100例重庆市汉族儿童哮喘α1-抗糜蛋白酶基因突变初探
作者：尹晓娟 李为明 魏红光 光丽霞 奚敏 崔凤文 艾有萍 刘晓蓉 姚俐
单位：尹晓娟(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)；李为明(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)；魏红光(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)；光丽霞(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)
关键词：儿童哮喘；α1-抗糜蛋白酶；基因突变；聚合酶链反应
第三军医大学学报000112
提要 目的：了解儿童哮喘α1-抗糜蛋白酶(α1-antichymotrypsin,α1-ACT)基因点突变情况。方法：应用聚合酶链反应(PCR)和限制性酶切图谱分析技术，对100例重庆市汉族儿童哮喘α1-ACT基因外显子(exon)Ⅱ和Ⅲ进行检测。结果：所有研究对象均未发现Bonn-1及Bochum-1变异体。结论：Bonn-1和Bochum-1变异体与100例重庆市汉族儿童哮喘发病无平行关系。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R394.2;R725.622.5 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)01-0039-03
Gene analysis of α1-antichymotrypsin hereditary deficiency among 100 Han asthmatic children in Chongqing
YIN Xiao-juan,LI Wei-ming,WEI Hong-guang,GUANG Li-xia,XI Min,CUI Feng-wen,AI You-ping,LIU Xiao-rong,YAO Li
(Department of Pediatrics,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400037)
, 百拇医药
Abstract Objective:To understand the situation of α1-antichymotrypsin gene point mutations of childhood asthma.Methods:One hundred patients with childhood asthma and 100 normal controls were tested for gene analysis of exon II and exon III of α1-antichymotrypsin by PCR and restriction endonuclease mapping.Results:Molecular structural abnormality of the genes was found in all the subjects.Conclusion:There is no parallel relationship between variants including Bonn-1 and Bochum-1 and 100 han asthmatic children in Chongqing.
, 百拇医药
Key words childhood asthma;α 1-antichymotrypsin;gene mutation;PCR
哮喘发病具有明显的遗传倾向，为一种多基因遗传病，遗传度为70%～80%。哮喘病因呈现多因性和异质性，并由不同的遗传机制控制。瑞典学者Lindmark等[1]通过测定血浆α1-ACT含量，发现α1-ACT遗传缺失是哮喘发病的重要因素，另有学者通过基因分析发现α1-ACT基因exonⅢ存在点突变Pro229→A1a(CCT→GCT)，称Boon-1突变型[2]；exonⅡ存在点突变Leu55→Pro(CTG→CCG)，称Bochum-1突变型[2]。为探讨Bonn-1和Bochum-1变异体与中国儿童哮喘发病的关系，我们设计了两对特异性引物，应用聚合酶链反应(PCR)分别扩增含上述位点的两段DNA序列，然后通过限制性酶切技术对100例重庆市汉族儿童哮喘α1-ACT基因中编码第229位脯氨酸和第55位亮氨酸的基因序列进行了检测，现将研究结果报道如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 研究对象及样本的选择
按1992年10月全国儿科哮喘协作组制定的《儿童哮喘诊断标准》在重庆市选择彼此无关的汉族哮喘儿童100例作为哮喘组，年龄为0.25～12.75(6.2±4.1)岁，男女之比60∶40；并选择彼此无关的健康儿童100例作为对照组，年龄0.04～13.2(6.2±4.0)岁，男女之比为60∶40。所有研究对象肝功能正常，对照组排除有遗传及遗传倾向者。采静脉血后用酸性柠檬酸葡萄糖溶液(ACD)抗凝，-20℃保存备用。
1.2 主要试剂
蛋白酶K、TaqDNA聚合酶、4种脱氧核苷酸、DNA分子量标记物、限制性内切酶A1uⅠ、DdeⅠ等均购自宝灵曼公司。筛查α1-ACT exonⅡ和Ⅲ基因相应点突变的引物均由军事医学科学院合成。探测基因exonⅢPro229→A1a(CCT→GCT)点突变引物序列为：
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引物1：5′-TATGAGGACTCTGGGCACTTC-3′
引物2：5′-ACTCCAGAGAGTCTCTCCAC-3′
探测基因exonⅡLeu55→Pro(CTG→CCG)点突变引物序列为：
引物3：5′-TCCATCTGGCCCTCTGAGACT-3′
引物4：5′-CTCTACAGTGGTTTGCCTAATAAC-3′
1.3 方法
1.3.1 DNA抽提 每个样本采2.5ml抗凝静脉血，经裂解、蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，用TE溶解提取DNA。
