β-CD-14S抑制血管内皮细胞迁移运动的实验研究
作者：仇毓东 陈汉 丁义涛 满晓波 吴孟超
单位：仇毓东 陈汉 满晓波 吴孟超(200438 上海，第二军医大学东方肝胆外科医院)；丁义涛(南京大学医学院附属鼓楼医院)
关键词：
中华医学杂志000229 为探讨β环糊精十四硫酸酯(β-cyclodextrin tetradecasulfate β-CD-14S)单独以及与氢化可的松联合应用对肝细胞生长因子(HGF)诱导的血管内皮细胞迁移运动的影响，作者通过偏微分方程数学模型计算出迁移常数进行比较，以便更好地阐明β-CD-14S的作用机理及其在原发性肝癌治疗中的意义。
一、材料和方法
1.材料：β-CD-14S(上海第二军医大学药学院药物化学教研室合成纯化，上海医药工业研究院元素分析鉴定)；琥珀酸钠氢化可的松(天津生物化学制药厂)；HGF(美国Sigma公司)；F12 Nutrient Mixture，Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(GiBiCo公司)；胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物工程材料研究所)；六孔培养板(美国Nunc公司)；聚四氟乙烯小块(中国科学院有机化学研究所定制)。
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2.方法：用Laminin处理6孔培养板，吹干2h。琼脂糖0.6g，100℃煮沸2 h配成1%液状琼脂糖。 配制40%FBS母液(2×DMEM/F12 30 ml，FBS 20 ml)。吸取液状琼脂糖3 ml，待稍冷却后加40%FBS 3 ml。吹打混匀后立刻倒入中央放有聚四氟乙烯小块的培养孔中，待琼脂糖完全凝固后拔出小块，形成细胞井，将原代培养的大鼠心肌微血管内皮细胞消化，计数，浓度为1.2×106/ml，每细胞井加入500 μl细胞悬液，37℃，7%CO2培养72 h后用95%乙醇固定24 h，姬姆萨染液染色15 min。实验共分5组，阴性对照组：无药物； 阳性对照组：HGF 20 ng/ml(以下每组均加HGF 20 ng/ml)； 氢化可的松(HC)组：1: 0.01 μg/ml；2: 0.04 μg/ml；3: 0.1 μg/ml ；β-CD-14S组：1: 50 μg/ml；2: 200 μg/ml；3: 500 μg/ml；联合用药组(β-CD-14S+HC)：1: 50 μg/ml+0.01 μg/ml；2:200 μg/ml +0.04 μg/ml；3:500 μg/ml +0.1 μg/ml在细胞井的一侧边缘划出7道平行的连续小格(每小格1 mm×1 mm，每道10个小格)。显微镜下计数每一小格内的细胞数，除以小格面积得到该小格的平均细胞密度。我们将它近似为从细胞井边缘到小格中点迁移距离的细胞密度，将7道中每个距离所测的细胞密度取平均值就可以大致反映该迁移距离的平均细胞密度。
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我们根据描述细胞流量的偏微分方程数学公式推导出以下方程：
(1)
其中，C为细胞密度。x为细胞迁移距离，t为时间。C0为细胞井边缘的细胞密度，可假设在实验中保持不变。erf为误差系数，数学手册中查出为0.95[1]。u为迁移常数。我们将公式(1)变换为：
(2)
若为迁移距离x为横坐标，2terf-1(1-C/C0)为纵坐标，经最小二乘回归分析可以得到一经过原点的直线。
在实验中可以应用较为简便的公式得出U值。根据公式(2)可得出
(3)
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Xf为细胞迁移最远距离，Cf为该距离的细胞密度
应用公式(3)有一个条件。在每一个距离测到的细胞密度值代入公式(2)后在坐标上对应的各点值，用最小二乘法可回归成一条直线。本研究中所有实验组均作线性拟合图。用公式(3)计算出的μ值。采用方差分析法进行统计学处理(SAS统计软件包)。
二、结果
不同药物对HGF诱导内皮细胞迁移的抑制(图1)，如图1所示：(1)HGF对细胞迁移有强大的诱导作用，与阴性对照组比较差异有极显著意义P<0.000 1。(2)β-CD-14S、氢化可的松单独或联合应用对HGF诱导的细胞迁移均有明显的抑制作用，与阳性对照比较差异有极显著意义P<0.000 1。(3)β-CD-14S与氢化可的松组间比较差异有显著意义P<0.05，联合用药与氢化可的松组间比较差异有显著意义P<0.01，而β-CD-14S组与联合用药组间比较差异无显著意义P>0.05。
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图1 不同药物对HGF诱导内皮细胞迁移的抑制
三、讨论
