白细胞介素-6与肾癌细胞生长关系的实验研究
作者：席志军 俞莉章 郭应禄 张凯 姜学军 张志文
单位：100034 北京医科大学第一医院 北京医科大学泌尿外科研究所
关键词：癌；肾细胞；白细胞介素-6；聚合酶链反应
中华医学杂志000425 【摘要】 目的 研究白细胞介素-6(IL-6)在肾癌细胞系GRC-1中的表达及其意义。方法 运用ELISA方法检测GRC-1培养上清中IL-6的浓度，运用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)在翻译和转录水平上检测IL-6及其受体系统的表达；观察重组人IL-6和IL-6中和抗体对GRC-1生长的影响；用表达IL-6反义RNA的质粒转染GRC-1，观察其增殖的改变。结果 GRC-1培养上清IL-6浓度为465 pg/ml，RT-PCR显示IL-6 mRNA及IL-6受体mRNA有表达；在重组人IL-6和IL-6中和抗体作用下生长无明显改变；转染表达IL-6反义RNA的质粒以后，GRC-1细胞IL-6分泌下降到250 pg/ml，但生长未受抑制。结论 尽管肾癌细胞系GRC-1可以表达IL-6，但重组人IL-6不能促进GRC-1的增殖，中和抗体和反义基因不能抑制细胞增殖，提示IL-6可能不是GRC-1的生长因子；GRC-1可以表达IL-6受体系统(IL-6 R和gp130)，提示IL-6的信号传导中断可能发生在受体下游。
, http://www.100md.com
Studies on the interaction between interleukin-6 and human renal cell carcinoma cell line GRC-1
XI Zhijun
(Institute of Urology，The 1st Hospital of Beijing Medical University，Beijing 100034, China)
YU Lizhang
(Institute of Urology，The 1st Hospital of Beijing Medical University，Beijing 100034, China)
GUO Yinglu
, 百拇医药
(Institute of Urology，The 1st Hospital of Beijing Medical University，Beijing 100034, China)
【Abstract】 Objective To demonstrate the effects of IL-6 on the renal cell carcinoma cell line GRC-1. Methods and results Immunocytochemical staining and RT-PCR analysis indicated that this cell line could express IL-6 both on mRNA and protein levels. Secretion of IL-6 in this cell line was 465 pg/ml, which was identified by ELISA assay. By RT-PCR analysis, we found that GRC-1 expressed IL-6 receptor system including IL-6 mRNA and gp130 mRNA. The rhIL-6 did not stimulate the growth of GRC-1 while the neutralizing antibody did not inhibit its growth. For further identification of the effect of IL-6 on GRC-1 cells, we introduced an antisense IL-6 RNA into GRC-1 cells. Thereafter, the lowered expression of IL-6 mRNA was observed by Northern blot, and the secretion of IL-6 was reduced to 250 pg/ml. But there were no significant growth-inhibitory effects on GRC-1 cells. Conclusion Although GRC-1 could express IL-6, IL-6 R and gp130, the rhIL-6 and IL-6 neutralizing antibody or transducing antisense IL-6 RNA could not change the growth of GRC-1 cells significantly. These results suggest that it is not likely for IL-6 functioning as an autocrine growth factor for GRC-1.
