M235T基因多态性对血压影响的研究
作者：叶琼,吴可贵,谢良地,曾开淇,林经安,林从容
单位：福建省高血压研究所，福建医科大学附属第一医院 福州 350005
关键词：血管紧张素原；M235T等位基因多态性；原发性高血压
高血压杂志990412
摘要 目的:研究血管紧张素原基因(AGT)第二外显子M235T等位基因的多态性与高血压之间的关系。
方法: 应用多聚酶链反应(PCR)结合限制性酶切方法对105例健康体检者与102例原发性高血压(EH)患者进行基因突变的检测。
结果:(1)EH患者T235等位基因频率(0.445)高于对照组(0.323),P<0.05。在男性EH患者与男性对照组中差别更为明显(P<0.01);(2)在有家族史的EH患者中，M235T突变基因型(TT型)频率 高于正常对照组(42.1% VS 18.8%，P<0.05)。
, http://www.100md.com
结论:(1)AGT基因的突变与EH的发病具有相关性。对男性EH影响可能更大;(2)在有家族史的高血压患者中， AGT235的TT基因型与EH有关。
要点：血管紧张素原基因(AGT)第二外显子M235T的多态性研究，TT基因型与T等位基因在高血压患者中占优势，在男性患者中特别突出，在女性中只起间接作用；可能与基因启动子附近的雌激素调控影响有关。
中图分类号：R756;R544.1;Q555 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)04-0317-02
The Influence of M235T Allele Polymorphism on Blood Pressure
YE Qiong,WU Kegui, XIE Liangdi,et al
, 百拇医药
(Institute of Hypertension Research, The 1st Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005)
ABSTRACT Objectives: To study the association between M235T allele polymorphism in exon 2 of angiotensinogen(AGT) gene and essential hypertension(EH).
Methods: Polymerase chain reaction combined with restrict enzyme digestion was used to detect the target gene variation in 105 normotensive controls and 102 hypertensive patients.
, 百拇医药
Results:(1)T235 allele frequency was significantly higher in hypertensive patients than in controls and it was noticeably higher in male hypertensives;(2)Among the EH patients with family history, the frequency of T235 genotype (42.1% vs 18.8%) were higher in EH than in controls.
Conclusion:(1)The M235T allele variation was associated with EH，especially in male;(2)The T235 genotype were associated with EH with family history
Key Words:Angiotensinogen; M235T allele variation; Essential hypertension
, 百拇医药
血压是一种复杂的数量性状，既受环境影响，也受遗传的影响。有20%～40%的血压变异是由遗传决定的[1]。血管紧张素原基因(AGT)由13个kb组成,共包括5个外显子和4个内含子以及第一外显子前端的多个调节片段和启动子的5'侧区[2]。 Jeunemaitre[3]应用同胞配对联锁分析方法,对来自欧美两个不同地区EH人群进行研究,发现AGT位点的突变与EH之间具有相关性。共发现AGT基因有15种多态性。其中三种分子变异与EH密切相关。一种是该基因第二外显子704位核苷酸发生T→C置换,造成第235位蛋氨酸置换为苏氨酸(M235T基因)。一种是第二外显子第174位苏氨酸置换为蛋氨酸。一种是基因下游的GT重复序列的多态性。国内对AGT基因突变与高血压之间的相关性报导甚少，本文重点研究中国人群中M235T基因的多态性与EH之间的关联性。
NATERIALS AND METHODS
1 研究对象：
, 百拇医药
1.1 正常对照组：105例,来自健康体检人群,按照1998年WHO/ISH诊断标准,收缩压<140 mmHg, 舒张压<90 mmHg, 家族中一级亲属没有EH病史，排除糖尿病及其它心血管系统疾病。
