大鼠肝再生过程中线粒体氧化磷酸化的调控*
作者：缪明永 蔡在龙 刘鹏飞 王学敏 毛积芳 陈克明
单位：
缪明永 蔡在龙 王学敏 毛积芳 陈克明 第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室；刘鹏飞 第二军医大学东方肝胆外科医院 (上海 200433)
关键词：肝再生；线粒体；氧化磷酸化；大鼠
大鼠肝再生过程中线粒体氧化磷酸化的调控 摘 要 目的：探讨肝部分切除后肝再生过程中线粒体能量代谢的调控。方法：用雄性Wistar大鼠施行肝部分切除复制肝再生模型，肝部分切除后分别观察0.5、1、2、4和7 d 5个肝再生组以及5个相应的对照组，差速离心法分离肝线粒体并用氧电极极谱法测定其氧化磷酸化活性。结果：肝部分切除后肝再生过程中线粒体呼吸控制率(RCR)明显高于相应对照组，其中肝部分切除后0.5 d和4 d为二个峰值，7 d时降至对照组水平，早期RCR的升高主要是R3升高的所致，1 d后RCR升高是R4下降所致。磷氧比值(P/O)的变化类似于RCR。结论：肝部分切除后肝再生过程中线粒体通过氧化磷酸化偶联增强来适应肝再生的能量需求，这种增强机制很可能主要是通过降低线粒体内膜通透性实现的。
, 百拇医药
Regulation of mitochondrial oxidative phosphorylation during rat
liver regeneration after partial hepatectomy
MIAO Ming-Yong, CAI Zai-Long, LIU Peng-Fei, WANG Xue-Min,MAO Ji-Fang,CHENG Ke-Ming
Department of Biochemistry and Molecular Biology , Department of Basic Medicine,Second Military Medical University, Shanghai, (200433)
Abstract AIM：To investigate the regulation of mitochondrial energy metabolism during liver regeneration after partial hepatectomy. METHODS：Liver regeneration model was produced by partial hepatectomy performed in male Wistar rats. All rats were divided into five experimental groups (0.5, 1, 2, 4 and 7 days groups after partial hepatectomy), and five sham-operated groups. The liver mitochondria were isolated by differential centrifugation, and its oxidative phosphorylation capacity were measured polarographically with Clark oxygen electrode.RESULTS：The mitochondrial respiratory control rate (RCR) significantly increased during rat liver regeneration after partial hepatectomy, as compared with sham-operated groups, and two peaks in RCR occured at half day and the fourth day after partial hepatectomy, and then reduced to the level of sham-operated groups at the seventh day. The first peak in RCR was due to the increase of respiratory state Ⅲ(R3), the second due to the decrease of repiratory state Ⅳ(R4). The kind of change of P/O ratio was likely to that of RCR after partial hepatectomy.CONCLUSION：The enhancement of oxidative phosphorylation function occure to meet the increase in cellular energy demand for rat liver regeneration, as was obtained by some regulatory mechanism which might reduce permeability of the inner mitochondrial membrane after partial hepatectomy.
