Fas抗原在颊粘膜鳞癌中的表达及意义
作者：江宏兵 廖小宜 李 芃
单位：241001芜湖市，皖南医学院弋矶山医院口腔颌面外科，华西医科大学口腔医学院(廖小宜 李芃)
关键词：Fas抗原；颊粘膜鳞癌；细胞凋亡
Fas抗原在颊粘膜鳞癌中的表达及意义 提 要 为探讨Fas抗原在颊粘膜鳞癌中的表达分布特点及其相关生物学意义，采用免疫组织化学方法，分别对5例正常颊粘膜、34例颊粘膜鳞癌进行染色，观察Fas抗原表达分布情况。结果发现，颊粘膜上皮生发层中Fas抗原间断性弱表达，其它层细胞广泛表达；Fas抗原表达与颊炽膜鳞癌的分化程度有关(P<0.01)，高分化颊癌中，Fas抗原连续强阳性表达于癌细胞膜，低分化颊癌则呈间断性表达。由此提示，Fas抗原不仅与颊粘膜上皮细胞的自然分化成熟衰老有关，而且还可能在颊粘膜鳞癌发生发展过程中参与分化与去分化的调节。
Fas Antigen Expression and Significance in Squamous Cell Carcinoma of Buccal Mucosa. Jiang Hongbin et al. Department of Stomatology,Affiliated Hospital of Wannan Medical College(241001).
, http://www.100md.com
Abstract To study Fas antigen expression and its biological significance in squamous cell carcinoma of buccal mucosa(SCCBM),immunohistochemical staining with anti-Fas was used to detect the Fas antigen in specimens obtained from 5 cases of human buccal mucosa and 34 cases of SCCBM.The results showed that Fas antigen was intermittently expressed on the stratum germinativum ofbuccal mucosa epithelium,but consistently around the cell membrane of the other stratum;and Fas antigen expression was significantly correlated with the differentiation degree of SCCBM(P<0.01),strongly positive staining in well-differentiated tumors,weakly plsitive staining in poor-differentiated tumors.The present results suggest Fas antigen expression may not only be related to the physiological differentiation maturation and death of epithelial cell in buccal mucosa,but also play roles in the pathological differentiation and de-differentiation of SCCBM.
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Key words Fas antigen Carcinoma of buccal mucosa Apoptosis
材料与方法
1. 临床及病理资料
选取经病理明确诊断为颊粘膜鳞状细胞癌的病例34例，其中，男21例，女13例，年龄范围为21～70岁，平均年龄59.5岁；另选正常颊粘膜标本5例。切取标本立即经10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋。34例颊粘膜鳞癌常规HE染色下行病理学分级，鳞癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别占18例、12例、4例。