1.2 原发性EH患者：102例，来自住院及门诊患者,按照WHO/ISH诊断标准，收缩压≥140 mmHg, 舒张压≥90 mmHg, 空腹血糖<6.4 mmol/L, 排除心肌梗塞、心肌病、继发性高血压。有家族史高血压定义为父母中有一方或者同胞兄弟姐妹中至少有一位患高血压病。
2 方法:
2.1 基因组DNA的提取：经ACD抗凝的全血4ml用饱和盐析法常规提取DNA[4]。
2.2 PCR扩增：PCR引物序列[5]:引物1 5'-CGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTC-3',引物2 5'-AGGGTGCTGTCCACACTGGACCC-3’
, 百拇医药
反应总体积为30 μl包含100 ng基因组DNA，20 pmol引物,200 μmol/L dNTP,1.5 mmol/L MgCl2,50 mmol/L KCl, 1 U Taq酶，采用PE-9600扩增仪进行扩增反应，设置预变性93℃ 3分钟，93℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30 秒，10个循环，90℃ 30秒，55℃30 秒，72℃ 30秒，20个循环，最后72℃延伸10分钟。
2.3 限制性内切酶消化：将PCR产物5μl稀释于10 μl含6 U Tth111-Ⅰ内切酶缓冲液中。65℃3小时酶切，2.5%琼脂凝胶电泳，紫外检测仪下观察。
2.4 统计：用SPSS统计软件处理数据,两组频数分布采用χ2检验, 三组均数进行ANOVA检验,数据结果用均数±标准差表示
RESULTS
, 百拇医药
1 对AGT基因多态性比较(表1):PCR扩增产物为163 bP的DNA片段。经Tth111-I内切酶消化后，产生140 bp片段。若两个等位基因均含内切酶识别位点，酶切后只产生140 bp定为TT型。酶切后产生两个片段(163 bp和140 bp)定为MT型，不被酶切定为MM型(图1)。
Fig 1 The genotypes of AGT gene digested by enzyme Tth111-I
1: heterozygote; 2:variation homozygote; 3：unvariation homozygoteM:small molecular weight DNA marker(100～498 bp)
M235基因型频率及等位基因频率在三组中分布见表1, 基因型频率分布在两组之间并无差别，等位基因频率EH组高于正常组(0.446 vs 0.323，P<0.05)。在有家族史高血压患者中，不仅T等位基因频率在两组之间有差别(0.50 vs 0.323,P<0.05)，TT基因型也比对照组高(0.421 vs 0.188 P<0.05)
, 百拇医药
Tab 1 Comparison of genotype and allele frequency of AGT gene
Genotype frequeny
Allele frequeny
MM
MT
TT
M
T
对照(n=105)
57(0.54)
28(0.27)
, http://www.100md.com
20(0.19)
142(0.68)
68(0.32)
EH(n=102)
42(0.41)
29(0.28)
31(0.31)
113(0.55)
91(0.45)*
FH(n=48)
20(0.42)
8(0.16)
, 百拇医药
20(0.42)*
24(0.50)
24(0.50)*
*:P<0.05 vs controls; C:control; EH:hpertension; FH:Familial hypertension
2 按照性别分类后，AGT等位基因频率的对比在男性中T235等位基因频率在EH组(0.48)显著高于正常组(0.29)，P<0.01，在女性，两组之间等位基因频率并无差别(表2)
Tab 2 Comparison of genotype and allele frequency of AGT gene by sex
Male
, 百拇医药
Female
Control
EH
Control
EH
n
60
62
45
40
M235
85(0.71)
64(0.52)
, http://www.100md.com
56(0.62)
54(0.68)
T235
35(0.29)
60(0.48)*
34(0.38)
27(0.32)
*:P<0.01 Male HT T235 vs female HT T235
DISCUSSION
肾素血管紧张素系统(RAS)在维持水盐平衡和血管张力方面起着重要作用。该系统在钠摄入水平正常时控制血浆醛固酮的浓度,对正常血压的维持及EH的发生都起着重要的作用[6]。在高血压大鼠中注射AGT反义核苷酸引起血浆AGT浓度下降，继而引起血压下降，而在正常血压的大鼠中注射AGT反义寡核苷酸，注射后1～4天，出现短暂血压下降，并伴随出现血浆AGT浓度与肝脏AGTmRNA水平下降[7]，上述证据表明在大鼠血压调控中AGT基因起着至关重要作用。人类血管紧张素原分子变异的发现,使人们对AGT基因在EH发病中的意义有了进一步的了解。血管紧张素原作为血管紧张素肽类的细胞外储备,其浓度变化限制RAS的转化速度,在这一系统中占有重要地位。
, http://www.100md.com