1.3.2 PCR扩增 0.5～1μg样本DNA加入100μl标准反应体系中(10mmol/L Tris-HCl,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dATP、dGTP、dCTP、dTTP，1.0μmol/L，2～5U TaqDNA聚合酶)，置PCR循环仪上扩增，循环参数：95℃变性5min；94℃60s，56℃50s，72℃60s，循环30周期；72℃延伸10min。
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1.3.3 限制性片段长度多态性(RFLP)检测 每个样本取10μl扩增产物加入20μl标准反应体系中，再加入相应的内切酶(引物1、2扩增物加5U A1u Ⅰ酶切，引物3、4扩增物加5U Dde Ⅰ酶切)，37℃消化3～4h，酶切产物用8%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳检测。
1.3.4 限制性片段长度多态性分析标准 引物1、2扩增产物为366bp，用A1uⅠ进行酶切，正常产生227bp、118bp、21bp3个DNA片段，而Bonn-1变异体则产生207bp、118bp、21bp和20bp4个DNA片段，其中227bp是否出现207bp和20bp两个DNA片段是检测的关键；引物3、4扩增产物为788bp，用DdeⅠ进行酶切，正常产生268bp、154bp、100bp、77bp、71bp、57bp、36bp、14bp和11bp9个DNA片段，而Bochum-1变异体则产生368bp、154bp、77bp、71bp、57bp、36bp、14bp和11bp8个DNA片段，其中是否出现368bpDNA片段是检测的关键。
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2 结果
我们通过PCR和限制性酶切图谱分析技术对100例哮喘儿童和100例正常儿童α1-ACT基因exonⅡ和Ⅲ分别进行检测，图1、2为检测疾病组基因突变示意图。图1为引物1、2扩增产物及其酶切产物分析图，酶切后产生227bp DNA片段，未见207bp和20bpDNA片段；图2为引物3、4扩增产物及其酶切产物分析图，酶切后未见368 bp DNA片段。哮喘组与对照组儿童酶切产物电泳带均与图1、2相同，即100例哮喘儿童和100例正常儿童均未发现Bonn-1和Bochum-1突变体。
图1 α1-ACT基因exon Ⅲ RFLP分析
Fig1 RFLP analysis of exon Ⅲ of α1-ACT gene
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M:Marker(25 bp DNA ladder);1:Amplified band;
2:Cut band by restriction endonuclease
图2 α1-ACT基因exon Ⅱ RFLP分析
Fig1 RFLP analysis of exon Ⅱ of α1-ACT gene
M1:Marker(25 bp DNA ladder);M2:PCR Marker;1:Cut
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band by restriction endonuclease;2:Amplified band
3 讨论
国外学者采用基因测序分析方法发现Bonn-1和Bochum-1变异体与慢性阻塞性肺病发病有关[2]，同时发现人血浆α1-ACT含量的下降与慢性阻塞性肺病、慢性肝病及支气管哮喘相关联[1～4]。我们通过火箭电泳技术对重庆市100例汉族儿童哮喘血浆α1-ACT含量进行测定，发现α1-ACT杂合缺失与儿童哮喘存在一定的联系，并进一步对这些研究对象进行基因分析。我们采用引物1、2将α1-ACT exon Ⅲ第54位至第419位的基因序列扩增出来，总长度366bp。在扩增出的366bp片段中，正常情况下，A1uⅠ酶有两个酶切位点，当用A1uⅠ酶进行酶切时，产生227bp、21bp及118bp3个DNA片段；如果编码第229位的脯氨酸的'CCT'突变为编码丙氨酸的'GCT'时，则增加了一个A1uⅠ酶酶切位点，酶切时将227bp又切成207bp和20bp2个DNA片段，于是，酶切后产生207bp、118bp、21bp及20bp4个DNA片段。我们采用引物3、4将α1-ACTexonⅡ第33位至第820位的基因序列扩增出来，总长度788bp。在扩增出的788bp片段中，正常情况下，DdeⅠ酶有8个酶切位点，当用DdeⅠ酶进行酶切时，产生268bp、154bp、100bp、77bp、71bp、57bp、36bp、14bp及11bp9个DNA片段；如果编码第55位亮氨酸的碱基序列'CTG'突变为编码脯氨酸的碱基序列'CCG'时，则该部位DdeⅠ酶的酶切位点消失，于是，酶切后产生368bp、154bp、77bp、71bp、57bp、36bp、14bp及11bp8个片段。本研究没有发现Bonn-1和Bochum-1变异体所具有的特征性DNA片段，此结果表明Bonn-1和Bochum-1变异体与100例重庆市汉族儿童哮喘发病无平行关系。
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本研究虽然没有发现Bonn-1和Bochum-1变异体，但不能说α1-ACT基因突变与中国儿童哮喘发病无关。首先，本研究仅仅筛查了α1-ACT基因exonⅡ上编码其第55位亮氨酸和exonⅢ上编码其第229位脯氨酸的基因序列的两个位点的点突变情况，而没有检测exonⅠ、exonⅣ、exonⅤ以及exonⅡ和exonⅢ的其它位点。其次，种族差异、研究群体、地理环境及疾病种类均影响基因的分布排列。我国幅源辽阔，南北地理环境差异很大，又是多民族国家，本研究仅仅局限于重庆市的100例汉族儿童。所以，尽管没有发现相应的变异体，但结合前期研究结果来看，本研究仍然具有不可忽视的意义。