, 百拇医药
MeSH Liver regeneration; Mitochondria; Oxidative phosphorylation; Rats
肝脏的外科手术或有害因素对肝脏损伤后，残存的肝细胞很快会进入一个复杂的再生过程，这个再生过程与细胞的能量供应密切相关，用于合成细胞各种组分的能量需求增加[1]。正常情况下细胞能量供应主要由线粒化氧体磷酸化提供。有研究表明肝再生时线粒体形态发生了较大的变化，表现为肿胀、增大及聚集等[2]，还有研究发现肝再生时细胞能量需求增加，线粒体功能增强[1，3]，而另外研究发现肝再生早期线粒体ATP合成酶活性减低[4]，呼吸功能下降[5]。因此，这方面的研究结果存在较大差别。为此，本文研究分析肝再生不同时期的线粒体氧化磷酸化诸多参数，以探明肝再生过程中线粒体氧化磷酸化的时相变化规律，为肝再生机制的认识提供一些实验依据。
, 百拇医药 材料与方法
(一)实验动物模型与分组：雄性Wistar大鼠(200～250 g)，本校实验动物中心提供，参照文献[6]复制肝脏部分切除模型。用乙醚麻醉动物，切除大鼠肝的中叶和左叶，约占肝脏的65%～70%，分别在手术后0.5、1、2、4和7 d时断头取肝制备线粒体，这样分成5个肝再生实验组；同时设5个相应的对照组，对照组的大鼠同样用乙醚麻醉和手术处理但不切肝，并在同样的时点断头取肝分离线粒体。每组为5只大鼠。
(二)主要试剂与仪器：鱼藤酮、腺苷二磷酸(ADP)为Sigma公司产品，蔗糖、甘露醇、琥珀酸、谷氨酸和苹果酸等为国产AR级试剂。主要仪器CR21高速冷冻离心机(日立公司)，SP-2溶氧测定仪(上海植生所)。
(三)肝线粒体的分离：参照文献[7]，动物断头取肝，称重，按10 mL/g tissue加分离介质(250 mmol/L蔗糖、220 mmol/L甘露醇、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA, 0.25%牛血清白蛋白，pH7.4)，用Teflon芯的玻璃匀浆器匀浆，差速离心分离线粒体，制成合适的线粒体悬液。双缩脲法测定线粒体悬液的蛋白量，整个过程严格在冰浴中进行。
, 百拇医药
(四)肝线粒体氧化磷酸化功能参数测定与计算：
1.测定条件：在25℃密闭的连续搅拌的反应体系用氧电极测定线粒体的耗氧速率来反映线粒体的功能。加入测定介质(75 mmol/L蔗糖、220 mmol/L甘露醇、20 mmpl/L KCl、5 mmol/L MgCl2、 5 mmol/L K-Pi,20 mmol/L Tris-HCl、0.1 mmol/L EDTA、pH7.4)和线粒体(1 mg蛋白/mL)后描记本底耗氧(Ⅰ态呼吸)，加入底物琥珀酸或谷氨酸+苹果酸后耗氧加快(Ⅱ态呼吸)，加入ADP刺激呼吸明显加快(Ⅲ态呼吸)，待ADP消耗完后耗氧又减慢(Ⅳ态呼吸)，用记录仪连续描记这呼吸曲线后进行计算。
2.计算方法：①耗氧速率(QO)=氧饱和度×单位时间耗氧格数×反应体积×2/定标格数，单位nmols O/min.mg-1pr.;②呼吸控制率(RCR)=Ⅲ态耗氧速率/Ⅳ态耗氧速率；③磷氧比值(P/O)=ADP(nmoles)/Ⅲ态耗氧总量。
, 百拇医药
(五)统计处理：实验数据用(
)表示，显著性检验用t检验。
结果
图1示大鼠肝部分切除后不同时间里肝线粒体以琥珀酸为底物的RCR变化，上面曲线为肝部分切除组，下面曲线为对照组。从图上可以看出肝部分切除后0.5 d时RCR为最高， 明显高于对照组(P<0.01)，以后逐步下降，2 d时为最低但仍高于对照组，而后又升高，至4 d时又显著高于对照组(P<0.05)，第7 d时接近对照组；图2是以苹果酸+谷氨酸为底物的肝线粒体RCR的变化曲线，基本与图1的情况相似，但变化更明显，同样在肝切后0.5和第4 d为高峰与对照组相差极显著(P<0.01)，第1和第2 d也显著高于对照组(P<0.05)。对照组的肝线粒体RCR在整个实验过程中波动很小。
, 百拇医药
Fig 1 Change of mitochondrial RCR with succinate as substrate after rat partial hepatectomy (,n=5)
-○-hepatectomy -△-sham-operation
*P<0.05, **P<0.01, vs sham-operation group
图1 大鼠肝部分切除后肝线粒体以琥珀酸为底物的RCR变化
, 百拇医药