目前一般认为EH是多基因遗传性疾病,遗传和环境因素共同参与EH的发病过程。而在大量EH家系调查中发现父母患病时其子女的患病率与单基因遗传规律所得的理论预期值吻合[8]。该理论的最有力证据在于确证EH的相关基因。目前对高血压基因的研究是个热点，AGT基因与高血压之间的关系，国内未见系统报导。本研究为课题系列研究之一，采用多聚酶链反应结合限制性酶切方法检测AGT基因 突变，结果发现血管紧张素原T235等位基因频率在正常人群为0.323,不同于日本人群与欧美人群的频率分布[3,10，12,15],说明AGT235多态位点在不同种族不同地区分布特点不同。T235等位基因频率在EH组中明显高于对照组,提示在中国人群中AGTM235T基因突变与EH发生具有相关性,但基因型频率在两组之间并无显著性差别, 这可能是由于M235T等位基因共显性效应, MT基因型与TT基因型所表现的性状难以区别。而有家族史EH患者基因型频率比正常对照组高可能与遗传易感性增高有关。本实验结果表明，按照性别分组后，男性EH患者M235T基因突变频率显著高于正常对照组，而在女性EH患者中M235T基因突变频率与正常对照组之间没有差别。因此我们推论AGT直接对男性存在EH危险，而对女性起间接作用，因为AGT基因启动子5’侧区的雌激素调控因子可能调节与AGT相关的EH易感性。
, 百拇医药
在EH同胞中进行配对连锁分析[3,4],表明M235T基因突变与EH密切相关。对遗传分离人群[11];有EH家族史患者[12];老年性EH[13]特殊人群的研究均发现AGT位点的突变与EH相关。而对普通人群研究也得出相似结论[14,15]。但目前尚不能肯定AGT基因为EH的关键基因。由于人类在血统上是异源性,且盐摄入、肥胖、饮洒、抽烟等许多因素都能影响血压, 基因对血压的影响不遵守简单的孟德尔遗传模型。此外不同人种基因分布频率不同，各个不同研究中选择病人的标准不同，样本代表不全，存在选择偏倚，也影响结果。未来的研究应着眼于寻找和发现新的遗传标记物以筛选与EH发病相关的基因, 这将有助于揭开高血压病的分子遗传机制，从而为以后的基因治疗奠定坚定的基础。
福建省科委资助项目(98A061)
REFERENCES
, 百拇医药
1 Ward R.: Familial aggregation and genetic epidemiology of blood pressure[M] in:Laragh JH, Brenner BM, eds.Hypertension: pathophysiology, diagnosis and management. Vol 1.New York:Raven press 1990:81-100
2 Gaillard I,Clauser E,Corvol p: Structure of human angiotensinogen gene.[J] DNA 1989;8:87-99
3.Jeunemaitre X,Soubrier F,Kotelevtsev YV,et al:Molecular basis of human hypertension:Role of angiotensinogen [J] Cell 1992;71:169-180
, 百拇医药
4 萨姆布鲁克J,弗生奇EF,曼尼阿蒂斯T(主编).分子克隆指南[M] 第二版 北京:科学出版社1995:465-467
5 Ishigami T,Umemura S,Iwamoto T,et al:Molecular variant of angiotensinogen gene is associated with coronary atherosclerosis [J] Circulation 1995:91:951-4
6 Macgregor GA,Markandu ND,Roulston JE,et al:Maitenance of blood pressure by the renin-angiotensin system in normal man[J] Nature 1981;291:329-31
7 Tomita N,Morishita R,Higaki: Effect of angiotensinogen on blood pressure regulation in normotensive rats :application of a loss of function approach[J] Journal of Hypertens 1995:13:1767-1774
, 百拇医药
8 孙德成,洪思存，崔艳芝等:EH病遗传方式的研究[J] 中华心血管病杂志 1989;17:333
9 Hata A,Namikawa C,Sasaki M,etal:Angiotensinogen as a risk factor for essential hypertension in Japan[J] J Clin Invest 1994;93:1285-87
10.Hegele RA,Brunt JH,Connelly PW:A polymorphism of the angiotensinogen gene associated with variation in blood pressure in a genetic isolate[J] Circulation 1994;90:2207-2212