β-CD-14S是一种环状硫酸酯多糖， Folkman发现它与氢化可的松联合应用可发挥靶向载体的作用抑制新生血管形成[2]。近来，不少研究者发现该药物能抑制血管内皮和平滑肌细胞的增殖[3]。我们在实验中发现β-CD-14S能有效抑制血管内皮细胞迁移，其效力超过氢化可的松，与联合用药无显著差别。因此，考虑它本身也具有抑制新生血管形成的能力，而影响细胞迁移是其作用机理中的重要部分。
HGF可增加血管内皮细胞的迁移运动，可能通过诱导新生血管促进肿瘤生长和转移。在肝癌的肝动脉栓塞治疗中，栓塞后侧枝循环形成是影响疗效的首要因素。最近发现肝脏在缺血后HGF的分泌可增高10～20倍[4]，这对重建肝内侧枝循环大有帮助。β-CD-14S能有效地抑制HGF诱导的血管内皮细胞的移动，对于HGF诱导的新生血管形成可能产生很好的抑制作用。如果能在栓塞化疗的同时辅以β-CD-14S抑制肝内侧枝循环形成，有望大大提高栓塞治疗的效果。总之，作为一种新型的新生血管抑制剂，β-CD-14S具有制备简单，副作用小的优点，若能与其它抗肿瘤药物和方法联合应用，可发挥更好的治疗效果，具有十分广阔的临床应用前景。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970838)
参考文献
[1]Abramowits M, Stegun IA. Handbook of Mathematical Functions, ed 9 New York： Dover Press, 1965.
[2]Judah Folkman, Paul B Weisz, Madeleine M Joullie, et al. Control of Angiogenesis with Synthetic Heparin Substitutes. Science, 1989，243:1490-1493.
[3]Okada SS, Kuo A, Muttreja MR, et al. Inhibition of human vascular smooth muscle cell migration and proliferation by beta-cyclodextrin tetradecasulfate. J Pharmacol Exp Ther, 1995, 273:948-954.
[4]Rosen EM, Goldberg ID. Scatter factor and angiogenesis. Adv Cancer Res，1995,67：257.
收稿日期：1999-02-08, http://www.100md.com
单位：仇毓东 陈汉 满晓波 吴孟超(200438 上海，第二军医大学东方肝胆外科医院)；丁义涛(南京大学医学院附属鼓楼医院)
关键词：
中华医学杂志000229 为探讨β环糊精十四硫酸酯(β-cyclodextrin tetradecasulfate β-CD-14S)单独以及与氢化可的松联合应用对肝细胞生长因子(HGF)诱导的血管内皮细胞迁移运动的影响，作者通过偏微分方程数学模型计算出迁移常数进行比较，以便更好地阐明β-CD-14S的作用机理及其在原发性肝癌治疗中的意义。
一、材料和方法
1.材料：β-CD-14S(上海第二军医大学药学院药物化学教研室合成纯化，上海医药工业研究院元素分析鉴定)；琥珀酸钠氢化可的松(天津生物化学制药厂)；HGF(美国Sigma公司)；F12 Nutrient Mixture，Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(GiBiCo公司)；胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物工程材料研究所)；六孔培养板(美国Nunc公司)；聚四氟乙烯小块(中国科学院有机化学研究所定制)。
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2.方法：用Laminin处理6孔培养板，吹干2h。琼脂糖0.6g，100℃煮沸2 h配成1%液状琼脂糖。 配制40%FBS母液(2×DMEM/F12 30 ml，FBS 20 ml)。吸取液状琼脂糖3 ml，待稍冷却后加40%FBS 3 ml。吹打混匀后立刻倒入中央放有聚四氟乙烯小块的培养孔中，待琼脂糖完全凝固后拔出小块，形成细胞井，将原代培养的大鼠心肌微血管内皮细胞消化，计数，浓度为1.2×106/ml，每细胞井加入500 μl细胞悬液，37℃，7%CO2培养72 h后用95%乙醇固定24 h，姬姆萨染液染色15 min。实验共分5组，阴性对照组：无药物； 阳性对照组：HGF 20 ng/ml(以下每组均加HGF 20 ng/ml)； 氢化可的松(HC)组：1: 0.01 μg/ml；2: 0.04 μg/ml；3: 0.1 μg/ml ；β-CD-14S组：1: 50 μg/ml；2: 200 μg/ml；3: 500 μg/ml；联合用药组(β-CD-14S+HC)：1: 50 μg/ml+0.01 μg/ml；2:200 μg/ml +0.04 μg/ml；3:500 μg/ml +0.1 μg/ml在细胞井的一侧边缘划出7道平行的连续小格(每小格1 mm×1 mm，每道10个小格)。显微镜下计数每一小格内的细胞数，除以小格面积得到该小格的平均细胞密度。我们将它近似为从细胞井边缘到小格中点迁移距离的细胞密度，将7道中每个距离所测的细胞密度取平均值就可以大致反映该迁移距离的平均细胞密度。