Fig 2 Change of mitochondrial RCR with malate+glutamate as substrate after rat partial hepatectomy (,n=5)
-○-hepatectomy -△-sham-operation
*P<0.05, **P<0.01, vs sham-operation group
图2 大鼠肝部分切除后肝线粒体以苹果酸+谷氨酸为底物的RCR变化
图3以琥珀酸为底物的R3、R4的变化曲线，上二条曲线代表肝部分切除组和对照组的R3，下二条曲线为肝部分切除组和对照组的R4。肝部分切除后0.5 d，R3极明显高于对照组(P<0.01)，以后迅速下降，并与对照组无明显差异；而R4在肝部分切除后1 d以后逐渐低于对照组，在第2和第4 d时显著低于对照组(P<0.05)，7 d时基本恢复与对照组无差别。图4是以苹果酸+谷氨酸为底物的R3、R4变化曲线，其变化情形与图3类似，其中肝切后1 d时R4就显著低于对照组(P<0.05)，在第4 d时下降最明显，与对照组相差极显著(P<0.01)。从R3、R4的变化可以看出，肝部分切除后早期(0.5 d)RCR的升高主要是R3升高所至，而第2 d以后RCR升高是由于R4下降所至。
, 百拇医药
Fig 3 Change of mitochondrial oxygen comsuption with succinate as substrate after rat partial hepatectomy (,n=5)
-●-R3 (hepatectomy) -▲-R4 (hepatectomy)
-○-R3 (sham-operation) -△-R4 (sham-operation)
*P<0.05, **P<0.01, vs sham-operation group
, http://www.100md.com
图3 大鼠肝部分切除后肝线粒体以琥珀酸为底物的耗氧变化
Fig 4 Change of mitochondrial oxygen comsuption with malate+glutamate as substrate after rat partial hepatectomy (,n=5)
-●-R3 (hepatectomy) -▲-R4 (hepatectomy)
, 百拇医药
-○-R3 (sham-operation) -△-R4 (sham-operation)
*P<0.05, **P<0.01, vs sham-operation group
图4 大鼠肝部分切除后肝线粒体以苹果酸+谷氨酸为底物的耗氧变化
表1表明肝部分切除后分别以琥珀酸和谷氨酸+苹果酸为底物的肝线粒体磷氧比值(P/O)的变化。P/O在肝部分切除组各个时点皆高于对照组，与RCR的变化是一致的，反映了肝再生期肝线粒体氧化磷酸化偶联增强和效率提高。
表1 大鼠肝再生过程中线粒体磷氧比值(P/O)的变化
Tab 1 Change of mitochondrial P/O ratio during rat
, 百拇医药
liver regeneration (,n=5)
Time
Succinate
Malate+glutamate
(day)
Hepatectomy
Sham-operation
Hepatectomy
Sham-operation
, 百拇医药
0.5
1.64±0.12*
1.49±0.14
2.46±0.21*
2.2±0.15
1.0
1.49±0.20
1.34±0.11
2.14±0.17
2.0±0.12
2.0
1.44±0.16
, 百拇医药
1.38±0.13
2.30±0.14*
2.04±0.10
4.0
1.51±0.13*
1.38±0.15
2.38±0.13*
2.06±0.17
7.0
1.40±0.13
1.39±0.11
, http://www.100md.com
2.11±0.12
2.08±0.11
*P<0.05,vs sham-operation group
讨论
研究结果表明，肝部分切除后的再生过程中肝线粒体氧化磷酸化功能发生了明显的变化，肝 部分切除组的线粒体功能明显高于对照组，经历了早期升高而后下降，又升高，最后下降接近对照组的过程。这表明在肝再生时，肝细胞以及线粒体发生了调控，以满足肝再生时对能量需求的增强，也提示细胞及线粒体的结构和代谢功能发生了很大的变化。同时发现依赖NADH(苹果酸+谷氨酸)呼吸链的功能增强要比琥珀酸呼吸链的明显，这对能量供应更有意义。
