Nd:YAG 激光与根面平整对牙龈成纤维细胞在根面附着的影响
作者：朱庆萍 孙卫斌 倪晓武
单位：江苏省(210029)南京医科大学口腔医学院；(210094)南京理工大学(倪晓武)
关键词：Nd:YAG激光；人牙龈成纤维细胞；根面
口腔医学纵横990404 摘要 目的：为探讨Nd:YAG激光照射对牙周病患牙根面的生物相容性影响。方法：应用体外细胞培养技术，观察激光照射等处理根面的不同方式对人牙龈成纤维细胞(Human gingival fibroblast, HGF)附着的影响。结果：Nd:YAG激光照射+根面平整组，成纤维细胞接种24h后的附着量明显高于单纯Nd:YAG激光照射组和单纯根面平整组(P<0.05)。而单纯激光照射组(80mj/mm2)和单纯根面平整组细胞附着量又明显大于未处理组(P<0.05)。结论：用一定能量密度的Nd:YAG激光照射与根面平整术联合应用可提高HGF在患牙根面上的附着量。
, 百拇医药
中图分类号 R781.4
Effects of the Nd:YAG laser and root planing on human
gingival fibroblast attachment to root surfaces.
Zhu Qingping, Sun Weibin, Ni Xiaowu*.
College of Stomatology, Nanjing Medical University, Nanjing, 210029，China. Ni Xiaowu Nanjing
University of Science & Technology, Nanjing, 210094, China
, 百拇医药
Abstract Objective：To observe the bioincompatibility of periodontal diseased root surfaces after Nd :YAG laser radiation. Methods： Using cell culture method to observe the effects of laser irradiating and root planing on fibroblast attachment to root surfaces. Results： The numbers of attachment cells has significant differences between the laser/root planing combined treated group and laser-only or root planing-only treated group (P<0.05), and between the laser-only with energy density was 80mj/mm2 or root planing-only treated groups and non-treatment group (P<0.05). When the laser energy density was 80mj/mm2, the mounts of fibroblasts attachment would not change.(P>0.05) Conclusion：Laser/root planing combined treated could enhance fibroblast attachment.
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Key Words Nd:YAG laser Human gingival fibroblast root surfaces
在牙周炎症状态下，暴露在牙周袋内环境中的牙骨质和牙本质发生了一系列变化，从而对牙周结缔组织的附着产生了生物排斥性。如何有效地除去患牙根面致病因素，利于成纤维细胞的附着，实现牙周膜的再生是牙周治疗的根本目的。除目前常用的刮治术，机械或超声根面平整术等，Nd:YAG激光由于其杀菌、去除玷污层，气化牙结石等独特的功能而倍受关注。然而，经过激光照射后的患牙根面的生物相容性有无改善，对成纤维细胞附着的影响如何，这些将是本研究所要探讨的。
材料与方法
一、根面标本制作及分组
在本院外科门诊收集因重度牙周病(牙周袋深>5mm，松动II(以上)拔除的双尖牙20颗，冲净血迹，去除根面残留组织和牙石，在水冷却条件下，用金刚砂外圆切割片先将牙冠齐釉牙骨质界下1mm处截去，再从根的近中切割出约5mm(5mm(1mm大小薄片(根面不作磨除，保留原有形态，作为实验区)，并随机分为下列各组：
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处理一组：单纯机械根面平整。
处理二组：单纯激光照射。脉冲式Nd:YAG激光机(南京理工大学提供)，波长1064nm，重复频率15Hz，能量为0.15W～1W，照射时间10s，能量密度80 mj/mm2。
处理三组：单纯激光照射+根面平整。激光照射同处理一组。照射后立即行常规机械根面平整。
未处理组：根面未作处理，作为对照。
以上各组根片经处理后分别置入配制好的抗菌液中(青霉素100(g/ml，链霉素100(g/ml，酮康唑0.2(g/ml)，冷冻保存备用。
二、牙龈成纤维细胞培养