11 Caulfield M,Lavender P,Newell PJ,et al:Linkage of the angiotensinogen gene locus to human essential hypertension in African caribbeans[J] J Clin Invest 1995;96:687-92
, 百拇医药
12 Johnson AG,Simons LA,Fried LY,et al:M235T polymorphism of the angiotensinogen gene predicts hypertension in the elderly[J] J of hypertens 1996;14:1061-65
13 Tiret L,Ricard S,Poirier O,et al:Genetic variation at the angiotensinogen locus in relation to high blood pressure and myocardial in farction: the ECTIM study[J] J of hypertens 1995:13:311-317
14 Morise T,Takeuchi Y,Takeda R:Rapid detection and prevalence of the variants of the angiotensinogen gene in patients with essential hypertension[J] J of Intern Medicine 1995;237:175-180
15 Fornage M, Turner ST, Sing CF: Variation at the M235T locus of the angiotensinogengene and essential hypertension[J]Hum Genet1995;96:295-300
收稿日期：1998-09-20, 百拇医药
单位：福建省高血压研究所，福建医科大学附属第一医院 福州 350005
关键词：血管紧张素原；M235T等位基因多态性；原发性高血压
高血压杂志990412
摘要 目的:研究血管紧张素原基因(AGT)第二外显子M235T等位基因的多态性与高血压之间的关系。
方法: 应用多聚酶链反应(PCR)结合限制性酶切方法对105例健康体检者与102例原发性高血压(EH)患者进行基因突变的检测。
结果:(1)EH患者T235等位基因频率(0.445)高于对照组(0.323),P<0.05。在男性EH患者与男性对照组中差别更为明显(P<0.01);(2)在有家族史的EH患者中，M235T突变基因型(TT型)频率 高于正常对照组(42.1% VS 18.8%，P<0.05)。
, http://www.100md.com
结论:(1)AGT基因的突变与EH的发病具有相关性。对男性EH影响可能更大;(2)在有家族史的高血压患者中， AGT235的TT基因型与EH有关。
要点：血管紧张素原基因(AGT)第二外显子M235T的多态性研究，TT基因型与T等位基因在高血压患者中占优势，在男性患者中特别突出，在女性中只起间接作用；可能与基因启动子附近的雌激素调控影响有关。
中图分类号：R756;R544.1;Q555 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)04-0317-02
The Influence of M235T Allele Polymorphism on Blood Pressure
YE Qiong,WU Kegui, XIE Liangdi,et al
, 百拇医药
(Institute of Hypertension Research, The 1st Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005)
ABSTRACT Objectives: To study the association between M235T allele polymorphism in exon 2 of angiotensinogen(AGT) gene and essential hypertension(EH).
Methods: Polymerase chain reaction combined with restrict enzyme digestion was used to detect the target gene variation in 105 normotensive controls and 102 hypertensive patients.
, 百拇医药
Results:(1)T235 allele frequency was significantly higher in hypertensive patients than in controls and it was noticeably higher in male hypertensives;(2)Among the EH patients with family history, the frequency of T235 genotype (42.1% vs 18.8%) were higher in EH than in controls.
