ICAM－1系统在异位性皮炎发病中的意义
作者：尹兴平 唱文娟 张开明
单位：太原市中心医院(030009)尹兴平 唱文娟 张开明
关键词：异位性皮炎；ICAM-1；sICAM-1
论著
摘 要 为了解ICAM-1系统在异位性皮炎(AD)发病中的作用，采用ELISA和免疫组化技术对AD患者的血清、皮损、外周血PBMC的sICAM-1含量及ICAM-1表达进行了综合研究。结果显示：①AD患者血清sICAM-1含量显著高于对照组，而每100个PBMC中ICAM-1表达阳性细胞数两组间无明显差异；②11例皮损中ICAM-1表达呈强阳性者共6例， 主要位于基底层角蛋白细胞和真皮浸润的炎症细胞表面，9例对照标本仅2例基底角蛋白细胞呈弱阳性。提示AD发病与ICAM-1系统有密切的关系。
近年有研究发现ICAM-1与变应性皮肤病发病密切相关，为此我们采用ELISA、免疫组化技术检测了异位性皮炎(AD)患者血清sICAM-1含量及皮损、外周血PBMCICAM-1的表达水平，以了解ICAM-1在AD发病中的变化及其可能的机制，现将结果报告如下。
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1 资料与方法
1.1 病例选择取1997年10月—1998年1月我科门诊及住院的AD患者 (2周内未系统使用过皮质类固醇激素和免疫抑制剂)共15例，发病年龄8岁～57岁。健康对照者17例，为与AD患者年龄相近，既往无任何变应性疾病的志愿者。
1.2 试剂
sICAM-1ELISA试剂盒为比利时MEDGENIX产品；淋巴细胞分离液、APAAP试剂盒购自军事医学科学院基础医学研究所；鼠抗人ICAM-1单克隆抗体及免疫组化SPTM试剂盒为ZYMED公司产品，购自北京中山试剂公司。
1.3 标本处理
取AD患者和健康对照者静脉血5ml，3ml分离血清并-40℃冻存，待标本累积够既定例数后，一次性同步测定。2ml抗凝、分离PBMC并涂片。AD皮损标本取自皮肤科5年以内被确诊为AD患者的石蜡切块，健康对照皮肤标本由我院手术科室提供。
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1.4 方法
1.4.1 APAAP桥联酶标法：①PBMC离心涂片后，丙酮固定，加稀释度为1∶50鼠抗人ICAM-1单克隆抗体，室温孵育；②PBS冲洗，加羊抗鼠IgG二抗，同前孵育、冲洗； ③加APAAP复合物同前孵育、冲洗；④加碱性磷酸酶底物液室温显色20min，蒸馏水冲洗，苏木素复染，水洗，封片。显微镜下计数300个有核细胞，然后统计每100个PBMC中ICAM-1表达阳性细胞数，阴性细胞表面可见红色颗粒物。
1.4.2 血清sICAM-1含量测定采用ELISA法。主要操作步骤为：①待测标本按1∶100稀释，每孔加入25μl标准品、生理盐水(空白)或稀释标本，均设复孔。再加入抗ICAM-1-HRP75μl/孔，室温振荡孵育120min；②弃去孔内液体， 洗板，加底物液200μl/孔，避光，振荡孵育30min；③加终止液50μl/孔终止反应； ④避光静置30min后在Labsystem酶标仪(芬兰产)上采用双波长(490nm,650nm)测定各孔吸光度值， 并绘制标准曲线。根据样品吸光度值(复孔均值)查标准曲线并乘以100倍即可得到血清中sICAM1含量(μg/L)。
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1.4.3 皮损免疫组化：①石蜡切片，常规脱蜡至水。加3%过氧化氢孵育10min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡，加10%正常山羊血清封闭10min；②加1∶50鼠抗人ICAM-1单克隆抗体4℃过夜；③PBS冲洗，滴加生物素标记二抗37℃孵育30min；④PBS冲洗，加1∶300辣根过氧化物酶标记链霉卵白素同前孵育、冲洗，DAB显色、复染、脱水、透明、封片。 显微镜下观察，ICAM-1表达阳性部位有棕黄色颗粒物沉积。
1.5 统计学处理
利用本室微机的SPSS统计软件包，对血清sICAM-1含量和每100个PBMC中ICAM阳性细胞数经方差分析后进行t检验。
2 结果
2.1 AD患者血清sICAM-1含量明显高于对照(P<0.001)，而每100个PBMC中ICAM-1表达阳性细胞数无显著差异，见表1。