切取引产胎儿(30周)的牙龈组织，立即投入1640培养液中，在超净工作台内将牙龈组织用加有抗菌素的Hank's液反复漂洗3遍后，剪成约1mm(1mm大小，均匀铺贴在25ml培养瓶的瓶底，加入4ml含10%胎牛血清的1640培养液，反置于CO2孵箱内，2h后翻转培养瓶。第6天见有梭形细胞游出，待细胞铺满大半瓶底，即进行第一次传代，第5～10代细胞用于实验。
, 百拇医药
三、实验方法
每组5块根片，分别置入12孔板的4孔内(每孔5块)，加入含有10%胎牛血清的1640培养液2ml，接种HGF，浓度为1.5×105，二氧化碳孵箱内(37°C，5%CO2，95%空气，100%湿度)培养24h后取出根片，温PPS清洗三遍，甲醇—冰醋酸固定10min，0.1%台盼兰染色1min，蒸馏水冲洗三遍，晾干，置解剖显微镜下，通过0.8mm目镜网格计数0.1mm2范围内的根面细胞附着数。为尽量减少误差，每块标本的计数视野区均固定在根片的四个角内的对角线上及中心处，共5个视野，取其均数。所得数据采用SigmaStat统计软件，进行F检验和组间分析。
结 果
附表 处理方式对HGF附着根面的影响(n=5)
组别
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处理方式
细胞附着计数
(
±s)
F
P
1
单纯根面平整
14.00±7.84
2
单纯激光照射
22.60±6.11
3
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激光照射+根面平整
37.60±8.02
21.9
<0.0001
4
未处理
5.20±1.79
经单因素方差分析，除单纯根面平整组与单纯激光照射组细胞附着数无明显差异(P>0.05)外，其余各组间细胞附着数均有显著性差异(P<0.05)。
扫描电镜下见：单纯根面平整组(图1)和单纯激光照射组(图2)细胞分布比较均匀，附着密度相似。激光照射+根面平整后(图3)细胞分布均匀，附着数量多。未处理根面组(图4)HGF附着数少于其它三处理组。
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图1 单纯根面平整组HGF附着状况 ×100 图2 单纯激光照射组HGF附着状况 ×100
图3 激光照射+根面平整联合处理组HGF附着状况 ×100 图4 未处理组HGF附着状况 ×100
讨 论
牙周治疗的最终目的是使丧失的牙周结缔组织附着再生。在牙周膜及牙龈韧带纤维与健康根面相连的组织结构中，成纤维细胞是最主要的细胞形式。大多数学者都将成纤维细胞的附着作为观察根面生物相容性的一项主要指征。有关各种根面处理涉及根面病变状态通常都选用成纤维细胞的附着状况来加以评价[1～3]。本实验采用组织块培养法获得体外生长的HGF，将其接种于经不同处理方式预备过的根面上，结果显示用激光照射后再施行根面平整术，24hHGF附着量明显多于单纯激光照射组、单纯根面平整组及未处理组。(P<0.05)，而单纯激光照射或单纯根面平整时，HGF的附着量又明显多于未处理的患牙根面(P<0.05)。由此可以推测，牙周病患者根面，如经过单纯激光照射或单纯根面平整，均较未处理过的根面利于HGF的附着。而激光照射+根面平整联合处理效果更好。
, 百拇医药
从扫描电镜(SEM)下观察，HGF在经不同方式处理过的根面上附着后，其形态大多为梭形，少数为近似圆形。尤其在激光照射+根面平整组，细胞分布均匀，生长状况良好，而未处理组，可见根面附着大量牙石、菌斑及病变牙骨质，根面呈凹凸不平，凹陷处未铺展细胞多，生长状况不良。可见，牙周病根面所包含的各种感染介质、内毒素等致病因子及其根面解剖形态会大大抑制细胞的再附着。
许多研究证实，Nd:YAG激光可以消除手术疼痛，止血，汽化菌斑、牙石和玷污层，灭治根面内毒素，且降低根面的敏感性[4]。以上诸多功能似乎都有利于牙周结缔组织的再附着。然而，Trylovick[5] ,Spencerr[6]等人认为激光照射会使得根面的生物相容性降低，抑制成纤维细胞的附着。Thomas[3]通过傅利叶变换红外光谱系统(FTIR)的研究，显示出在1500～1550cm-1区域，酰胺键的吸收峰强度明显减弱，提示其抑制HGF附着的机理可能是激光引起根面基质蛋白的降解所致。经过实验，认为这种生物相斥性是表层的，可逆的。本研究结果也间接支持了上述观点。激光照射后进行根面平整，可使平整更加容易，利于去除菌斑、牙石[7]，可能同时也去除了根面降解的基质蛋白，这是否就是利于HGF再附着的原因，其“可逆”的机制还需更深入的探讨。
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本实验未能提供Nd:YAG激光能明显抑制HGF附着的证据。其原因可能是考虑到实际临床意义，研究所选用的是患病根片，而不是正常根片。结果显示出单纯激光照射与单纯根面平整对HGF附着的影响相似(P>0.05)。与未处理的患牙根面相比，当激光能量密度为80mj/mm2时，其HGF附着量还是明显增多(P<0.05)。至于激光照射+根面平整，HGF附着数能否达到正常根面的水平，以及HGF附着后的增殖状况如何，还有待于进一步的研究。
(本研究中的组织细胞培养部分承第四军医大学口腔医学院口腔生物教研室吴军正教授，刘斌、陈建元等老师的热情指导及南京医科大学基础医学院动脉粥样硬化研究室王南老师的大力帮助，特此致谢!
