气相色谱仪宽口径毛细管柱检测谷物中T-2毒素方法
作者：李德安 周宏博 李群伟 孟宪清
单位：李德安(哈尔滨医科大学，大骨节病研究所，黑龙江，哈尔滨，150001)；周宏博(哈尔滨医科大学，大骨节病研究所，黑龙江，哈尔滨，150001)；李群伟(哈尔滨医科大学，大骨节病研究所，黑龙江，哈尔滨，150001)；孟宪清(哈尔滨医科大学，大骨节病研究所，黑龙江，哈尔滨，150001)
关键词：气相色谱；T-2毒素；谷物
中国地方病学杂志000124 摘 要：目的 测定谷物中T-2毒素含量。方法 用GC-9A宽口径毛细管柱测定面粉中T-2毒素的含量。结果 该方法的回收率200ng为86.31%±1.40%,500ng为89.22%±2.04%。结论 方法操作简单，回收率高，最低检出量为30ng，线性范围50～2000ng。
中图分类号：657.7+1 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1000-4955(2000)01-0069-02
Wide caliber gas-chromatography to detect the content of T-2 toxin in grain
LI De-an,ZHOU Hong-bo,LI Qun-wei,et al
(KBD Institute,Harbin Medical University,Harbin 150001,China)
Abstract：Objective To detect the content of T-2 toxin in grain.Methods We use the wide caliber gas-chromatography to detect the content of T-2 toxin in grain.Results The average recoveries of 200ng and 500ng are 86.31%±1.40%,89.22%±2.04% respectively.Conclusions The method is simple,and the recovery is higher than that of other methods.At present,gas-chromatography becomes popular in detecting T-2 toxin.Wide caliber gas chromatography is first used to detect T-2 toxin in the field of endemic disease research.This method provides more advantageous tool to detect grain toxin.
, 百拇医药
Key words：Gas-chromatography;T-2 toxin;Grain▲
T-2毒素是天然存在的最危险的粮食污染物之一。在数十种单端孢霉烯族毒素中毒性最强，对人畜危害甚大[1]。目前T-2毒素的检测方法主要为物理化学检测法和免疫学检测法。免疫学检测法因T-2单抗生产难度较大，进口抗体价格昂贵限制它的应用[2，3]。物理化学检测法中，以气相色谱应用最广泛[4]。宽口径毛细管柱具有毛细柱和填充柱的双重优点，定量准确，价格低，应用前景广阔，为今后谷物中T-2毒素的检测提供了方法学基础。
1 材料与方法
1.1 仪器 岛津GC-9A SE-54宽口径毛细管柱30m×0.54mm(大连化物所)。以下条件：载气压力3.0kg/cm2，载气流速30ml/min，进样口温度260℃，柱温210℃～260℃，升温速率1.5℃/min,FID检测器，无分流，H2压力0.6kg/cm2，空气压力0.5kg/cm2。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 T-2毒素购自军事医学科学院；三甲基硅基咪唑(T)，三甲基硅基乙酰胺(B)，三甲基氯硅烷(T)均购自Sigma公司；其余试剂为国产分析纯。
1.3 T-2毒素标准液 用丙酮配制成1mg/ml的工作液，冰冻保存。
1.4 样品提取步骤 取面粉20g，放置烧瓶中，倒入100ml三氯甲烷无水乙醇(4∶1)和8ml双蒸水，振荡1h，过滤。滤液60℃水浴，快干时，用20ml甲醇水(4∶1)和20ml石油醚反复洗蒸发皿，倒入分液漏斗中，振荡，甲醇水过柱(0.5g中性氧化铝和0.5g活性炭)，用20ml 9∶1甲醇水洗脱，再用20ml无水甲醇洗脱，洗脱液收集于蒸发皿中，55℃水浴蒸干，残渣用少量丙酮∶甲醇(2∶1)溶液洗涤，放入衍生安瓶中，50℃ N2吹干，加入TBT100μl,100℃衍生30min，加入20μl正已烷，20μl去离子水振荡，分层取上清，50℃ N2吹干，用正己烷定容，取1μl上机分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 T-2毒素标准品图谱如图1所示，谷物样品气谱图如图2所示(此图为扣除空白谷物后色谱图)；用外标法作标准曲线测定粮样T-2毒素含量，线性范围50～2000ng，标准曲线如图3所示。
图1 T-2毒素标准品
图2 扣除本底后粮食样品
图3 T-2毒素标准曲线