Conclusion:(1)The M235T allele variation was associated with EH，especially in male;(2)The T235 genotype were associated with EH with family history
Key Words:Angiotensinogen; M235T allele variation; Essential hypertension
, 百拇医药
血压是一种复杂的数量性状，既受环境影响，也受遗传的影响。有20%～40%的血压变异是由遗传决定的[1]。血管紧张素原基因(AGT)由13个kb组成,共包括5个外显子和4个内含子以及第一外显子前端的多个调节片段和启动子的5'侧区[2]。 Jeunemaitre[3]应用同胞配对联锁分析方法,对来自欧美两个不同地区EH人群进行研究,发现AGT位点的突变与EH之间具有相关性。共发现AGT基因有15种多态性。其中三种分子变异与EH密切相关。一种是该基因第二外显子704位核苷酸发生T→C置换,造成第235位蛋氨酸置换为苏氨酸(M235T基因)。一种是第二外显子第174位苏氨酸置换为蛋氨酸。一种是基因下游的GT重复序列的多态性。国内对AGT基因突变与高血压之间的相关性报导甚少，本文重点研究中国人群中M235T基因的多态性与EH之间的关联性。
NATERIALS AND METHODS
1 研究对象：
, 百拇医药
1.1 正常对照组：105例,来自健康体检人群,按照1998年WHO/ISH诊断标准,收缩压<140 mmHg, 舒张压<90 mmHg, 家族中一级亲属没有EH病史，排除糖尿病及其它心血管系统疾病。
1.2 原发性EH患者：102例，来自住院及门诊患者,按照WHO/ISH诊断标准，收缩压≥140 mmHg, 舒张压≥90 mmHg, 空腹血糖<6.4 mmol/L, 排除心肌梗塞、心肌病、继发性高血压。有家族史高血压定义为父母中有一方或者同胞兄弟姐妹中至少有一位患高血压病。
2 方法:
2.1 基因组DNA的提取：经ACD抗凝的全血4ml用饱和盐析法常规提取DNA[4]。
2.2 PCR扩增：PCR引物序列[5]:引物1 5'-CGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTC-3',引物2 5'-AGGGTGCTGTCCACACTGGACCC-3’
, 百拇医药
反应总体积为30 μl包含100 ng基因组DNA，20 pmol引物,200 μmol/L dNTP,1.5 mmol/L MgCl2,50 mmol/L KCl, 1 U Taq酶，采用PE-9600扩增仪进行扩增反应，设置预变性93℃ 3分钟，93℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30 秒，10个循环，90℃ 30秒，55℃30 秒，72℃ 30秒，20个循环，最后72℃延伸10分钟。
2.3 限制性内切酶消化：将PCR产物5μl稀释于10 μl含6 U Tth111-Ⅰ内切酶缓冲液中。65℃3小时酶切，2.5%琼脂凝胶电泳，紫外检测仪下观察。
2.4 统计：用SPSS统计软件处理数据,两组频数分布采用χ2检验, 三组均数进行ANOVA检验,数据结果用均数±标准差表示
RESULTS
, 百拇医药
1 对AGT基因多态性比较(表1):PCR扩增产物为163 bP的DNA片段。经Tth111-I内切酶消化后，产生140 bp片段。若两个等位基因均含内切酶识别位点，酶切后只产生140 bp定为TT型。酶切后产生两个片段(163 bp和140 bp)定为MT型，不被酶切定为MM型(图1)。
Fig 1 The genotypes of AGT gene digested by enzyme Tth111-I
1: heterozygote; 2:variation homozygote; 3：unvariation homozygoteM:small molecular weight DNA marker(100～498 bp)
M235基因型频率及等位基因频率在三组中分布见表1, 基因型频率分布在两组之间并无差别，等位基因频率EH组高于正常组(0.446 vs 0.323，P<0.05)。在有家族史高血压患者中，不仅T等位基因频率在两组之间有差别(0.50 vs 0.323,P<0.05)，TT基因型也比对照组高(0.421 vs 0.188 P<0.05)
, 百拇医药
Tab 1 Comparison of genotype and allele frequency of AGT gene
Genotype frequeny
Allele frequeny
MM
MT
TT
M
T
对照(n=105)
57(0.54)
28(0.27)
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20(0.19)
142(0.68)
68(0.32)
EH(n=102)
42(0.41)
29(0.28)