RCR是指线粒体在有ADP时的快速摄氧速率(R3)与ADP耗尽后较低的摄氧速率(R4)之比值，它是评价线粒体结构完整性和氧化磷酸化偶联程度的灵敏指标之一，主要包括线粒体内膜呼吸链和内膜通透性。R3反映了底物通透性(底物载体)、呼吸链、ATP合成酶和ATP/ADP移位体。R4则依赖于膜的天然质子传导性即内膜通透性[8]。从实验结果可能得出：肝再生早期RCR的高峰(见图1，2)，主要是R3上升结果，R4只有轻微上升(见图3、4)，这表明与R3相关的因素即呼吸链酶系、ATP合成酶、ATP/ADP移位体和底物载体等活性增强，而线粒体内膜通透性没有发生明显的改变。早期(12 h)的线粒体功能增强未见有报导，其机制可能与应激有关[9]，但不能完全用应激来解释，因为同时观察到对照组的R3、R4仅轻微升高(见图3、4)。手术1 d以后，肝切组和对照组的R3没有差别，而肝切组的R4却明显低于对照组，这是肝切组RCR高于对照组的主要原因。表明在这个时期再生肝线粒体内膜通透性明显降低即氧化磷酸化偶联增强、效率提高，这对肝再生提供更多的ATP具有重要意义；内膜通透性下降直接反映了内膜结构和组成发生了改变，这也说明细胞和线粒体本身进行了一系列的调控，以适应肝细胞再生时的能量需求。
, 百拇医药
线粒体功能增强有二个方面：一方面可能通过表达合成大量有关氧化磷酸化酶系的蛋白质来提高ATP的合成功能，这样必然会消耗过多的ATP，这显然是不经济的；另一方面通过调节线粒体内膜理化特性，呼吸链多酶复合体的结构以及内环境等提高氧化磷酸化的功能和效率，这是一个经济的途径。从本文研究结果分析提示，整个肝再生过程中线粒体内膜理化特性的变孔，可能是一个主要的方面。为了验证上述假设，就必须进一步研究肝部分切除后线粒体内膜的理化特性，如内膜膜脂组分分析、膜电位(ΔΨm)、膜流动性、膜通透性转换(PT孔)等。
*国家自然科学基金资助(39600139)
参考文献
1 Tsai IL,King KL, Chang CC, et al. Changes of mitochondrial respiratory functions and superoxide dismutase activity during liver regeneration. Biochem Int 1992, 28:205.
, 百拇医药
2 韩淑媛，黄志强，刘永雄，等.大鼠肝部分切除后肝再生细胞超微结构的动态变化.中华实验外科杂志，1993，10(2)：54.
3 Nagino M, Tanaka M, Nishikimi M, et al. Stimulated rat liver mitochondrial biogenesis after partial hepatectomy. Cancer Res, 1989,49:4913.
4 Buckle M, Guerrieri F, Papa S.Changes in activity and F1 content of mitochondrial H+-ATPase in regenerating rat liver. Eur J Biochem 1986, 155:439.
5 Guerrieri F, Muolo L, Cocco T, et al. Correlation between rat liver regenerating and mitochondrial energy metabolism. Biochim Biophy Acta, 1995, 1272:95.
, http://www.100md.com
6 Buckle M, Guerrieri F, Pazienza A,et al. Studies on polypeptide composition, hydrolytic activity and proton conduction of mitochondrial F0 F1-ATPase in regenerating rat liver. Eur J Biochem,1986,155:439.
7 缪明永，朱善宏，石汉平，等.失血性休克时大鼠肝线粒体内膜的损伤.中国病理生理杂志，1995，11(1)：86.
8 尼柯尔斯DG著.张玉中，阎一林译.生物化学-化学渗透理论介绍.北京：北京科学技术出版社，1987.87.
9 王学敏，缪明永，陈克明，等.大鼠急性应激时肝线粒体质子跨膜转运活性的调控.生物化学杂志，1993，9(6)：725.