2.2 回收率测定 采用加入回收法和提取回收法测定回收率，200ng,500ng平均回收率为86.31%±1,40%,89.22%±2.04%。
, 百拇医药
2.3 精密度实验 以200ng和500ngT-2毒素，分别做日内重复和日间重复，结果见附表。
附表 日内变异和日间变异(n=5) T-2毒素
(ng)
日内
日间
峰面积
CV(%)
峰面积
CV(%)
200
500
43405.1±1976.6
, 百拇医药
102159.3±3004.9
4.55
2.94
43880.3±2343.2
105065.8±9943.2
5.34
9.46
3 讨论
单端孢霉素最佳检测方法是ELISA法，已为世所公认。但该法成本较高，技术条件复杂，目前尚未能普遍应用，而且今后发展前景也须视开发、研制的进程而定，怕不是短期内可以解决的[5]。
迄今应用较宽的GC毛细管法，有其固有的缺欠，主要是样品经分流处理后含量甚微，因而难以保持良好的稳定的重复性，灵敏度较低，实验室间可重复性较差。宽口径毛细柱法问世未久,然而如前所述，具有毛细管柱和填充柱双重优点，进样量大且分离效果亦佳，试用后感到是一种相对简便、便宜、重复性能好的一种方法。
, http://www.100md.com
T-2毒素研究首先在地方病、大骨节病研究中展开有其实际的根据，然而一旦普及其它领域，将有属于发现和解释许多新的疾病与健康问题，作者认为这些恰是推动深入研究T-2毒素检测方法的前提。■
作者简介：李德安，女，1956年生，实验师
参考文献：
[1]罗海波，杨景云，鲍行豪.细菌毒素(第二辑)[M].北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1994.
[2]Rachel C L,David L B,Robert W W,et al.Immunochemical Studies on the wxcretion of T-2 toixn metabolites in rat and cynomolgus monkey Urine[J].J Agric Food Chem,1990,138(2):444-448.
[3]李群伟.T-2单抗的制备及其ELISA检测法(综述)[J].中国地方病学杂志，大骨节病监测专刊，1996，11.
[4]李群伟，李德安，孟宪清，等.气谱法测定粮食中毒素方法的改进[J].中国地方病学杂志，1997，16(6):335-336.
[5]唐小波.制备T-2毒素抗体方法研究进展[J].中国地方病学杂志，1998，17(2)：124-126.
收稿日期：1999-09-06, 百拇医药
单位：李德安(哈尔滨医科大学，大骨节病研究所，黑龙江，哈尔滨，150001)；周宏博(哈尔滨医科大学，大骨节病研究所，黑龙江，哈尔滨，150001)；李群伟(哈尔滨医科大学，大骨节病研究所，黑龙江，哈尔滨，150001)；孟宪清(哈尔滨医科大学，大骨节病研究所，黑龙江，哈尔滨，150001)
关键词：气相色谱；T-2毒素；谷物
中国地方病学杂志000124 摘 要：目的 测定谷物中T-2毒素含量。方法 用GC-9A宽口径毛细管柱测定面粉中T-2毒素的含量。结果 该方法的回收率200ng为86.31%±1.40%,500ng为89.22%±2.04%。结论 方法操作简单，回收率高，最低检出量为30ng，线性范围50～2000ng。
中图分类号：657.7+1 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1000-4955(2000)01-0069-02
Wide caliber gas-chromatography to detect the content of T-2 toxin in grain
LI De-an,ZHOU Hong-bo,LI Qun-wei,et al
(KBD Institute,Harbin Medical University,Harbin 150001,China)
Abstract：Objective To detect the content of T-2 toxin in grain.Methods We use the wide caliber gas-chromatography to detect the content of T-2 toxin in grain.Results The average recoveries of 200ng and 500ng are 86.31%±1.40%,89.22%±2.04% respectively.Conclusions The method is simple,and the recovery is higher than that of other methods.At present,gas-chromatography becomes popular in detecting T-2 toxin.Wide caliber gas chromatography is first used to detect T-2 toxin in the field of endemic disease research.This method provides more advantageous tool to detect grain toxin.