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表1 AD患者血清ICAM-1含量和每100个
PBMC中ICAM-1表达阳性数(±s)
组别
n
sICAM-1含量
细胞数
μg/L
个
正常
17
180.5±12.1
12.33±4.73
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AD组
15
274.7±87.51)
15.00±1.582)
注：与对照组比较 1)P<0.05 2)P>0.05
2.2 免疫组化研究发现多数AD患者皮损基底层角蛋白细胞及真皮浸润炎症细胞表面ICAM-1表达呈强阳性，而9例正常对照组仅2例基底角蛋白细胞呈弱阳性。
3 讨论
ICAM-1又名CD54，属于粘附受体免疫球蛋白超家族，是膜表面白细胞功能相关性抗原1即LFA-1整合素的一种配体，二者结合形成ICAM-1-LFA-1复合物在免疫反应特别是免疫活化过程中起重要作用，介导细胞—细胞、细胞—基质之间的粘附性。存在于血清和体中的循环ICAM-1即sICAM-1的来源说法不一， 有人推测是膜ICAM-1经蛋白裂解酶作用发生裂解、脱落形成的可溶性分子，有研究证实单个核细胞、血管内皮细胞以及肿瘤细胞在体内特定条件下可合成该因子， 据此有人认为sICAM-1可能是体内细胞合成并分泌至胞外的生物介质。研究发现sICAM-1含有膜ICAM-1的大部分功能区，因而有生物学活性，可与LFA-1结合。 本实验发现AD患者sICAM-1含量显著高于正常人群，而PBMCICAM-1表达阳性率无明显差异， 由此推测sICAM-1含量增加不仅与PBMC活化有关，活化的血管内皮细胞也参与该变化。Kowalzick等〔1〕对AD治疗前后ICAM-1系统变化的结果也支持这一观点。 尽管人们对sICAM-1在AD疗效评价中的作用尚有争议， 但sICAM-1可能竞争性地拮抗ICAM-1与LFA-1结合，阻断由此介导的细胞之间的粘附性、发挥“抗炎”作用。
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Jung等〔2〕对AD皮损的免疫组化研究也发现皮损区特别是基底角蛋白细胞和真皮浸润炎症细胞如T淋巴细胞、单核细胞、 巨噬细胞以及内皮细胞表面ICAM-1表达呈强阳性。体外实验表明〔3〕多种细胞表面均有ICAM-1表达。且表达水平受细胞因子的调节。由于推测AD皮损ICAM-1表达可能与参与免疫反应的活化细胞分泌的细胞因子的差异〔4〕， CD+4细胞可分为TH1和TH2亚群，TH1主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β，而TH2分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10。有研究发现AD皮损区浸润CD+4细胞主要是TH2亚群并且伴有TH2亚群扩大。TH2在自分泌和肥大细胞〔5〕分泌的IL-4作用下，分泌多种细胞因子，刺激B细胞增殖，分化并合成IgE型抗体，进而刺激肥大细胞和嗜酸性粒细胞的增长、分化， 协同促进变态反应，释放炎症介质。在皮损局部生物学活性物质的共同作用下，导致角蛋白细胞ICAM-1表达明显增强。
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综上所述， AD患者血清sICAM-1和皮损局部ICAM-1表达均有明显变化，ICAM-1系统参与其发病过程特别是免疫活化过程中细胞间信息传递、抗原递呈以及炎症细胞向炎症部位的游走、趋化和聚集， 其中sICAM-1可能伴有抗炎作用。作为炎症性皮肤病和其它疾病的一个非特异性指标，有关其在疗效评价方面的作用留待进一步研究。
参考文献
1 KowalzickL.Dermatology,1995，190(1):14
2 JungK.Allergy,1996,51(7):452
3 GrovesRW,AllenMH,RossEL[WTBX]etal.[WT][HT6]BrJDermatology,1995,132(3):345
4 洪建.上海免疫学杂志，1994，14(4)：242
5 HorsmanneimoL,HarrimaIT,JalvikallioA[WTBX]etal.[WT][HT6]JDermatology,1994,131(3):348
(收稿日期：1998-09-28)
作者简介：尹兴平，男，1970年8月生，主治医师，太原市中心医院，030009, 百拇医药