*国家重点科技项目(攻关)计划(96-B11-03-04)及江苏省社会发展计划(BS95018)， 江苏省教委青年基金(95049)资助项目
参考文献
, http://www.100md.com
1 Gilman RS, Maxey BR. The effect of root detoxification on human gingival fibroblasts. J Periodontol, 1986, 57:436
2 Lawerence GB, George SS, Michael AB, et al. The effects of intracanal medicaments, fillers, and sealers on the attachment of human gingival fibroblasts to an exposed dentin surface free of a smear layer. J Periodontol, 1995 66:545
3 Thomas D, Rapley I, Cobb C, et al. Effects of the Nd:YAG laser and combined treatment on in vitro fibroblast attachment to root surfaces. J Clin Periodontol 1994, 21:38
, http://www.100md.com
4 李若兰，任煜光，韩捷. 脉冲Nd:YAG激光照射对牙本质通透性的影响. 口腔医学纵横， 1996, 12(4):202
5 Trylovich DJ, Cobb CM, Pippin DJ, et al. The effects of the Nd:YAG laser on in vitro fibroblast attachment to endotoxin-treated root surfaces. J Periodontol, 1992, 63:626
6 Spencer PN, Trylovich DJ, Cobb CM. Chemical characterization of lased root surfaces using fourier transform infrared photoacoustic spectroscopy. J Periodontol, 1992, 63:626
7 陈柯，罗渝宁，任煜光. Nd:YAG激光照射与机械根面平整的比较研究. 广东牙病防治, 1998, 6(4):7
[收稿：1999-06-18 修回：1999-08-22], 百拇医药
单位：江苏省(210029)南京医科大学口腔医学院；(210094)南京理工大学(倪晓武)
关键词：Nd:YAG激光；人牙龈成纤维细胞；根面
口腔医学纵横990404 摘要 目的：为探讨Nd:YAG激光照射对牙周病患牙根面的生物相容性影响。方法：应用体外细胞培养技术，观察激光照射等处理根面的不同方式对人牙龈成纤维细胞(Human gingival fibroblast, HGF)附着的影响。结果：Nd:YAG激光照射+根面平整组，成纤维细胞接种24h后的附着量明显高于单纯Nd:YAG激光照射组和单纯根面平整组(P<0.05)。而单纯激光照射组(80mj/mm2)和单纯根面平整组细胞附着量又明显大于未处理组(P<0.05)。结论：用一定能量密度的Nd:YAG激光照射与根面平整术联合应用可提高HGF在患牙根面上的附着量。
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中图分类号 R781.4
Effects of the Nd:YAG laser and root planing on human
gingival fibroblast attachment to root surfaces.
Zhu Qingping, Sun Weibin, Ni Xiaowu*.
College of Stomatology, Nanjing Medical University, Nanjing, 210029，China. Ni Xiaowu Nanjing
University of Science & Technology, Nanjing, 210094, China
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Abstract Objective：To observe the bioincompatibility of periodontal diseased root surfaces after Nd :YAG laser radiation. Methods： Using cell culture method to observe the effects of laser irradiating and root planing on fibroblast attachment to root surfaces. Results： The numbers of attachment cells has significant differences between the laser/root planing combined treated group and laser-only or root planing-only treated group (P<0.05), and between the laser-only with energy density was 80mj/mm2 or root planing-only treated groups and non-treatment group (P<0.05). When the laser energy density was 80mj/mm2, the mounts of fibroblasts attachment would not change.(P>0.05) Conclusion：Laser/root planing combined treated could enhance fibroblast attachment.