, 百拇医药
Key words：Gas-chromatography;T-2 toxin;Grain▲
T-2毒素是天然存在的最危险的粮食污染物之一。在数十种单端孢霉烯族毒素中毒性最强，对人畜危害甚大[1]。目前T-2毒素的检测方法主要为物理化学检测法和免疫学检测法。免疫学检测法因T-2单抗生产难度较大，进口抗体价格昂贵限制它的应用[2，3]。物理化学检测法中，以气相色谱应用最广泛[4]。宽口径毛细管柱具有毛细柱和填充柱的双重优点，定量准确，价格低，应用前景广阔，为今后谷物中T-2毒素的检测提供了方法学基础。
1 材料与方法
1.1 仪器 岛津GC-9A SE-54宽口径毛细管柱30m×0.54mm(大连化物所)。以下条件：载气压力3.0kg/cm2，载气流速30ml/min，进样口温度260℃，柱温210℃～260℃，升温速率1.5℃/min,FID检测器，无分流，H2压力0.6kg/cm2，空气压力0.5kg/cm2。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 T-2毒素购自军事医学科学院；三甲基硅基咪唑(T)，三甲基硅基乙酰胺(B)，三甲基氯硅烷(T)均购自Sigma公司；其余试剂为国产分析纯。
1.3 T-2毒素标准液 用丙酮配制成1mg/ml的工作液，冰冻保存。
1.4 样品提取步骤 取面粉20g，放置烧瓶中，倒入100ml三氯甲烷无水乙醇(4∶1)和8ml双蒸水，振荡1h，过滤。滤液60℃水浴，快干时，用20ml甲醇水(4∶1)和20ml石油醚反复洗蒸发皿，倒入分液漏斗中，振荡，甲醇水过柱(0.5g中性氧化铝和0.5g活性炭)，用20ml 9∶1甲醇水洗脱，再用20ml无水甲醇洗脱，洗脱液收集于蒸发皿中，55℃水浴蒸干，残渣用少量丙酮∶甲醇(2∶1)溶液洗涤，放入衍生安瓶中，50℃ N2吹干，加入TBT100μl,100℃衍生30min，加入20μl正已烷，20μl去离子水振荡，分层取上清，50℃ N2吹干，用正己烷定容，取1μl上机分析。
, 百拇医药
2 结果
2.1 T-2毒素标准品图谱如图1所示，谷物样品气谱图如图2所示(此图为扣除空白谷物后色谱图)；用外标法作标准曲线测定粮样T-2毒素含量，线性范围50～2000ng，标准曲线如图3所示。
图1 T-2毒素标准品
图2 扣除本底后粮食样品
图3 T-2毒素标准曲线
2.2 回收率测定 采用加入回收法和提取回收法测定回收率，200ng,500ng平均回收率为86.31%±1,40%,89.22%±2.04%。
, 百拇医药
2.3 精密度实验 以200ng和500ngT-2毒素，分别做日内重复和日间重复，结果见附表。
附表 日内变异和日间变异(n=5) T-2毒素
(ng)
日内
日间
峰面积
CV(%)
峰面积
CV(%)
200
500
43405.1±1976.6
, 百拇医药
102159.3±3004.9
4.55
2.94
43880.3±2343.2
105065.8±9943.2
5.34
9.46
3 讨论
单端孢霉素最佳检测方法是ELISA法，已为世所公认。但该法成本较高，技术条件复杂，目前尚未能普遍应用，而且今后发展前景也须视开发、研制的进程而定，怕不是短期内可以解决的[5]。
迄今应用较宽的GC毛细管法，有其固有的缺欠，主要是样品经分流处理后含量甚微，因而难以保持良好的稳定的重复性，灵敏度较低，实验室间可重复性较差。宽口径毛细柱法问世未久,然而如前所述，具有毛细管柱和填充柱双重优点，进样量大且分离效果亦佳，试用后感到是一种相对简便、便宜、重复性能好的一种方法。
, http://www.100md.com
T-2毒素研究首先在地方病、大骨节病研究中展开有其实际的根据，然而一旦普及其它领域，将有属于发现和解释许多新的疾病与健康问题，作者认为这些恰是推动深入研究T-2毒素检测方法的前提。■
作者简介：李德安，女，1956年生，实验师
参考文献：
[1]罗海波，杨景云，鲍行豪.细菌毒素(第二辑)[M].北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，1994.
[2]Rachel C L,David L B,Robert W W,et al.Immunochemical Studies on the wxcretion of T-2 toixn metabolites in rat and cynomolgus monkey Urine[J].J Agric Food Chem,1990,138(2):444-448.
[3]李群伟.T-2单抗的制备及其ELISA检测法(综述)[J].中国地方病学杂志，大骨节病监测专刊，1996，11.
[4]李群伟，李德安，孟宪清，等.气谱法测定粮食中毒素方法的改进[J].中国地方病学杂志，1997，16(6):335-336.
[5]唐小波.制备T-2毒素抗体方法研究进展[J].中国地方病学杂志，1998，17(2)：124-126.
收稿日期：1999-09-06, 百拇医药