2. 免疫组化SP法染色
所用试剂购自北京中山公司，免抗人Fas多抗为Sata Cruz公司产品，SPTM试剂盒为美国ZYMED公司产品，主要染色步骤如下：①石蜡切片经二甲苯脱蜡后置梯度酒精中水化；②0.1%胰蛋白酶消化30分钟；③3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10分钟；④2%小牛血清白蛋白及山羊血清阻断非特异性背景染色各20分钟；⑤加1：80稀释的Fas-抗，孵育30分钟；⑥加生物素标记的二抗，孵育30分钟；⑦加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素液，孵育30分钟；⑧室温下DAB呈色3分钟。
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除④之后为轻弃孵育液不作洗涤外，上述各步骤之后均以0.01m PBS洗涤5分钟共3次，滤纸干燥。②～⑦均在37℃条件下进行。实验过程中设PBS替代一抗之阴性对照。
3. 染色结果判定
参考文献〔3〕介绍的方法，整个癌组织中的所有癌细胞均呈现为广泛连续性染色，记为“”；癌组织中的部分癌细胞呈阳性着色，或癌细胞呈间断性阳性表达，记为“+”；癌组织中的所有癌细胞均为阴性反应，记为“-”。
结 果
1. 正常颊粘膜中Fas抗原表达
通过5例正常颊粘膜免疫组化染色发现，Fas抗原表达于颊粘膜上皮细胞膜，呈特异性棕黄色连续着色(图1)。在颊粘膜上皮的生发层(基底细胞层+棘细胞层底部)细胞中，Fas抗原呈现为间断性阳性表达，部分细胞为阴性表达，随着棘细胞层细胞向表面移行，Fas表达逐渐增强，细胞膜呈连续性阳性着色，尤以棘层中部表达最强，浅表层细胞虽为连续性阳性染色，但表达强度降低(图2)。
, 百拇医药
2. 颊粘膜鳞癌中Fas抗原表达
Fas抗原表达于颊粘膜鳞癌细胞膜上，近癌巢中央部分之癌细胞Fas抗原表达相对较弱，而癌巢周围部分之癌细胞Fas抗原表达相对增强并呈连续性阳性着色。经实验的34例颊粘膜鳞癌均呈现为Fas抗原阳性染色，未见阴性反应的病例，并发现Fas抗原表达与颊癌的分化程度有关，在分化好的颊癌组织中Fas抗原广泛连续强阳性表达；在分化差的颊癌组织中Fas抗原表达明显减弱，部分癌细胞则呈间断性阳性着色(图3，4)。本组4例颊粘膜鳞癌Ⅲ级均为“+”，而12例颊癌Ⅱ级病例中5例为“
”，7例为“+”(为便于统计学处理，将Ⅱ、Ⅲ级病列合并分析)，18例Ⅰ级颊癌中有16例染色结果记为“”，经卡方检验P<0.01，Fas抗原表达与颊粘膜鳞癌病理学分级有关(表1)。
, http://www.100md.com 表1 颊粘膜鳞癌Fas抗原表达与病理学分级
组 别
Fas抗原表达
合 计
+
Ⅰ级
16
2
18
Ⅱ～Ⅲ级
5
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11
16
合 计
21
13
34
注：经四格表x2检验P<0.01。
图1 Fas抗原连续表达于颊粘膜上皮细胞膜(免疫组化×1000)
图2 Fas抗原在正常颊粘膜上皮中的表达分布(免疫组化×200)
图3 Fas抗原在高分化颊粘膜鳞癌(Ⅰ级)中的表达分布(免疫组化×400)
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图4 Fas抗原在低分化颊粘膜鳞癌(Ⅲ级)中的表达分布(免疫组化×400)
讨 论
Fas抗原为位于细胞膜上的Ⅰ类跨膜糖蛋白，属肿瘤坏死因子或神经生长因子受体超家族成员之一，因其与传递凋亡性细胞死亡信号从而与诱发Fas阳性表达细胞凋亡有关，故又称为凋亡分子-1(Apo-1)〔1〕。