, 百拇医药
【Key words】 Carcinomas, renal cell； Interleukin-6； Polymerase chain reaction
白细胞介素-6(IL-6)是一种多功能细胞因子，从人克隆出来的IL-6基因长度大约是5 kb，IL-6是一个单拷贝基因，定位于人染色体7p21。IL-6对于肿瘤呈现多样的生物学效应，其中尤以IL-6与肾细胞癌生长关系的研究引人关注。本所在以前的研究中，发现肾癌细胞系GRC-1可以表达IL-6，本实验将进一步探讨IL-6与肾癌细胞生长的关系及其可能的作用机制。
材料与方法
1.细胞培养：人肾颗粒细胞癌细胞系GRC-1由本研究所建立[1]。对照细胞系人肺巨细胞癌细胞系PG由本校病理学系提供[2]。用RPMI-1640培养液(美国Gibco公司)加体积分数为15%小牛血清培养细胞。
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2.细胞体外生长实验：参照文献[3]。包括细胞增殖实验(MTT法)、克隆形成率和生长曲线。重组人(rh)IL-6(1×108 U/mg，纯度>95%) 购自本校免疫中心。抗体中和实验采用的鼠抗人IL-6中和抗体购自美国R＆D公司。
3.IL-6浓度测定和免疫细胞化学检测：ELISA检测试剂盒购自中国人民解放军军事医学科学院邦定公司，按说明操作。免疫细胞化学检测为培养细胞悬液滴片，一抗采用鼠抗人IL-6单克隆抗体。按照LSAB操作说明进行染色。实验组为GRC-1，阳性对照为肺癌细胞系PG，阴性对照以PBS代替一抗。
4.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)：细胞总RNA的提取采用异硫氰酸胍一步法，反转录为cDNA。聚合酶链反应(PCR)引物分别为：IL-6：P1:5′-CCAGTACCCCCAGGAGAA-3′；P2: 5′-AAAGATCTGAG-GTGCCCATGCT-3′。IL-6 R：P1: 5′-CCACGACTCT-GGAAACTAT-3′；P2: 5′-ACTATGTAGAAAGAGCTGT-3′。gp130：P1: 5′-ACCTATGAAGATAGACCATCTAAA-3′；P2: 5′-GGTTCTATAAAATATAGTATAATT-3′。扩增先在94℃保持5 min，然后进入循环，具体操作如表1所示。取PCR产物10 μl在15 g/L琼脂糖凝胶电泳50 V 1 h，EB染色，BIORAD紫外分析仪观察照像。
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表1 PCR操作条件和期望片段大小 扩增片段
大小
(bp)
变性温度
(℃)及
时间(s)
复性温度
(℃)及
时间(s)
延伸温度
(℃)及
时间(s)
循环
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次数
IL-6
572
94，40
58，50
72，60
30
IL-6R
304
94，30
56，30
72，40
50
, 百拇医药
gp130
740
94，60
55，90
72，150
40
5.基因转染及检测：表达hIL-6反义基因的pXJIL-6As由本校病理学系符坚博士提供。质粒的置备和鉴定参照文献[2]。基因转染参照LipofectAMINE(美国Gidco公司)产吕说明书进行，G418筛选耐药克隆，扩大培养。检测采用原位杂交方法：含有hIL-6 cDNA的pGEM4质粒由本研究所钟华博士提供。以BamH I使质粒线性化，采用带地高辛-UTP的RNA体外转录试剂盒(德国 Boehringer Mannheim公司)，方法参照产吕说明书，合成IL-6正义RNA探针。原位杂交方法参考产品说明进行。
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6.RNA印迹杂交(Northern Blot)：用EcoR I和Hind III酶切含IL-6cDNA的质粒pGEM 4,以 DNA片段，用cDNA标记和显色试剂盒(德国 Boehringer Mannheim)标记探针。杂交与显色按产品说明进行。
7.统计学处理：差异显著性检验采用t检验。
结果
一，肾癌细胞系GRC-1对IL-6的表达