本研究在重庆市100例汉族儿童哮喘中对α1-ACT基因突变进行了初步探讨，为在中国人群中进一步研究α1-ACT打下了基础。要想更多地了解α1-ACT遗传缺陷与中国儿童哮喘发病的关系则需要在国内不同的民族、不同的地区广泛进行α1-ACT的研究。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570749)
作者简介：尹晓娟(1969.4)，女，湖南省邵阳市人，硕士，主治医师，讲师，主要从事α-抗糜蛋白酶遗传缺陷在中国人发病中的作用方面的研究，发表论文4篇。电话：(023)68755602
作者单位：奚敏(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)
崔凤文(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)
艾有萍(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)
刘晓蓉(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)
姚俐(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)
, 百拇医药
参考文献
[1]Lindmark B,Svenonius E,Eriksson S.Heterozygous α1-antichymotrypsin and Piz α1-antitrypsin Deficiency[J].Allergy,1990,45(3):197-203.
[2]Poller W,Faber J P,Weidinger S,et al.A leucine-toproline substitution cause a defective α1-antichymotrypsin allele associated with familial obstructive lung disease[J].Genomics,1993,17(3):740-743.
[3]Lindmark B.Asthma and heterozygous α1-anchymotrypsin deficiency:a posisible association[J].J Internal Med-icine,1990,227(2):115-118.
[4]Elzouki A N,Verbaan H,Lindgren S,et al.Serine protease inhitors in patients with chronic viral hepatitis[J].J Hepatol,1997,27(1):42-48.
收稿日期：1999-04-05
修回日期：1999-10-15, 百拇医药
单位：尹晓娟(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)；李为明(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)；魏红光(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)；光丽霞(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)
关键词：儿童哮喘；α1-抗糜蛋白酶；基因突变；聚合酶链反应
第三军医大学学报000112
提要 目的：了解儿童哮喘α1-抗糜蛋白酶(α1-antichymotrypsin,α1-ACT)基因点突变情况。方法：应用聚合酶链反应(PCR)和限制性酶切图谱分析技术，对100例重庆市汉族儿童哮喘α1-ACT基因外显子(exon)Ⅱ和Ⅲ进行检测。结果：所有研究对象均未发现Bonn-1及Bochum-1变异体。结论：Bonn-1和Bochum-1变异体与100例重庆市汉族儿童哮喘发病无平行关系。
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中图法分类号 R394.2;R725.622.5 文献标识码 A
文章编号：1000-5404(2000)01-0039-03
Gene analysis of α1-antichymotrypsin hereditary deficiency among 100 Han asthmatic children in Chongqing
YIN Xiao-juan,LI Wei-ming,WEI Hong-guang,GUANG Li-xia,XI Min,CUI Feng-wen,AI You-ping,LIU Xiao-rong,YAO Li
(Department of Pediatrics,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400037)
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Abstract Objective:To understand the situation of α1-antichymotrypsin gene point mutations of childhood asthma.Methods:One hundred patients with childhood asthma and 100 normal controls were tested for gene analysis of exon II and exon III of α1-antichymotrypsin by PCR and restriction endonuclease mapping.Results:Molecular structural abnormality of the genes was found in all the subjects.Conclusion:There is no parallel relationship between variants including Bonn-1 and Bochum-1 and 100 han asthmatic children in Chongqing.