Fas抗原最先是在研究T淋巴细胞分化成熟过程中被发现，人Fas抗原由319个氨基酸所组成，属单螺旋跨膜糖蛋白，作为一种位于细胞膜上的受体，当与其配体结合时很快启动Fas阳性表达细胞的凋亡，Fas在向胞内传递凋亡信号中发挥关键性作用。研究发现，Fas抗原胞浆结构域中存在一段60～80个氨基酸被称为死亡结构域(death domains,DD)的序列，当Fas系统被激活时，DD直接与传递死亡信号的FADD(Fas-associated DD)分子结合，FADD进一步将信号传达死亡蛋白酶FLICE(FADD-like interleukin-1β converting enzyme)并使之激活导致细胞凋亡〔1，4〕。正常生理条件下，颊粘膜上皮中散在分布少量凋亡细胞，主要位于上皮表层处，说明细胞凋亡可能是颊粘膜上皮自我更新的重要途径〔5〕。我们在对正常颊粘膜Fas抗原表达染色中发现，生发层细胞间断性表达，部分细胞甚至阴性表达，而棘层中份细胞连续性强表达，浅表层细胞Fas表达又有所减弱，推测Fas抗原表达与颊粘膜上皮细胞的自然分化成熟及衰老有关。生发层细胞生命力旺盛，Fas抗原弱表达或不表达，随着该层细胞不断向棘细胞分化演进，Fas表达逐渐增强，可能参与上皮细胞的凋亡启动，当棘细胞趋向表层成熟衰老时，Fas表达转而下降，呈现一个动态变化过程。因此，Fas抗原在调节上皮细胞凋亡性自我更新过程中具有重要作用。
, 百拇医药
在颊粘膜鳞癌癌巢中Fas抗原广泛表达，其中近癌巢中央部分较周边部分癌细胞的Fas抗原表达减弱，而癌巢及其角化物的出现是鳞癌分化的一种标志表型。因此，Fas抗原可能在调节颊癌细胞分化过程中扮演一定的角色。据报道，Fas阳性表达细胞不仅出现在高分化颊粘膜鳞癌中，而且广泛存在于角化型白斑病变中。作者认为，Fas抗原与某些病变的角化有关，至于Fas抗原与口腔粘膜复层鳞状上皮及其各种病变间的关系值得深入探讨〔6〕。
本文结果表明，Fas抗原表达与颊粘膜鳞癌的分化程度有关，在高分化颊癌中绝大多数病例标本表现为广泛性强阳性染色，而分化程度相对较差的颊癌则为弱表达，与文献报道结果基本相似〔6〕。Moller等〔3〕在对大肠癌的研究中也有同样的结论，他们还进一步观察了转移癌中Fas表达情况，结果发现，与原发癌灶相比，转移癌中Fas抗原表达明显减弱，甚至呈阴性表达，由此认为，在癌细胞转移去分化演进过程中Fas抗原表达趋向丧失。因此，Fas抗原可能参与调节癌细胞的去分化演进。当然，Fas抗原的表达受到细胞内外多种效应因子的调控，如抑癌基因和生长因子等，但有关其表达调节机制至今尚不清楚，随着对Fas抗原分子的深入研究，为进一步认识肿瘤发生发展过程中的分化与去分化行为提供理论依据。
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体内环境下，通过Fas系统诱发靶细胞凋亡是免疫细胞杀伤肿瘤细胞的主要机制之一，免疫细胞借助其表达FasL与靶细胞膜表面Fas结合，起动靶细胞凋亡信号，因而，肿瘤细胞Fas抗原表型及其表达情况直接关系到CTL、NK等免疫细胞的杀瘤效应〔1〕。结合本实验结果，Fas抗原表达在分化较差的颊癌中明显减弱，使得宿主免疫抗瘤效应降低，从另一个角度说明分化越差的颊癌在生物学行为上表现出更高的恶性程度。
参 考 文 献
[1] Nagata S,Golstein P.The Fas death factor.Science,1995,267(7)1449
[2] Leithauser F,Dhein J,Koretz K,et al.Constitutive and induced expression of Apo- 1 in normal and neoplastic cells.Laboratory Invest,1993,69(4):415
, 百拇医药
[3] Moller P,Koretz K,Leithauser F,et al.Expression of Apo-1 in normal and neoplastic colon epithelium.Int J cancer.1994,57(2):371
[4] Pan GH,Ni J,Wei Yf,et al.An antagonist decoy receptor and a death domain-containing receptor for TRALL.Science,1997,277(4):815
[5] 金岩，邓志宏.颊粘膜上皮癌前和癌变中细胞凋亡的分析.华西口腔医学杂志,1997,15(3):192
[6] Muraki,Y,Yoshiokac,Fukuda J,et al.Immunohistochemical detection of Fas antigen in oral epithelia.J Oral Pathol Med,1997,26(1):57