单位：太原市中心医院(030009)尹兴平 唱文娟 张开明
关键词：异位性皮炎；ICAM-1；sICAM-1
论著
摘 要 为了解ICAM-1系统在异位性皮炎(AD)发病中的作用，采用ELISA和免疫组化技术对AD患者的血清、皮损、外周血PBMC的sICAM-1含量及ICAM-1表达进行了综合研究。结果显示：①AD患者血清sICAM-1含量显著高于对照组，而每100个PBMC中ICAM-1表达阳性细胞数两组间无明显差异；②11例皮损中ICAM-1表达呈强阳性者共6例， 主要位于基底层角蛋白细胞和真皮浸润的炎症细胞表面，9例对照标本仅2例基底角蛋白细胞呈弱阳性。提示AD发病与ICAM-1系统有密切的关系。
近年有研究发现ICAM-1与变应性皮肤病发病密切相关，为此我们采用ELISA、免疫组化技术检测了异位性皮炎(AD)患者血清sICAM-1含量及皮损、外周血PBMCICAM-1的表达水平，以了解ICAM-1在AD发病中的变化及其可能的机制，现将结果报告如下。
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1 资料与方法
1.1 病例选择取1997年10月—1998年1月我科门诊及住院的AD患者 (2周内未系统使用过皮质类固醇激素和免疫抑制剂)共15例，发病年龄8岁～57岁。健康对照者17例，为与AD患者年龄相近，既往无任何变应性疾病的志愿者。
1.2 试剂
sICAM-1ELISA试剂盒为比利时MEDGENIX产品；淋巴细胞分离液、APAAP试剂盒购自军事医学科学院基础医学研究所；鼠抗人ICAM-1单克隆抗体及免疫组化SPTM试剂盒为ZYMED公司产品，购自北京中山试剂公司。
1.3 标本处理
取AD患者和健康对照者静脉血5ml，3ml分离血清并-40℃冻存，待标本累积够既定例数后，一次性同步测定。2ml抗凝、分离PBMC并涂片。AD皮损标本取自皮肤科5年以内被确诊为AD患者的石蜡切块，健康对照皮肤标本由我院手术科室提供。
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1.4 方法
1.4.1 APAAP桥联酶标法：①PBMC离心涂片后，丙酮固定，加稀释度为1∶50鼠抗人ICAM-1单克隆抗体，室温孵育；②PBS冲洗，加羊抗鼠IgG二抗，同前孵育、冲洗； ③加APAAP复合物同前孵育、冲洗；④加碱性磷酸酶底物液室温显色20min，蒸馏水冲洗，苏木素复染，水洗，封片。显微镜下计数300个有核细胞，然后统计每100个PBMC中ICAM-1表达阳性细胞数，阴性细胞表面可见红色颗粒物。
1.4.2 血清sICAM-1含量测定采用ELISA法。主要操作步骤为：①待测标本按1∶100稀释，每孔加入25μl标准品、生理盐水(空白)或稀释标本，均设复孔。再加入抗ICAM-1-HRP75μl/孔，室温振荡孵育120min；②弃去孔内液体， 洗板，加底物液200μl/孔，避光，振荡孵育30min；③加终止液50μl/孔终止反应； ④避光静置30min后在Labsystem酶标仪(芬兰产)上采用双波长(490nm,650nm)测定各孔吸光度值， 并绘制标准曲线。根据样品吸光度值(复孔均值)查标准曲线并乘以100倍即可得到血清中sICAM1含量(μg/L)。
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1.4.3 皮损免疫组化：①石蜡切片，常规脱蜡至水。加3%过氧化氢孵育10min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡，加10%正常山羊血清封闭10min；②加1∶50鼠抗人ICAM-1单克隆抗体4℃过夜；③PBS冲洗，滴加生物素标记二抗37℃孵育30min；④PBS冲洗，加1∶300辣根过氧化物酶标记链霉卵白素同前孵育、冲洗，DAB显色、复染、脱水、透明、封片。 显微镜下观察，ICAM-1表达阳性部位有棕黄色颗粒物沉积。
1.5 统计学处理
利用本室微机的SPSS统计软件包，对血清sICAM-1含量和每100个PBMC中ICAM阳性细胞数经方差分析后进行t检验。
2 结果
2.1 AD患者血清sICAM-1含量明显高于对照(P<0.001)，而每100个PBMC中ICAM-1表达阳性细胞数无显著差异，见表1。
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表1 AD患者血清ICAM-1含量和每100个
