在植块周围形成所谓“生长晕”。细胞胞浆透亮，有核及明显的核仁，细胞整体形态与成纤维细胞相似，胞浆内颗粒少，核圆，位于细胞中间，核仁多见1个，也有2～3个者。随培养时间延长，有些植块细胞生长快，植块周围细胞已开始融合成片，分界较为模糊，细胞明显变短变宽，胞浆中出现黑色颗粒，随时间而逐渐变成黑色斑块物。细胞持续生长可密集重叠形成编织骨状(图1)。 (2) 冻存复苏后的细胞，镜下形态与上述差异不大，大部分于24 h内贴壁，贴壁后1～3天其生命活动缓慢，细胞分裂象少见，一般3天后其生命活动方始与新鲜培养者差异不大。两组均符合成骨细胞的形态特征〔3，4〕。
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图1 新制备成骨细胞形态。×100
2.2.2 HE及组化染色 (1) HE染色：显示两组成骨细胞形态呈多角形或菱形，细胞核为圆形，多有1个核仁，也有2～3个者。胞浆内可见嗜苏木精之蓝色颗粒。(2) ALP细胞化学染色： 两组细胞经ALP孵育液孵育和苏木精复染，大部分细胞的胞质中可见褐色的细小颗粒，有些融合成块状。阴性细胞仅见染成淡蓝色的核(图2)。计算10个视野两组之间的阴性、阳性细胞数(阴性对照采用人胚肺成纤维细胞)，结果见表1。(3) 茜素红S法钙染色：两组均可见桔红色的钙盐沉淀(图3)。(4) V-G法示胶原：两组均可见红色的胶原，蓝色的胞核和黄色的胞质。
图2 冻存细胞ALP染色呈强阳性。×100表1 ALP细胞化学染色结果 片 号
+
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-
阳性率(%)
1(冻存1月后复苏)
809
91
89.89
2(冻存1周后复苏)
764
62
92.49
3(新鲜制备)
789
74
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91.43
合 计
2362
227
91.23
进行三组间两两比较，P>0.05
图3 冻存细胞连续培养4周后钙染色(+)。×100
2.2.3 免疫组化染色〔5〕 两组VEGF、TGF-β1、bFGF和Ⅰ型胶原均有阳性，经计算机灰度扫描图像分析，认为两者含量差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
, http://www.100md.com
在本实验中我们培养的细胞表达较高的ALP活性，并有钙结节形成，这些均是成骨细胞的典型特征。我们知道同种异体细胞移植的成功，不仅要求细胞能耐受冻存复苏的过程，更重要的是要求存活的细胞必须保持该细胞原有的生物学特性，包括其正常的形态和功能。从上述实验中我们不难看出，除只有冻存时间与细胞存活率之间有一定关系之外(随冻存时间延长，其存活率下降)，两组细胞无论在细胞形态、生长过程、基质分泌、钙结节形成、胶原合成以及促生长因子的合成分泌等方面都不存在显著的差异。两组细胞在实验过程中均呈成纤维细胞样的梭形细胞形态，两者均有高ALP活性，有形成钙结节的能力和分泌胶原的能力。因此，两组细胞在本实验中仍保持了成骨细胞的某些生物学特性，并能在体外分裂增殖，且本方法周期性短、重复性好，不仅为研究成骨细胞培养模型提供了一种新的手段；也为今后同种异体骨细胞移植的开展奠定了一定实验室的依据。
基金项目：广东省重点科技攻关项目资助(No 9622050-03)
作者简介：曾 敬，29岁，女，博士生。研究方向：骨质疏松性骨折愈合
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参考文献
1，姚振强，曾才铭，唐景清.骨膜成骨细胞修复缺损的实验研究.中国修复与重建外科杂志，1996；10(3):173～175
2，Tornford WW, Duff GP,Mankin HJ. Experimental freezepreservation of chondrocytes. Clin Orthop，1985；197:11
3，Marie PJ, Lomri A,SabbaghA et al. Culture and behavioral of osteoblastic cells isolated from normal trabecular bone surface. In Vitro Cell Dev Biol, 1989;25(4):373
4，Maniatoulous C, Sodek J, Melcher AH.Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell Tissue Res, 1988;254:314
5，丘钜世，文剑明，张 萌等.人骨髓间质细胞的培养及4-NQ诱发其恶性转化的实验.中华骨科杂志，1992；12(2)：144～147
收稿日期：, http://www.100md.com