(收稿：1998—09—21), 百拇医药
单位：241001芜湖市，皖南医学院弋矶山医院口腔颌面外科，华西医科大学口腔医学院(廖小宜 李芃)
关键词：Fas抗原；颊粘膜鳞癌；细胞凋亡
Fas抗原在颊粘膜鳞癌中的表达及意义 提 要 为探讨Fas抗原在颊粘膜鳞癌中的表达分布特点及其相关生物学意义，采用免疫组织化学方法，分别对5例正常颊粘膜、34例颊粘膜鳞癌进行染色，观察Fas抗原表达分布情况。结果发现，颊粘膜上皮生发层中Fas抗原间断性弱表达，其它层细胞广泛表达；Fas抗原表达与颊炽膜鳞癌的分化程度有关(P<0.01)，高分化颊癌中，Fas抗原连续强阳性表达于癌细胞膜，低分化颊癌则呈间断性表达。由此提示，Fas抗原不仅与颊粘膜上皮细胞的自然分化成熟衰老有关，而且还可能在颊粘膜鳞癌发生发展过程中参与分化与去分化的调节。
Fas Antigen Expression and Significance in Squamous Cell Carcinoma of Buccal Mucosa. Jiang Hongbin et al. Department of Stomatology,Affiliated Hospital of Wannan Medical College(241001).
, http://www.100md.com
Abstract To study Fas antigen expression and its biological significance in squamous cell carcinoma of buccal mucosa(SCCBM),immunohistochemical staining with anti-Fas was used to detect the Fas antigen in specimens obtained from 5 cases of human buccal mucosa and 34 cases of SCCBM.The results showed that Fas antigen was intermittently expressed on the stratum germinativum ofbuccal mucosa epithelium,but consistently around the cell membrane of the other stratum;and Fas antigen expression was significantly correlated with the differentiation degree of SCCBM(P<0.01),strongly positive staining in well-differentiated tumors,weakly plsitive staining in poor-differentiated tumors.The present results suggest Fas antigen expression may not only be related to the physiological differentiation maturation and death of epithelial cell in buccal mucosa,but also play roles in the pathological differentiation and de-differentiation of SCCBM.
, http://www.100md.com
Key words Fas antigen Carcinoma of buccal mucosa Apoptosis
材料与方法
1. 临床及病理资料
选取经病理明确诊断为颊粘膜鳞状细胞癌的病例34例，其中，男21例，女13例，年龄范围为21～70岁，平均年龄59.5岁；另选正常颊粘膜标本5例。切取标本立即经10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋。34例颊粘膜鳞癌常规HE染色下行病理学分级，鳞癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别占18例、12例、4例。
2. 免疫组化SP法染色