PBMC中ICAM-1表达阳性数(±s)
组别
n
sICAM-1含量
细胞数
μg/L
个
正常
17
180.5±12.1
12.33±4.73
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AD组
15
274.7±87.51)
15.00±1.582)
注：与对照组比较 1)P<0.05 2)P>0.05
2.2 免疫组化研究发现多数AD患者皮损基底层角蛋白细胞及真皮浸润炎症细胞表面ICAM-1表达呈强阳性，而9例正常对照组仅2例基底角蛋白细胞呈弱阳性。
3 讨论
ICAM-1又名CD54，属于粘附受体免疫球蛋白超家族，是膜表面白细胞功能相关性抗原1即LFA-1整合素的一种配体，二者结合形成ICAM-1-LFA-1复合物在免疫反应特别是免疫活化过程中起重要作用，介导细胞—细胞、细胞—基质之间的粘附性。存在于血清和体中的循环ICAM-1即sICAM-1的来源说法不一， 有人推测是膜ICAM-1经蛋白裂解酶作用发生裂解、脱落形成的可溶性分子，有研究证实单个核细胞、血管内皮细胞以及肿瘤细胞在体内特定条件下可合成该因子， 据此有人认为sICAM-1可能是体内细胞合成并分泌至胞外的生物介质。研究发现sICAM-1含有膜ICAM-1的大部分功能区，因而有生物学活性，可与LFA-1结合。 本实验发现AD患者sICAM-1含量显著高于正常人群，而PBMCICAM-1表达阳性率无明显差异， 由此推测sICAM-1含量增加不仅与PBMC活化有关，活化的血管内皮细胞也参与该变化。Kowalzick等〔1〕对AD治疗前后ICAM-1系统变化的结果也支持这一观点。 尽管人们对sICAM-1在AD疗效评价中的作用尚有争议， 但sICAM-1可能竞争性地拮抗ICAM-1与LFA-1结合，阻断由此介导的细胞之间的粘附性、发挥“抗炎”作用。
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Jung等〔2〕对AD皮损的免疫组化研究也发现皮损区特别是基底角蛋白细胞和真皮浸润炎症细胞如T淋巴细胞、单核细胞、 巨噬细胞以及内皮细胞表面ICAM-1表达呈强阳性。体外实验表明〔3〕多种细胞表面均有ICAM-1表达。且表达水平受细胞因子的调节。由于推测AD皮损ICAM-1表达可能与参与免疫反应的活化细胞分泌的细胞因子的差异〔4〕， CD+4细胞可分为TH1和TH2亚群，TH1主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β，而TH2分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10。有研究发现AD皮损区浸润CD+4细胞主要是TH2亚群并且伴有TH2亚群扩大。TH2在自分泌和肥大细胞〔5〕分泌的IL-4作用下，分泌多种细胞因子，刺激B细胞增殖，分化并合成IgE型抗体，进而刺激肥大细胞和嗜酸性粒细胞的增长、分化， 协同促进变态反应，释放炎症介质。在皮损局部生物学活性物质的共同作用下，导致角蛋白细胞ICAM-1表达明显增强。
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综上所述， AD患者血清sICAM-1和皮损局部ICAM-1表达均有明显变化，ICAM-1系统参与其发病过程特别是免疫活化过程中细胞间信息传递、抗原递呈以及炎症细胞向炎症部位的游走、趋化和聚集， 其中sICAM-1可能伴有抗炎作用。作为炎症性皮肤病和其它疾病的一个非特异性指标，有关其在疗效评价方面的作用留待进一步研究。
参考文献
1 KowalzickL.Dermatology,1995，190(1):14
2 JungK.Allergy,1996,51(7):452
3 GrovesRW,AllenMH,RossEL[WTBX]etal.[WT][HT6]BrJDermatology,1995,132(3):345
4 洪建.上海免疫学杂志，1994，14(4)：242
5 HorsmanneimoL,HarrimaIT,JalvikallioA[WTBX]etal.[WT][HT6]JDermatology,1994,131(3):348
(收稿日期：1998-09-28)
作者简介：尹兴平，男，1970年8月生，主治医师，太原市中心医院，030009, 百拇医药