将肾癌细胞系GRC-1细胞常规培养72h，收获上清，测得其中的IL-6浓度为465pg/ml±78pg/ml;作为对照，PG的培养上清中IL-6浓度为874pg/ml±98pg/ml。用细胞涂片进行免疫细胞化学染色可以看到GRC-1细胞胞浆中有IL-6的抗原表达。提取细胞总RNA，进行RT-RCR，结果在572bp的位置上GRC-1和对照PG都有IL-6的特异性的条带。同样从以IL-6 recrptor(gp80)和gp130的特异性引物进行的RT-PCR可以看到GRC-1在304bp的位置上有IL-6 recrptor(gp80)的特异性片段被扩增，在740bp的位置上有gp130的特异性片段被扩增，说明肾癌细胞系GRC-1可以表达IL-6 recrptor mRNA同进也表达gp130mRNA(图1，2)
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图1 肾癌细胞系GRC-1与对照细胞系 PG，对IL-6 Peceptor和gp130的表达
图2 肾癌细胞系RCG-949与对照细胞系( PG)，对IL-6 Receptor和gp130的表达 二、 rhIL-6对GRC-1细胞生长的影响
rhIL-6以不同浓度作用于GRC-1，并不呈现浓度依赖性的生长刺激作用。对照的PG细胞，在IL-6作用下，则呈现浓度依赖性的生长刺激现象。在不给予rhIL-6和给予rhIL-61000U/ml的两组细胞之间的比较，克隆形成率增加差异无显著意义；两给生长曲线差异不大。对照PG在给予rhIL-6之后，生长曲线高峰提前，克隆形成率增加。
三、IL-6中和抗体不能抑制GRC-1细胞生长
, http://www.100md.com 用IL-6的中和抗体以不同浓度处理培养细胞，结果GRC-1细胞生长抑制与抗体浓度无相关性，。对照的PG呈现明显的浓度依赖生长抑制(图3)。
四、 转导IL-6反义基因不能抑制GRC-1细胞生长
在原位杂交确定转染成功后，利用IL-6cDNA探针，进行 Northern杂交，可以看到GRC-1转染前后IL-6 mRNA的表达明显减低(图4)。对照的PG也有同样的表现。GRC-1转染后培养上清的IL-6分泌水平为250 pg/ml±40 pg/ml，转染前差异有显著意义(P<0.05)。细胞增殖实验显示肾癌细胞系在转染前后的增殖变化不大(P>0.05)，对照的PG在转染后增殖明显低于转染前(P<0.05)。克隆形成率GRC-1同样在转染前后差异无显著意义(P>0.05)。对于生长曲线的观察，更直观一些 (图5，6)。
, 百拇医药
图3 IL-6中和抗体对于肾癌细胞系GRC-1和对照细胞系PG的生长抑制效果
图4 肾癌细胞系GRC-1和对照细胞系PG在
转染IL-6反义基因前后的Northern Blot结果
(采用地高辛标记的IL-6 cDNA探针)
讨论
IL-6在肾癌中的表达的报道较多见，但其表达程度很不一致，Takenawa在43例肾癌中22例检测到IL-6，7个肾癌细胞系中5个可以表达IL-6[4]。本研究所钟华博士检测了30例肾癌标本发现都有不同程度的IL-6 mRNA和蛋白表达，同时证实肾癌细胞系GRC-1可以表达IL-6。本实验也证实了肾癌细胞系GRC-1可以在转录和翻译水平表达IL-6。
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图5 肾癌细胞系GRC-1在转染IL-6反义基因
前后的生长曲线
图6 对照细胞系PG在转染IL-6反义基因前后的
生成曲线
Miki首次报道IL-6为肾癌细胞系ACHN的自分泌生长因子，并为大多数研究者所认同，随后有人提出应用IL-6抗体或反义基因等抗IL-6方式来抑制肾癌细胞生长，达到治疗肾癌的目的[5]。我们在实验中发现rhIL-6对肾癌细胞系GRC-1无明显的促增殖效应。随后又应用IL-6中和抗体作用于该细胞来降低IL-6的水平，肾癌细胞系GRC-1的生长依然变化不大。在对绒毛膜细胞癌的研究中发现，尽管rhIL-6不能刺激绒毛膜细胞癌细胞增长，并且IL-6、IL-6 R和gp130的中和抗体不能抑制该细胞生长，但导入IL-6的反义基因达到了抑制细胞生长的效应，提示IL-6可能存在细胞内自分泌机制[6]。为此我们又观察了转导IL-6反义基因后细胞的生长，结果在反义基因抑制IL-6表达后依然对GRC-1增殖影响不显著。提示，IL-6不是肾癌细胞系GRC-1的自分泌生长因子。
, 百拇医药
Serve等[7]在研究中也发现rhIL-6不能促进肾癌细胞生长，IL-6中和抗体不抑制细胞生长，认为IL-6不是肾癌细胞的自分泌生长因子，但没有进一步探讨其原因。结合本实验结果，我们认为IL-6作为肾癌的生长因子缺乏普遍性。