所用试剂购自北京中山公司，免抗人Fas多抗为Sata Cruz公司产品，SPTM试剂盒为美国ZYMED公司产品，主要染色步骤如下：①石蜡切片经二甲苯脱蜡后置梯度酒精中水化；②0.1%胰蛋白酶消化30分钟；③3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10分钟；④2%小牛血清白蛋白及山羊血清阻断非特异性背景染色各20分钟；⑤加1：80稀释的Fas-抗，孵育30分钟；⑥加生物素标记的二抗，孵育30分钟；⑦加辣根过氧化物酶标记链霉亲和素液，孵育30分钟；⑧室温下DAB呈色3分钟。
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除④之后为轻弃孵育液不作洗涤外，上述各步骤之后均以0.01m PBS洗涤5分钟共3次，滤纸干燥。②～⑦均在37℃条件下进行。实验过程中设PBS替代一抗之阴性对照。
3. 染色结果判定
参考文献〔3〕介绍的方法，整个癌组织中的所有癌细胞均呈现为广泛连续性染色，记为“”；癌组织中的部分癌细胞呈阳性着色，或癌细胞呈间断性阳性表达，记为“+”；癌组织中的所有癌细胞均为阴性反应，记为“-”。
结 果
1. 正常颊粘膜中Fas抗原表达
通过5例正常颊粘膜免疫组化染色发现，Fas抗原表达于颊粘膜上皮细胞膜，呈特异性棕黄色连续着色(图1)。在颊粘膜上皮的生发层(基底细胞层+棘细胞层底部)细胞中，Fas抗原呈现为间断性阳性表达，部分细胞为阴性表达，随着棘细胞层细胞向表面移行，Fas表达逐渐增强，细胞膜呈连续性阳性着色，尤以棘层中部表达最强，浅表层细胞虽为连续性阳性染色，但表达强度降低(图2)。
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2. 颊粘膜鳞癌中Fas抗原表达
Fas抗原表达于颊粘膜鳞癌细胞膜上，近癌巢中央部分之癌细胞Fas抗原表达相对较弱，而癌巢周围部分之癌细胞Fas抗原表达相对增强并呈连续性阳性着色。经实验的34例颊粘膜鳞癌均呈现为Fas抗原阳性染色，未见阴性反应的病例，并发现Fas抗原表达与颊癌的分化程度有关，在分化好的颊癌组织中Fas抗原广泛连续强阳性表达；在分化差的颊癌组织中Fas抗原表达明显减弱，部分癌细胞则呈间断性阳性着色(图3，4)。本组4例颊粘膜鳞癌Ⅲ级均为“+”，而12例颊癌Ⅱ级病例中5例为“
”，7例为“+”(为便于统计学处理，将Ⅱ、Ⅲ级病列合并分析)，18例Ⅰ级颊癌中有16例染色结果记为“”，经卡方检验P<0.01，Fas抗原表达与颊粘膜鳞癌病理学分级有关(表1)。, http://www.100md.com 表1 颊粘膜鳞癌Fas抗原表达与病理学分级
组 别
Fas抗原表达
合 计
+
Ⅰ级
16
2
18
Ⅱ～Ⅲ级
5
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11
16
合 计
21
13
34
注：经四格表x2检验P<0.01。
图1 Fas抗原连续表达于颊粘膜上皮细胞膜(免疫组化×1000)
图2 Fas抗原在正常颊粘膜上皮中的表达分布(免疫组化×200)
图3 Fas抗原在高分化颊粘膜鳞癌(Ⅰ级)中的表达分布(免疫组化×400)
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图4 Fas抗原在低分化颊粘膜鳞癌(Ⅲ级)中的表达分布(免疫组化×400)
讨 论
Fas抗原为位于细胞膜上的Ⅰ类跨膜糖蛋白，属肿瘤坏死因子或神经生长因子受体超家族成员之一，因其与传递凋亡性细胞死亡信号从而与诱发Fas阳性表达细胞凋亡有关，故又称为凋亡分子-1(Apo-1)〔1〕。