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我们根据描述细胞流量的偏微分方程数学公式推导出以下方程：
(1)其中，C为细胞密度。x为细胞迁移距离，t为时间。C0为细胞井边缘的细胞密度，可假设在实验中保持不变。erf为误差系数，数学手册中查出为0.95[1]。u为迁移常数。我们将公式(1)变换为：
(2)若为迁移距离x为横坐标，2terf-1(1-C/C0)为纵坐标，经最小二乘回归分析可以得到一经过原点的直线。
在实验中可以应用较为简便的公式得出U值。根据公式(2)可得出
(3), http://www.100md.com
Xf为细胞迁移最远距离，Cf为该距离的细胞密度
应用公式(3)有一个条件。在每一个距离测到的细胞密度值代入公式(2)后在坐标上对应的各点值，用最小二乘法可回归成一条直线。本研究中所有实验组均作线性拟合图。用公式(3)计算出的μ值。采用方差分析法进行统计学处理(SAS统计软件包)。
二、结果
不同药物对HGF诱导内皮细胞迁移的抑制(图1)，如图1所示：(1)HGF对细胞迁移有强大的诱导作用，与阴性对照组比较差异有极显著意义P<0.000 1。(2)β-CD-14S、氢化可的松单独或联合应用对HGF诱导的细胞迁移均有明显的抑制作用，与阳性对照比较差异有极显著意义P<0.000 1。(3)β-CD-14S与氢化可的松组间比较差异有显著意义P<0.05，联合用药与氢化可的松组间比较差异有显著意义P<0.01，而β-CD-14S组与联合用药组间比较差异无显著意义P>0.05。
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图1 不同药物对HGF诱导内皮细胞迁移的抑制
三、讨论
β-CD-14S是一种环状硫酸酯多糖， Folkman发现它与氢化可的松联合应用可发挥靶向载体的作用抑制新生血管形成[2]。近来，不少研究者发现该药物能抑制血管内皮和平滑肌细胞的增殖[3]。我们在实验中发现β-CD-14S能有效抑制血管内皮细胞迁移，其效力超过氢化可的松，与联合用药无显著差别。因此，考虑它本身也具有抑制新生血管形成的能力，而影响细胞迁移是其作用机理中的重要部分。
HGF可增加血管内皮细胞的迁移运动，可能通过诱导新生血管促进肿瘤生长和转移。在肝癌的肝动脉栓塞治疗中，栓塞后侧枝循环形成是影响疗效的首要因素。最近发现肝脏在缺血后HGF的分泌可增高10～20倍[4]，这对重建肝内侧枝循环大有帮助。β-CD-14S能有效地抑制HGF诱导的血管内皮细胞的移动，对于HGF诱导的新生血管形成可能产生很好的抑制作用。如果能在栓塞化疗的同时辅以β-CD-14S抑制肝内侧枝循环形成，有望大大提高栓塞治疗的效果。总之，作为一种新型的新生血管抑制剂，β-CD-14S具有制备简单，副作用小的优点，若能与其它抗肿瘤药物和方法联合应用，可发挥更好的治疗效果，具有十分广阔的临床应用前景。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970838)
参考文献
[1]Abramowits M, Stegun IA. Handbook of Mathematical Functions, ed 9 New York： Dover Press, 1965.
[2]Judah Folkman, Paul B Weisz, Madeleine M Joullie, et al. Control of Angiogenesis with Synthetic Heparin Substitutes. Science, 1989，243:1490-1493.
[3]Okada SS, Kuo A, Muttreja MR, et al. Inhibition of human vascular smooth muscle cell migration and proliferation by beta-cyclodextrin tetradecasulfate. J Pharmacol Exp Ther, 1995, 273:948-954.
[4]Rosen EM, Goldberg ID. Scatter factor and angiogenesis. Adv Cancer Res，1995,67：257.
收稿日期：1999-02-08, http://www.100md.com