IL-6的受体系统包括IL-6受体(IL-6 R)和gp130两部分，当IL-6同IL-6R结合之后，诱导gp130形成以二硫键连接的同源二聚体，IL-6与IL-6R形成六聚体，IL-6的信号借此传导至细胞内。随后IL-6通过两条信号途径诱导靶基因表达，即一条依赖Ras的支路和一条不依赖Ras的支路[8]。有报道IL-6 R表达缺陷导致了IL-6信号传导中断[9]。在我们对另一个肾癌细胞系的研究中又发现了gp130的表达缺陷。无论是IL-6 R或gp130的表达缺陷，均可以导致信号传导的中断，使得IL-6失去其生长因子的作用。
GRC-1细胞系可以表达IL-6 R mRNA和gp130 mRNA，提示IL-6的信号传导中膜受体的完整性，缺陷可能发生在受体下游。在对多发性骨髓瘤的IL-6信号传导途径研究中，发现非 Ras支路由 Jak激活的 STAT3、STAT1a并不引起肿瘤细胞增殖；而Ras依赖支路的IL-6引起 MAPK的磷酸化则可以促进肿瘤细胞增殖，应用 MAPK的反义基因可以抑制由IL-6引起的细胞增殖；因而认为在肿瘤细胞的IL-6信号系统中 STAT3、STAT1a支路可能与细胞增殖无关，IL-6促进细胞生长是通过MAPK支路[10]。对于肾癌来说，也许IL-6通过同样的机制发挥其促增殖的作用，那么GRC-1的信号传导缺陷就有可能发生于这一支路，对此我们将作进一步的研究。
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参考文献
1，丁义, 俞莉章, 李鸣, 等. 人肾颗粒细胞癌细胞系(GRC-1)的建立及其生物学特征. 中华泌尿外科杂志, 1995, 16: 3-6.
2，付坚, 郑杰, 吴秉权, 等. 自泌性白细胞介素-6对人肺巨细胞癌系PG生长的刺激作用. 中华病理学杂志, 1997, 26: 5-7.
3，韩复生. 分子细胞学技术在研究中的应用. 见：鄂征, 主编. 组织培养和分子细胞学技术. 北京：北京出版社, 1995. 434-448.
4，Takenawa J, Kaneko Y, Fucumoto M, et al. Enhanced expression of interleukine-6 in primary human renal cell carcinoma. J Natl Can Inst, 1991, 83: 1668-1672.
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5，Fujita-J, Takenawa-J, Kaneko-Y, et al. Anti-interleukin-6 (IL-6) therapy of IL-6-producing renal cell carcinoma. Hinyokika Kiyo, 1992, 38: 1333-1336.
6，Kong B, Isozaki T, Sasaki S. IL-6 antisense-mediated growth inhibition of a choriocarcinoma cell line: an intracellular autocrine growth mechanism. Gynecol Oncol, 1996, 63: 78-84.
7，Serve H, Steinhauser G, Oberberg D, et al. Studies on the interaction between interleukine-6 and human malignant nonhematopoietic cell lines. Can Res, 1991, 51: 3862-3866.
, 百拇医药
8，Kishimoto T, Akira S, Taga T, et al. Interleukine-6 and its receptor: a paradigm for cytokines. Science, 1992, 258: 593-597.
9，Masato O, Chung L, Ryoichy O, et al. Interleukin-6 as a paracrine and autocrine growth factor in human prostate carcinoma cells in vitro. Can Res, 1997, 57: 141-146.