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Key words childhood asthma;α 1-antichymotrypsin;gene mutation;PCR
哮喘发病具有明显的遗传倾向，为一种多基因遗传病，遗传度为70%～80%。哮喘病因呈现多因性和异质性，并由不同的遗传机制控制。瑞典学者Lindmark等[1]通过测定血浆α1-ACT含量，发现α1-ACT遗传缺失是哮喘发病的重要因素，另有学者通过基因分析发现α1-ACT基因exonⅢ存在点突变Pro229→A1a(CCT→GCT)，称Boon-1突变型[2]；exonⅡ存在点突变Leu55→Pro(CTG→CCG)，称Bochum-1突变型[2]。为探讨Bonn-1和Bochum-1变异体与中国儿童哮喘发病的关系，我们设计了两对特异性引物，应用聚合酶链反应(PCR)分别扩增含上述位点的两段DNA序列，然后通过限制性酶切技术对100例重庆市汉族儿童哮喘α1-ACT基因中编码第229位脯氨酸和第55位亮氨酸的基因序列进行了检测，现将研究结果报道如下。
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1 材料与方法
1.1 研究对象及样本的选择
按1992年10月全国儿科哮喘协作组制定的《儿童哮喘诊断标准》在重庆市选择彼此无关的汉族哮喘儿童100例作为哮喘组，年龄为0.25～12.75(6.2±4.1)岁，男女之比60∶40；并选择彼此无关的健康儿童100例作为对照组，年龄0.04～13.2(6.2±4.0)岁，男女之比为60∶40。所有研究对象肝功能正常，对照组排除有遗传及遗传倾向者。采静脉血后用酸性柠檬酸葡萄糖溶液(ACD)抗凝，-20℃保存备用。
1.2 主要试剂
蛋白酶K、TaqDNA聚合酶、4种脱氧核苷酸、DNA分子量标记物、限制性内切酶A1uⅠ、DdeⅠ等均购自宝灵曼公司。筛查α1-ACT exonⅡ和Ⅲ基因相应点突变的引物均由军事医学科学院合成。探测基因exonⅢPro229→A1a(CCT→GCT)点突变引物序列为：
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引物1：5′-TATGAGGACTCTGGGCACTTC-3′
引物2：5′-ACTCCAGAGAGTCTCTCCAC-3′
探测基因exonⅡLeu55→Pro(CTG→CCG)点突变引物序列为：
引物3：5′-TCCATCTGGCCCTCTGAGACT-3′
引物4：5′-CTCTACAGTGGTTTGCCTAATAAC-3′
1.3 方法
1.3.1 DNA抽提 每个样本采2.5ml抗凝静脉血，经裂解、蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，用TE溶解提取DNA。
1.3.2 PCR扩增 0.5～1μg样本DNA加入100μl标准反应体系中(10mmol/L Tris-HCl,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dATP、dGTP、dCTP、dTTP，1.0μmol/L，2～5U TaqDNA聚合酶)，置PCR循环仪上扩增，循环参数：95℃变性5min；94℃60s，56℃50s，72℃60s，循环30周期；72℃延伸10min。
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1.3.3 限制性片段长度多态性(RFLP)检测 每个样本取10μl扩增产物加入20μl标准反应体系中，再加入相应的内切酶(引物1、2扩增物加5U A1u Ⅰ酶切，引物3、4扩增物加5U Dde Ⅰ酶切)，37℃消化3～4h，酶切产物用8%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳检测。
1.3.4 限制性片段长度多态性分析标准 引物1、2扩增产物为366bp，用A1uⅠ进行酶切，正常产生227bp、118bp、21bp3个DNA片段，而Bonn-1变异体则产生207bp、118bp、21bp和20bp4个DNA片段，其中227bp是否出现207bp和20bp两个DNA片段是检测的关键；引物3、4扩增产物为788bp，用DdeⅠ进行酶切，正常产生268bp、154bp、100bp、77bp、71bp、57bp、36bp、14bp和11bp9个DNA片段，而Bochum-1变异体则产生368bp、154bp、77bp、71bp、57bp、36bp、14bp和11bp8个DNA片段，其中是否出现368bpDNA片段是检测的关键。
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2 结果
我们通过PCR和限制性酶切图谱分析技术对100例哮喘儿童和100例正常儿童α1-ACT基因exonⅡ和Ⅲ分别进行检测，图1、2为检测疾病组基因突变示意图。图1为引物1、2扩增产物及其酶切产物分析图，酶切后产生227bp DNA片段，未见207bp和20bpDNA片段；图2为引物3、4扩增产物及其酶切产物分析图，酶切后未见368 bp DNA片段。哮喘组与对照组儿童酶切产物电泳带均与图1、2相同，即100例哮喘儿童和100例正常儿童均未发现Bonn-1和Bochum-1突变体。
图1 α1-ACT基因exon Ⅲ RFLP分析
Fig1 RFLP analysis of exon Ⅲ of α1-ACT gene
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M:Marker(25 bp DNA ladder);1:Amplified band;
2:Cut band by restriction endonuclease
图2 α1-ACT基因exon Ⅱ RFLP分析