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Key Words Nd:YAG laser Human gingival fibroblast root surfaces
在牙周炎症状态下，暴露在牙周袋内环境中的牙骨质和牙本质发生了一系列变化，从而对牙周结缔组织的附着产生了生物排斥性。如何有效地除去患牙根面致病因素，利于成纤维细胞的附着，实现牙周膜的再生是牙周治疗的根本目的。除目前常用的刮治术，机械或超声根面平整术等，Nd:YAG激光由于其杀菌、去除玷污层，气化牙结石等独特的功能而倍受关注。然而，经过激光照射后的患牙根面的生物相容性有无改善，对成纤维细胞附着的影响如何，这些将是本研究所要探讨的。
材料与方法
一、根面标本制作及分组
在本院外科门诊收集因重度牙周病(牙周袋深>5mm，松动II(以上)拔除的双尖牙20颗，冲净血迹，去除根面残留组织和牙石，在水冷却条件下，用金刚砂外圆切割片先将牙冠齐釉牙骨质界下1mm处截去，再从根的近中切割出约5mm(5mm(1mm大小薄片(根面不作磨除，保留原有形态，作为实验区)，并随机分为下列各组：
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处理一组：单纯机械根面平整。
处理二组：单纯激光照射。脉冲式Nd:YAG激光机(南京理工大学提供)，波长1064nm，重复频率15Hz，能量为0.15W～1W，照射时间10s，能量密度80 mj/mm2。
处理三组：单纯激光照射+根面平整。激光照射同处理一组。照射后立即行常规机械根面平整。
未处理组：根面未作处理，作为对照。
以上各组根片经处理后分别置入配制好的抗菌液中(青霉素100(g/ml，链霉素100(g/ml，酮康唑0.2(g/ml)，冷冻保存备用。
二、牙龈成纤维细胞培养
切取引产胎儿(30周)的牙龈组织，立即投入1640培养液中，在超净工作台内将牙龈组织用加有抗菌素的Hank's液反复漂洗3遍后，剪成约1mm(1mm大小，均匀铺贴在25ml培养瓶的瓶底，加入4ml含10%胎牛血清的1640培养液，反置于CO2孵箱内，2h后翻转培养瓶。第6天见有梭形细胞游出，待细胞铺满大半瓶底，即进行第一次传代，第5～10代细胞用于实验。
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三、实验方法
每组5块根片，分别置入12孔板的4孔内(每孔5块)，加入含有10%胎牛血清的1640培养液2ml，接种HGF，浓度为1.5×105，二氧化碳孵箱内(37°C，5%CO2，95%空气，100%湿度)培养24h后取出根片，温PPS清洗三遍，甲醇—冰醋酸固定10min，0.1%台盼兰染色1min，蒸馏水冲洗三遍，晾干，置解剖显微镜下，通过0.8mm目镜网格计数0.1mm2范围内的根面细胞附着数。为尽量减少误差，每块标本的计数视野区均固定在根片的四个角内的对角线上及中心处，共5个视野，取其均数。所得数据采用SigmaStat统计软件，进行F检验和组间分析。
结 果
附表 处理方式对HGF附着根面的影响(n=5)
组别
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处理方式
细胞附着计数
(
±s)F
P
1
单纯根面平整
14.00±7.84
2
单纯激光照射
22.60±6.11
3
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激光照射+根面平整
37.60±8.02
21.9
<0.0001
4
未处理
5.20±1.79
经单因素方差分析，除单纯根面平整组与单纯激光照射组细胞附着数无明显差异(P>0.05)外，其余各组间细胞附着数均有显著性差异(P<0.05)。
扫描电镜下见：单纯根面平整组(图1)和单纯激光照射组(图2)细胞分布比较均匀，附着密度相似。激光照射+根面平整后(图3)细胞分布均匀，附着数量多。未处理根面组(图4)HGF附着数少于其它三处理组。
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图1 单纯根面平整组HGF附着状况 ×100 图2 单纯激光照射组HGF附着状况 ×100
图3 激光照射+根面平整联合处理组HGF附着状况 ×100 图4 未处理组HGF附着状况 ×100
讨 论
牙周治疗的最终目的是使丧失的牙周结缔组织附着再生。在牙周膜及牙龈韧带纤维与健康根面相连的组织结构中，成纤维细胞是最主要的细胞形式。大多数学者都将成纤维细胞的附着作为观察根面生物相容性的一项主要指征。有关各种根面处理涉及根面病变状态通常都选用成纤维细胞的附着状况来加以评价[1～3]。本实验采用组织块培养法获得体外生长的HGF，将其接种于经不同处理方式预备过的根面上，结果显示用激光照射后再施行根面平整术，24hHGF附着量明显多于单纯激光照射组、单纯根面平整组及未处理组。(P<0.05)，而单纯激光照射或单纯根面平整时，HGF的附着量又明显多于未处理的患牙根面(P<0.05)。由此可以推测，牙周病患者根面，如经过单纯激光照射或单纯根面平整，均较未处理过的根面利于HGF的附着。而激光照射+根面平整联合处理效果更好。