10，Ogata A, Chauhan D, Teoh G, et al. IL-6 triggers cell growth via the Ras-dependent mitogen-activated protein kinase cascade. J Immunol, 1997, 159: 2212-2221.
(收稿日期：1999-07-21), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一医院 北京医科大学泌尿外科研究所
关键词：癌；肾细胞；白细胞介素-6；聚合酶链反应
中华医学杂志000425 【摘要】 目的 研究白细胞介素-6(IL-6)在肾癌细胞系GRC-1中的表达及其意义。方法 运用ELISA方法检测GRC-1培养上清中IL-6的浓度，运用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)在翻译和转录水平上检测IL-6及其受体系统的表达；观察重组人IL-6和IL-6中和抗体对GRC-1生长的影响；用表达IL-6反义RNA的质粒转染GRC-1，观察其增殖的改变。结果 GRC-1培养上清IL-6浓度为465 pg/ml，RT-PCR显示IL-6 mRNA及IL-6受体mRNA有表达；在重组人IL-6和IL-6中和抗体作用下生长无明显改变；转染表达IL-6反义RNA的质粒以后，GRC-1细胞IL-6分泌下降到250 pg/ml，但生长未受抑制。结论 尽管肾癌细胞系GRC-1可以表达IL-6，但重组人IL-6不能促进GRC-1的增殖，中和抗体和反义基因不能抑制细胞增殖，提示IL-6可能不是GRC-1的生长因子；GRC-1可以表达IL-6受体系统(IL-6 R和gp130)，提示IL-6的信号传导中断可能发生在受体下游。
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Studies on the interaction between interleukin-6 and human renal cell carcinoma cell line GRC-1
XI Zhijun
(Institute of Urology，The 1st Hospital of Beijing Medical University，Beijing 100034, China)
YU Lizhang
(Institute of Urology，The 1st Hospital of Beijing Medical University，Beijing 100034, China)
GUO Yinglu
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(Institute of Urology，The 1st Hospital of Beijing Medical University，Beijing 100034, China)
【Abstract】 Objective To demonstrate the effects of IL-6 on the renal cell carcinoma cell line GRC-1. Methods and results Immunocytochemical staining and RT-PCR analysis indicated that this cell line could express IL-6 both on mRNA and protein levels. Secretion of IL-6 in this cell line was 465 pg/ml, which was identified by ELISA assay. By RT-PCR analysis, we found that GRC-1 expressed IL-6 receptor system including IL-6 mRNA and gp130 mRNA. The rhIL-6 did not stimulate the growth of GRC-1 while the neutralizing antibody did not inhibit its growth. For further identification of the effect of IL-6 on GRC-1 cells, we introduced an antisense IL-6 RNA into GRC-1 cells. Thereafter, the lowered expression of IL-6 mRNA was observed by Northern blot, and the secretion of IL-6 was reduced to 250 pg/ml. But there were no significant growth-inhibitory effects on GRC-1 cells. Conclusion Although GRC-1 could express IL-6, IL-6 R and gp130, the rhIL-6 and IL-6 neutralizing antibody or transducing antisense IL-6 RNA could not change the growth of GRC-1 cells significantly. These results suggest that it is not likely for IL-6 functioning as an autocrine growth factor for GRC-1.