Fig1 RFLP analysis of exon Ⅱ of α1-ACT gene
M1:Marker(25 bp DNA ladder);M2:PCR Marker;1:Cut
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band by restriction endonuclease;2:Amplified band
3 讨论
国外学者采用基因测序分析方法发现Bonn-1和Bochum-1变异体与慢性阻塞性肺病发病有关[2]，同时发现人血浆α1-ACT含量的下降与慢性阻塞性肺病、慢性肝病及支气管哮喘相关联[1～4]。我们通过火箭电泳技术对重庆市100例汉族儿童哮喘血浆α1-ACT含量进行测定，发现α1-ACT杂合缺失与儿童哮喘存在一定的联系，并进一步对这些研究对象进行基因分析。我们采用引物1、2将α1-ACT exon Ⅲ第54位至第419位的基因序列扩增出来，总长度366bp。在扩增出的366bp片段中，正常情况下，A1uⅠ酶有两个酶切位点，当用A1uⅠ酶进行酶切时，产生227bp、21bp及118bp3个DNA片段；如果编码第229位的脯氨酸的'CCT'突变为编码丙氨酸的'GCT'时，则增加了一个A1uⅠ酶酶切位点，酶切时将227bp又切成207bp和20bp2个DNA片段，于是，酶切后产生207bp、118bp、21bp及20bp4个DNA片段。我们采用引物3、4将α1-ACTexonⅡ第33位至第820位的基因序列扩增出来，总长度788bp。在扩增出的788bp片段中，正常情况下，DdeⅠ酶有8个酶切位点，当用DdeⅠ酶进行酶切时，产生268bp、154bp、100bp、77bp、71bp、57bp、36bp、14bp及11bp9个DNA片段；如果编码第55位亮氨酸的碱基序列'CTG'突变为编码脯氨酸的碱基序列'CCG'时，则该部位DdeⅠ酶的酶切位点消失，于是，酶切后产生368bp、154bp、77bp、71bp、57bp、36bp、14bp及11bp8个片段。本研究没有发现Bonn-1和Bochum-1变异体所具有的特征性DNA片段，此结果表明Bonn-1和Bochum-1变异体与100例重庆市汉族儿童哮喘发病无平行关系。
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本研究虽然没有发现Bonn-1和Bochum-1变异体，但不能说α1-ACT基因突变与中国儿童哮喘发病无关。首先，本研究仅仅筛查了α1-ACT基因exonⅡ上编码其第55位亮氨酸和exonⅢ上编码其第229位脯氨酸的基因序列的两个位点的点突变情况，而没有检测exonⅠ、exonⅣ、exonⅤ以及exonⅡ和exonⅢ的其它位点。其次，种族差异、研究群体、地理环境及疾病种类均影响基因的分布排列。我国幅源辽阔，南北地理环境差异很大，又是多民族国家，本研究仅仅局限于重庆市的100例汉族儿童。所以，尽管没有发现相应的变异体，但结合前期研究结果来看，本研究仍然具有不可忽视的意义。
本研究在重庆市100例汉族儿童哮喘中对α1-ACT基因突变进行了初步探讨，为在中国人群中进一步研究α1-ACT打下了基础。要想更多地了解α1-ACT遗传缺陷与中国儿童哮喘发病的关系则需要在国内不同的民族、不同的地区广泛进行α1-ACT的研究。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570749)
作者简介：尹晓娟(1969.4)，女，湖南省邵阳市人，硕士，主治医师，讲师，主要从事α-抗糜蛋白酶遗传缺陷在中国人发病中的作用方面的研究，发表论文4篇。电话：(023)68755602
作者单位：奚敏(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)
崔凤文(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)
艾有萍(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)
刘晓蓉(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)
姚俐(第三军医大学附属新桥医院小儿科，重庆 400037)
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参考文献
[1]Lindmark B,Svenonius E,Eriksson S.Heterozygous α1-antichymotrypsin and Piz α1-antitrypsin Deficiency[J].Allergy,1990,45(3):197-203.
[2]Poller W,Faber J P,Weidinger S,et al.A leucine-toproline substitution cause a defective α1-antichymotrypsin allele associated with familial obstructive lung disease[J].Genomics,1993,17(3):740-743.
[3]Lindmark B.Asthma and heterozygous α1-anchymotrypsin deficiency:a posisible association[J].J Internal Med-icine,1990,227(2):115-118.
[4]Elzouki A N,Verbaan H,Lindgren S,et al.Serine protease inhitors in patients with chronic viral hepatitis[J].J Hepatol,1997,27(1):42-48.
收稿日期：1999-04-05
修回日期：1999-10-15, 百拇医药