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从扫描电镜(SEM)下观察，HGF在经不同方式处理过的根面上附着后，其形态大多为梭形，少数为近似圆形。尤其在激光照射+根面平整组，细胞分布均匀，生长状况良好，而未处理组，可见根面附着大量牙石、菌斑及病变牙骨质，根面呈凹凸不平，凹陷处未铺展细胞多，生长状况不良。可见，牙周病根面所包含的各种感染介质、内毒素等致病因子及其根面解剖形态会大大抑制细胞的再附着。
许多研究证实，Nd:YAG激光可以消除手术疼痛，止血，汽化菌斑、牙石和玷污层，灭治根面内毒素，且降低根面的敏感性[4]。以上诸多功能似乎都有利于牙周结缔组织的再附着。然而，Trylovick[5] ,Spencerr[6]等人认为激光照射会使得根面的生物相容性降低，抑制成纤维细胞的附着。Thomas[3]通过傅利叶变换红外光谱系统(FTIR)的研究，显示出在1500～1550cm-1区域，酰胺键的吸收峰强度明显减弱，提示其抑制HGF附着的机理可能是激光引起根面基质蛋白的降解所致。经过实验，认为这种生物相斥性是表层的，可逆的。本研究结果也间接支持了上述观点。激光照射后进行根面平整，可使平整更加容易，利于去除菌斑、牙石[7]，可能同时也去除了根面降解的基质蛋白，这是否就是利于HGF再附着的原因，其“可逆”的机制还需更深入的探讨。
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本实验未能提供Nd:YAG激光能明显抑制HGF附着的证据。其原因可能是考虑到实际临床意义，研究所选用的是患病根片，而不是正常根片。结果显示出单纯激光照射与单纯根面平整对HGF附着的影响相似(P>0.05)。与未处理的患牙根面相比，当激光能量密度为80mj/mm2时，其HGF附着量还是明显增多(P<0.05)。至于激光照射+根面平整，HGF附着数能否达到正常根面的水平，以及HGF附着后的增殖状况如何，还有待于进一步的研究。
(本研究中的组织细胞培养部分承第四军医大学口腔医学院口腔生物教研室吴军正教授，刘斌、陈建元等老师的热情指导及南京医科大学基础医学院动脉粥样硬化研究室王南老师的大力帮助，特此致谢!
*国家重点科技项目(攻关)计划(96-B11-03-04)及江苏省社会发展计划(BS95018)， 江苏省教委青年基金(95049)资助项目
参考文献
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1 Gilman RS, Maxey BR. The effect of root detoxification on human gingival fibroblasts. J Periodontol, 1986, 57:436
2 Lawerence GB, George SS, Michael AB, et al. The effects of intracanal medicaments, fillers, and sealers on the attachment of human gingival fibroblasts to an exposed dentin surface free of a smear layer. J Periodontol, 1995 66:545
3 Thomas D, Rapley I, Cobb C, et al. Effects of the Nd:YAG laser and combined treatment on in vitro fibroblast attachment to root surfaces. J Clin Periodontol 1994, 21:38
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4 李若兰，任煜光，韩捷. 脉冲Nd:YAG激光照射对牙本质通透性的影响. 口腔医学纵横， 1996, 12(4):202
5 Trylovich DJ, Cobb CM, Pippin DJ, et al. The effects of the Nd:YAG laser on in vitro fibroblast attachment to endotoxin-treated root surfaces. J Periodontol, 1992, 63:626
6 Spencer PN, Trylovich DJ, Cobb CM. Chemical characterization of lased root surfaces using fourier transform infrared photoacoustic spectroscopy. J Periodontol, 1992, 63:626
7 陈柯，罗渝宁，任煜光. Nd:YAG激光照射与机械根面平整的比较研究. 广东牙病防治, 1998, 6(4):7
[收稿：1999-06-18 修回：1999-08-22], 百拇医药