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【Key words】 Carcinomas, renal cell； Interleukin-6； Polymerase chain reaction
白细胞介素-6(IL-6)是一种多功能细胞因子，从人克隆出来的IL-6基因长度大约是5 kb，IL-6是一个单拷贝基因，定位于人染色体7p21。IL-6对于肿瘤呈现多样的生物学效应，其中尤以IL-6与肾细胞癌生长关系的研究引人关注。本所在以前的研究中，发现肾癌细胞系GRC-1可以表达IL-6，本实验将进一步探讨IL-6与肾癌细胞生长的关系及其可能的作用机制。
材料与方法
1.细胞培养：人肾颗粒细胞癌细胞系GRC-1由本研究所建立[1]。对照细胞系人肺巨细胞癌细胞系PG由本校病理学系提供[2]。用RPMI-1640培养液(美国Gibco公司)加体积分数为15%小牛血清培养细胞。
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2.细胞体外生长实验：参照文献[3]。包括细胞增殖实验(MTT法)、克隆形成率和生长曲线。重组人(rh)IL-6(1×108 U/mg，纯度>95%) 购自本校免疫中心。抗体中和实验采用的鼠抗人IL-6中和抗体购自美国R＆D公司。
3.IL-6浓度测定和免疫细胞化学检测：ELISA检测试剂盒购自中国人民解放军军事医学科学院邦定公司，按说明操作。免疫细胞化学检测为培养细胞悬液滴片，一抗采用鼠抗人IL-6单克隆抗体。按照LSAB操作说明进行染色。实验组为GRC-1，阳性对照为肺癌细胞系PG，阴性对照以PBS代替一抗。
4.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)：细胞总RNA的提取采用异硫氰酸胍一步法，反转录为cDNA。聚合酶链反应(PCR)引物分别为：IL-6：P1:5′-CCAGTACCCCCAGGAGAA-3′；P2: 5′-AAAGATCTGAG-GTGCCCATGCT-3′。IL-6 R：P1: 5′-CCACGACTCT-GGAAACTAT-3′；P2: 5′-ACTATGTAGAAAGAGCTGT-3′。gp130：P1: 5′-ACCTATGAAGATAGACCATCTAAA-3′；P2: 5′-GGTTCTATAAAATATAGTATAATT-3′。扩增先在94℃保持5 min，然后进入循环，具体操作如表1所示。取PCR产物10 μl在15 g/L琼脂糖凝胶电泳50 V 1 h，EB染色，BIORAD紫外分析仪观察照像。
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表1 PCR操作条件和期望片段大小 扩增片段
大小
(bp)
变性温度
(℃)及
时间(s)
复性温度
(℃)及
时间(s)
延伸温度
(℃)及
时间(s)
循环
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次数
IL-6
572
94，40
58，50
72，60
30
IL-6R
304
94，30
56，30
72，40
50
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gp130
740
94，60
55，90
72，150
40
5.基因转染及检测：表达hIL-6反义基因的pXJIL-6As由本校病理学系符坚博士提供。质粒的置备和鉴定参照文献[2]。基因转染参照LipofectAMINE(美国Gidco公司)产吕说明书进行，G418筛选耐药克隆，扩大培养。检测采用原位杂交方法：含有hIL-6 cDNA的pGEM4质粒由本研究所钟华博士提供。以BamH I使质粒线性化，采用带地高辛-UTP的RNA体外转录试剂盒(德国 Boehringer Mannheim公司)，方法参照产吕说明书，合成IL-6正义RNA探针。原位杂交方法参考产品说明进行。
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6.RNA印迹杂交(Northern Blot)：用EcoR I和Hind III酶切含IL-6cDNA的质粒pGEM 4,以 DNA片段，用cDNA标记和显色试剂盒(德国 Boehringer Mannheim)标记探针。杂交与显色按产品说明进行。
7.统计学处理：差异显著性检验采用t检验。
结果
一，肾癌细胞系GRC-1对IL-6的表达