Fas抗原最先是在研究T淋巴细胞分化成熟过程中被发现，人Fas抗原由319个氨基酸所组成，属单螺旋跨膜糖蛋白，作为一种位于细胞膜上的受体，当与其配体结合时很快启动Fas阳性表达细胞的凋亡，Fas在向胞内传递凋亡信号中发挥关键性作用。研究发现，Fas抗原胞浆结构域中存在一段60～80个氨基酸被称为死亡结构域(death domains,DD)的序列，当Fas系统被激活时，DD直接与传递死亡信号的FADD(Fas-associated DD)分子结合，FADD进一步将信号传达死亡蛋白酶FLICE(FADD-like interleukin-1β converting enzyme)并使之激活导致细胞凋亡〔1，4〕。正常生理条件下，颊粘膜上皮中散在分布少量凋亡细胞，主要位于上皮表层处，说明细胞凋亡可能是颊粘膜上皮自我更新的重要途径〔5〕。我们在对正常颊粘膜Fas抗原表达染色中发现，生发层细胞间断性表达，部分细胞甚至阴性表达，而棘层中份细胞连续性强表达，浅表层细胞Fas表达又有所减弱，推测Fas抗原表达与颊粘膜上皮细胞的自然分化成熟及衰老有关。生发层细胞生命力旺盛，Fas抗原弱表达或不表达，随着该层细胞不断向棘细胞分化演进，Fas表达逐渐增强，可能参与上皮细胞的凋亡启动，当棘细胞趋向表层成熟衰老时，Fas表达转而下降，呈现一个动态变化过程。因此，Fas抗原在调节上皮细胞凋亡性自我更新过程中具有重要作用。
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在颊粘膜鳞癌癌巢中Fas抗原广泛表达，其中近癌巢中央部分较周边部分癌细胞的Fas抗原表达减弱，而癌巢及其角化物的出现是鳞癌分化的一种标志表型。因此，Fas抗原可能在调节颊癌细胞分化过程中扮演一定的角色。据报道，Fas阳性表达细胞不仅出现在高分化颊粘膜鳞癌中，而且广泛存在于角化型白斑病变中。作者认为，Fas抗原与某些病变的角化有关，至于Fas抗原与口腔粘膜复层鳞状上皮及其各种病变间的关系值得深入探讨〔6〕。
本文结果表明，Fas抗原表达与颊粘膜鳞癌的分化程度有关，在高分化颊癌中绝大多数病例标本表现为广泛性强阳性染色，而分化程度相对较差的颊癌则为弱表达，与文献报道结果基本相似〔6〕。Moller等〔3〕在对大肠癌的研究中也有同样的结论，他们还进一步观察了转移癌中Fas表达情况，结果发现，与原发癌灶相比，转移癌中Fas抗原表达明显减弱，甚至呈阴性表达，由此认为，在癌细胞转移去分化演进过程中Fas抗原表达趋向丧失。因此，Fas抗原可能参与调节癌细胞的去分化演进。当然，Fas抗原的表达受到细胞内外多种效应因子的调控，如抑癌基因和生长因子等，但有关其表达调节机制至今尚不清楚，随着对Fas抗原分子的深入研究，为进一步认识肿瘤发生发展过程中的分化与去分化行为提供理论依据。
, http://www.100md.com
体内环境下，通过Fas系统诱发靶细胞凋亡是免疫细胞杀伤肿瘤细胞的主要机制之一，免疫细胞借助其表达FasL与靶细胞膜表面Fas结合，起动靶细胞凋亡信号，因而，肿瘤细胞Fas抗原表型及其表达情况直接关系到CTL、NK等免疫细胞的杀瘤效应〔1〕。结合本实验结果，Fas抗原表达在分化较差的颊癌中明显减弱，使得宿主免疫抗瘤效应降低，从另一个角度说明分化越差的颊癌在生物学行为上表现出更高的恶性程度。
参 考 文 献
[1] Nagata S,Golstein P.The Fas death factor.Science,1995,267(7)1449
[2] Leithauser F,Dhein J,Koretz K,et al.Constitutive and induced expression of Apo- 1 in normal and neoplastic cells.Laboratory Invest,1993,69(4):415
, 百拇医药
[3] Moller P,Koretz K,Leithauser F,et al.Expression of Apo-1 in normal and neoplastic colon epithelium.Int J cancer.1994,57(2):371
[4] Pan GH,Ni J,Wei Yf,et al.An antagonist decoy receptor and a death domain-containing receptor for TRALL.Science,1997,277(4):815
[5] 金岩，邓志宏.颊粘膜上皮癌前和癌变中细胞凋亡的分析.华西口腔医学杂志,1997,15(3):192
[6] Muraki,Y,Yoshiokac,Fukuda J,et al.Immunohistochemical detection of Fas antigen in oral epithelia.J Oral Pathol Med,1997,26(1):57
(收稿：1998—09—21), 百拇医药