人FL-FEN-1基因功能的初步研究
作者：石斌山 余应年
单位：浙江大学医学院，浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010180
目的：FEN-1是一种结构特异性核酸酶，它识别特定的核酸分叉结构，并切除含有游离5’末端的单链核酸。FEN-1具有对DNA复制和修复都必需的双重功能。对酵母和体外实验的研究表明，在DNA复制过程中，FEN-1去除了冈崎片段前端RNA引物的最后一个核糖核苷；在DNA修复中，FEN-1参与了损伤碱基的修复过程。方法和结果：采用反义核酸技术，从人FEN-1表达质粒hPET-FCH经双酶切得到1084 bp的hFEN-1片段，反向克隆入采用经改建的哺乳动物表达载体pMAMneoAmp，并得到hFEN-1反义表达质粒pMAMneoAmpFNB。采用改进的磷酸钙介导的细胞转染法，将pMAMneoAmpFNB和pMAMneoAmp质粒分别导入FL细胞，用含400 μg/mL G418的MEM完全培养基筛选，分别得到FL-FEN和FL-M细胞。细胞生长曲线的测定发现，FL-FEN-1在地塞米松的诱导下，细胞生长速度明显下降，细胞倍增时间TD为3.03 d，而FL和仅含有空载体的FL-M细胞在地塞米松存在下的细胞倍增时间TD分别为2.03 d和2.22 d，不经地塞米松诱导的FL-FEN-1细胞的TD为2.38 d。采用流式细胞仪对细胞周期的研究表明，在地塞米松诱导下，用不含精氨酸的MEM培养48 h同步化处理后，FL-FEN-1细胞的S期百分比为9.95%，而FL和FL-M细胞分别为26.31%和23.07%。采用DEAE介导的细胞转染法将穿梭质粒pZ189分别转染经地塞米松诱导的FL、FL-M和FL-FEN-1细胞，以Hirt’s法提取质粒并转化大肠杆菌MBM7070，得到的自发突变率依次为3.91/104、7.79/104和14.4/104。结论：在哺乳动物细胞中FEN-1基因在DNA复制和细胞繁殖的过程中起着重要作用，并且可能参与维持细胞DNA遗传稳定性的过程。
国家自然科学基金重点资助项目(No.39830210,No. 39870340), http://www.100md.com
单位：浙江大学医学院，浙江 杭州 310031
关键词：
中国病理生理杂志0010180
目的：FEN-1是一种结构特异性核酸酶，它识别特定的核酸分叉结构，并切除含有游离5’末端的单链核酸。FEN-1具有对DNA复制和修复都必需的双重功能。对酵母和体外实验的研究表明，在DNA复制过程中，FEN-1去除了冈崎片段前端RNA引物的最后一个核糖核苷；在DNA修复中，FEN-1参与了损伤碱基的修复过程。方法和结果：采用反义核酸技术，从人FEN-1表达质粒hPET-FCH经双酶切得到1084 bp的hFEN-1片段，反向克隆入采用经改建的哺乳动物表达载体pMAMneoAmp，并得到hFEN-1反义表达质粒pMAMneoAmpFNB。采用改进的磷酸钙介导的细胞转染法，将pMAMneoAmpFNB和pMAMneoAmp质粒分别导入FL细胞，用含400 μg/mL G418的MEM完全培养基筛选，分别得到FL-FEN和FL-M细胞。细胞生长曲线的测定发现，FL-FEN-1在地塞米松的诱导下，细胞生长速度明显下降，细胞倍增时间TD为3.03 d，而FL和仅含有空载体的FL-M细胞在地塞米松存在下的细胞倍增时间TD分别为2.03 d和2.22 d，不经地塞米松诱导的FL-FEN-1细胞的TD为2.38 d。采用流式细胞仪对细胞周期的研究表明，在地塞米松诱导下，用不含精氨酸的MEM培养48 h同步化处理后，FL-FEN-1细胞的S期百分比为9.95%，而FL和FL-M细胞分别为26.31%和23.07%。采用DEAE介导的细胞转染法将穿梭质粒pZ189分别转染经地塞米松诱导的FL、FL-M和FL-FEN-1细胞，以Hirt’s法提取质粒并转化大肠杆菌MBM7070，得到的自发突变率依次为3.91/104、7.79/104和14.4/104。结论：在哺乳动物细胞中FEN-1基因在DNA复制和细胞繁殖的过程中起着重要作用，并且可能参与维持细胞DNA遗传稳定性的过程。
国家自然科学基金重点资助项目(No.39830210,No. 39870340), http://www.100md.com