将肾癌细胞系GRC-1细胞常规培养72h，收获上清，测得其中的IL-6浓度为465pg/ml±78pg/ml;作为对照，PG的培养上清中IL-6浓度为874pg/ml±98pg/ml。用细胞涂片进行免疫细胞化学染色可以看到GRC-1细胞胞浆中有IL-6的抗原表达。提取细胞总RNA，进行RT-RCR，结果在572bp的位置上GRC-1和对照PG都有IL-6的特异性的条带。同样从以IL-6 recrptor(gp80)和gp130的特异性引物进行的RT-PCR可以看到GRC-1在304bp的位置上有IL-6 recrptor(gp80)的特异性片段被扩增，在740bp的位置上有gp130的特异性片段被扩增，说明肾癌细胞系GRC-1可以表达IL-6 recrptor mRNA同进也表达gp130mRNA(图1，2)
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图1 肾癌细胞系GRC-1与对照细胞系 PG，对IL-6 Peceptor和gp130的表达
图2 肾癌细胞系RCG-949与对照细胞系( PG)，对IL-6 Receptor和gp130的表达 二、 rhIL-6对GRC-1细胞生长的影响
rhIL-6以不同浓度作用于GRC-1，并不呈现浓度依赖性的生长刺激作用。对照的PG细胞，在IL-6作用下，则呈现浓度依赖性的生长刺激现象。在不给予rhIL-6和给予rhIL-61000U/ml的两组细胞之间的比较，克隆形成率增加差异无显著意义；两给生长曲线差异不大。对照PG在给予rhIL-6之后，生长曲线高峰提前，克隆形成率增加。
三、IL-6中和抗体不能抑制GRC-1细胞生长
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四、 转导IL-6反义基因不能抑制GRC-1细胞生长
在原位杂交确定转染成功后，利用IL-6cDNA探针，进行 Northern杂交，可以看到GRC-1转染前后IL-6 mRNA的表达明显减低(图4)。对照的PG也有同样的表现。GRC-1转染后培养上清的IL-6分泌水平为250 pg/ml±40 pg/ml，转染前差异有显著意义(P<0.05)。细胞增殖实验显示肾癌细胞系在转染前后的增殖变化不大(P>0.05)，对照的PG在转染后增殖明显低于转染前(P<0.05)。克隆形成率GRC-1同样在转染前后差异无显著意义(P>0.05)。对于生长曲线的观察，更直观一些 (图5，6)。
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图3 IL-6中和抗体对于肾癌细胞系GRC-1和对照细胞系PG的生长抑制效果
图4 肾癌细胞系GRC-1和对照细胞系PG在
转染IL-6反义基因前后的Northern Blot结果
(采用地高辛标记的IL-6 cDNA探针)
讨论
IL-6在肾癌中的表达的报道较多见，但其表达程度很不一致，Takenawa在43例肾癌中22例检测到IL-6，7个肾癌细胞系中5个可以表达IL-6[4]。本研究所钟华博士检测了30例肾癌标本发现都有不同程度的IL-6 mRNA和蛋白表达，同时证实肾癌细胞系GRC-1可以表达IL-6。本实验也证实了肾癌细胞系GRC-1可以在转录和翻译水平表达IL-6。
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图5 肾癌细胞系GRC-1在转染IL-6反义基因
前后的生长曲线
图6 对照细胞系PG在转染IL-6反义基因前后的
生成曲线
Miki首次报道IL-6为肾癌细胞系ACHN的自分泌生长因子，并为大多数研究者所认同，随后有人提出应用IL-6抗体或反义基因等抗IL-6方式来抑制肾癌细胞生长，达到治疗肾癌的目的[5]。我们在实验中发现rhIL-6对肾癌细胞系GRC-1无明显的促增殖效应。随后又应用IL-6中和抗体作用于该细胞来降低IL-6的水平，肾癌细胞系GRC-1的生长依然变化不大。在对绒毛膜细胞癌的研究中发现，尽管rhIL-6不能刺激绒毛膜细胞癌细胞增长，并且IL-6、IL-6 R和gp130的中和抗体不能抑制该细胞生长，但导入IL-6的反义基因达到了抑制细胞生长的效应，提示IL-6可能存在细胞内自分泌机制[6]。为此我们又观察了转导IL-6反义基因后细胞的生长，结果在反义基因抑制IL-6表达后依然对GRC-1增殖影响不显著。提示，IL-6不是肾癌细胞系GRC-1的自分泌生长因子。
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Serve等[7]在研究中也发现rhIL-6不能促进肾癌细胞生长，IL-6中和抗体不抑制细胞生长，认为IL-6不是肾癌细胞的自分泌生长因子，但没有进一步探讨其原因。结合本实验结果，我们认为IL-6作为肾癌的生长因子缺乏普遍性。