31(0.31)
113(0.55)
91(0.45)*
FH(n=48)
20(0.42)
8(0.16)
, 百拇医药
20(0.42)*
24(0.50)
24(0.50)*
*:P<0.05 vs controls; C:control; EH:hpertension; FH:Familial hypertension
2 按照性别分类后，AGT等位基因频率的对比在男性中T235等位基因频率在EH组(0.48)显著高于正常组(0.29)，P<0.01，在女性，两组之间等位基因频率并无差别(表2)
Tab 2 Comparison of genotype and allele frequency of AGT gene by sex
Male
, 百拇医药
Female
Control
EH
Control
EH
n
60
62
45
40
M235
85(0.71)
64(0.52)
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56(0.62)
54(0.68)
T235
35(0.29)
60(0.48)*
34(0.38)
27(0.32)
*:P<0.01 Male HT T235 vs female HT T235
DISCUSSION
肾素血管紧张素系统(RAS)在维持水盐平衡和血管张力方面起着重要作用。该系统在钠摄入水平正常时控制血浆醛固酮的浓度,对正常血压的维持及EH的发生都起着重要的作用[6]。在高血压大鼠中注射AGT反义核苷酸引起血浆AGT浓度下降，继而引起血压下降，而在正常血压的大鼠中注射AGT反义寡核苷酸，注射后1～4天，出现短暂血压下降，并伴随出现血浆AGT浓度与肝脏AGTmRNA水平下降[7]，上述证据表明在大鼠血压调控中AGT基因起着至关重要作用。人类血管紧张素原分子变异的发现,使人们对AGT基因在EH发病中的意义有了进一步的了解。血管紧张素原作为血管紧张素肽类的细胞外储备,其浓度变化限制RAS的转化速度,在这一系统中占有重要地位。
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目前一般认为EH是多基因遗传性疾病,遗传和环境因素共同参与EH的发病过程。而在大量EH家系调查中发现父母患病时其子女的患病率与单基因遗传规律所得的理论预期值吻合[8]。该理论的最有力证据在于确证EH的相关基因。目前对高血压基因的研究是个热点，AGT基因与高血压之间的关系，国内未见系统报导。本研究为课题系列研究之一，采用多聚酶链反应结合限制性酶切方法检测AGT基因 突变，结果发现血管紧张素原T235等位基因频率在正常人群为0.323,不同于日本人群与欧美人群的频率分布[3,10，12,15],说明AGT235多态位点在不同种族不同地区分布特点不同。T235等位基因频率在EH组中明显高于对照组,提示在中国人群中AGTM235T基因突变与EH发生具有相关性,但基因型频率在两组之间并无显著性差别, 这可能是由于M235T等位基因共显性效应, MT基因型与TT基因型所表现的性状难以区别。而有家族史EH患者基因型频率比正常对照组高可能与遗传易感性增高有关。本实验结果表明，按照性别分组后，男性EH患者M235T基因突变频率显著高于正常对照组，而在女性EH患者中M235T基因突变频率与正常对照组之间没有差别。因此我们推论AGT直接对男性存在EH危险，而对女性起间接作用，因为AGT基因启动子5’侧区的雌激素调控因子可能调节与AGT相关的EH易感性。
, 百拇医药
在EH同胞中进行配对连锁分析[3,4],表明M235T基因突变与EH密切相关。对遗传分离人群[11];有EH家族史患者[12];老年性EH[13]特殊人群的研究均发现AGT位点的突变与EH相关。而对普通人群研究也得出相似结论[14,15]。但目前尚不能肯定AGT基因为EH的关键基因。由于人类在血统上是异源性,且盐摄入、肥胖、饮洒、抽烟等许多因素都能影响血压, 基因对血压的影响不遵守简单的孟德尔遗传模型。此外不同人种基因分布频率不同，各个不同研究中选择病人的标准不同，样本代表不全，存在选择偏倚，也影响结果。未来的研究应着眼于寻找和发现新的遗传标记物以筛选与EH发病相关的基因, 这将有助于揭开高血压病的分子遗传机制，从而为以后的基因治疗奠定坚定的基础。
福建省科委资助项目(98A061)
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, 百拇医药
1 Ward R.: Familial aggregation and genetic epidemiology of blood pressure[M] in:Laragh JH, Brenner BM, eds.Hypertension: pathophysiology, diagnosis and management. Vol 1.New York:Raven press 1990:81-100
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收稿日期：1998-09-20, 百拇医药