IL-6的受体系统包括IL-6受体(IL-6 R)和gp130两部分，当IL-6同IL-6R结合之后，诱导gp130形成以二硫键连接的同源二聚体，IL-6与IL-6R形成六聚体，IL-6的信号借此传导至细胞内。随后IL-6通过两条信号途径诱导靶基因表达，即一条依赖Ras的支路和一条不依赖Ras的支路[8]。有报道IL-6 R表达缺陷导致了IL-6信号传导中断[9]。在我们对另一个肾癌细胞系的研究中又发现了gp130的表达缺陷。无论是IL-6 R或gp130的表达缺陷，均可以导致信号传导的中断，使得IL-6失去其生长因子的作用。
GRC-1细胞系可以表达IL-6 R mRNA和gp130 mRNA，提示IL-6的信号传导中膜受体的完整性，缺陷可能发生在受体下游。在对多发性骨髓瘤的IL-6信号传导途径研究中，发现非 Ras支路由 Jak激活的 STAT3、STAT1a并不引起肿瘤细胞增殖；而Ras依赖支路的IL-6引起 MAPK的磷酸化则可以促进肿瘤细胞增殖，应用 MAPK的反义基因可以抑制由IL-6引起的细胞增殖；因而认为在肿瘤细胞的IL-6信号系统中 STAT3、STAT1a支路可能与细胞增殖无关，IL-6促进细胞生长是通过MAPK支路[10]。对于肾癌来说，也许IL-6通过同样的机制发挥其促增殖的作用，那么GRC-1的信号传导缺陷就有可能发生于这一支路，对此我们将作进一步的研究。
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参考文献
1，丁义, 俞莉章, 李鸣, 等. 人肾颗粒细胞癌细胞系(GRC-1)的建立及其生物学特征. 中华泌尿外科杂志, 1995, 16: 3-6.
2，付坚, 郑杰, 吴秉权, 等. 自泌性白细胞介素-6对人肺巨细胞癌系PG生长的刺激作用. 中华病理学杂志, 1997, 26: 5-7.
3，韩复生. 分子细胞学技术在研究中的应用. 见：鄂征, 主编. 组织培养和分子细胞学技术. 北京：北京出版社, 1995. 434-448.
4，Takenawa J, Kaneko Y, Fucumoto M, et al. Enhanced expression of interleukine-6 in primary human renal cell carcinoma. J Natl Can Inst, 1991, 83: 1668-1672.
, http://www.100md.com
5，Fujita-J, Takenawa-J, Kaneko-Y, et al. Anti-interleukin-6 (IL-6) therapy of IL-6-producing renal cell carcinoma. Hinyokika Kiyo, 1992, 38: 1333-1336.
6，Kong B, Isozaki T, Sasaki S. IL-6 antisense-mediated growth inhibition of a choriocarcinoma cell line: an intracellular autocrine growth mechanism. Gynecol Oncol, 1996, 63: 78-84.
7，Serve H, Steinhauser G, Oberberg D, et al. Studies on the interaction between interleukine-6 and human malignant nonhematopoietic cell lines. Can Res, 1991, 51: 3862-3866.
, 百拇医药
8，Kishimoto T, Akira S, Taga T, et al. Interleukine-6 and its receptor: a paradigm for cytokines. Science, 1992, 258: 593-597.
9，Masato O, Chung L, Ryoichy O, et al. Interleukin-6 as a paracrine and autocrine growth factor in human prostate carcinoma cells in vitro. Can Res, 1997, 57: 141-146.
10，Ogata A, Chauhan D, Teoh G, et al. IL-6 triggers cell growth via the Ras-dependent mitogen-activated protein kinase cascade. J Immunol, 1997, 159: 2212-2221.
(收稿日期：1999-07-21), 百拇医药