(1997年10月8日收稿，1998年3月3日修回), 百拇医药
单位：
缪明永 蔡在龙 王学敏 毛积芳 陈克明 第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室；刘鹏飞 第二军医大学东方肝胆外科医院 (上海 200433)
关键词：肝再生；线粒体；氧化磷酸化；大鼠
大鼠肝再生过程中线粒体氧化磷酸化的调控 摘 要 目的：探讨肝部分切除后肝再生过程中线粒体能量代谢的调控。方法：用雄性Wistar大鼠施行肝部分切除复制肝再生模型，肝部分切除后分别观察0.5、1、2、4和7 d 5个肝再生组以及5个相应的对照组，差速离心法分离肝线粒体并用氧电极极谱法测定其氧化磷酸化活性。结果：肝部分切除后肝再生过程中线粒体呼吸控制率(RCR)明显高于相应对照组，其中肝部分切除后0.5 d和4 d为二个峰值，7 d时降至对照组水平，早期RCR的升高主要是R3升高的所致，1 d后RCR升高是R4下降所致。磷氧比值(P/O)的变化类似于RCR。结论：肝部分切除后肝再生过程中线粒体通过氧化磷酸化偶联增强来适应肝再生的能量需求，这种增强机制很可能主要是通过降低线粒体内膜通透性实现的。
, 百拇医药
Regulation of mitochondrial oxidative phosphorylation during rat
liver regeneration after partial hepatectomy
MIAO Ming-Yong, CAI Zai-Long, LIU Peng-Fei, WANG Xue-Min,MAO Ji-Fang,CHENG Ke-Ming
Department of Biochemistry and Molecular Biology , Department of Basic Medicine,Second Military Medical University, Shanghai, (200433)
Abstract AIM：To investigate the regulation of mitochondrial energy metabolism during liver regeneration after partial hepatectomy. METHODS：Liver regeneration model was produced by partial hepatectomy performed in male Wistar rats. All rats were divided into five experimental groups (0.5, 1, 2, 4 and 7 days groups after partial hepatectomy), and five sham-operated groups. The liver mitochondria were isolated by differential centrifugation, and its oxidative phosphorylation capacity were measured polarographically with Clark oxygen electrode.RESULTS：The mitochondrial respiratory control rate (RCR) significantly increased during rat liver regeneration after partial hepatectomy, as compared with sham-operated groups, and two peaks in RCR occured at half day and the fourth day after partial hepatectomy, and then reduced to the level of sham-operated groups at the seventh day. The first peak in RCR was due to the increase of respiratory state Ⅲ(R3), the second due to the decrease of repiratory state Ⅳ(R4). The kind of change of P/O ratio was likely to that of RCR after partial hepatectomy.CONCLUSION：The enhancement of oxidative phosphorylation function occure to meet the increase in cellular energy demand for rat liver regeneration, as was obtained by some regulatory mechanism which might reduce permeability of the inner mitochondrial membrane after partial hepatectomy.
, 百拇医药
MeSH Liver regeneration; Mitochondria; Oxidative phosphorylation; Rats
肝脏的外科手术或有害因素对肝脏损伤后，残存的肝细胞很快会进入一个复杂的再生过程，这个再生过程与细胞的能量供应密切相关，用于合成细胞各种组分的能量需求增加[1]。正常情况下细胞能量供应主要由线粒化氧体磷酸化提供。有研究表明肝再生时线粒体形态发生了较大的变化，表现为肿胀、增大及聚集等[2]，还有研究发现肝再生时细胞能量需求增加，线粒体功能增强[1，3]，而另外研究发现肝再生早期线粒体ATP合成酶活性减低[4]，呼吸功能下降[5]。因此，这方面的研究结果存在较大差别。为此，本文研究分析肝再生不同时期的线粒体氧化磷酸化诸多参数，以探明肝再生过程中线粒体氧化磷酸化的时相变化规律，为肝再生机制的认识提供一些实验依据。
, 百拇医药 材料与方法
(一)实验动物模型与分组：雄性Wistar大鼠(200～250 g)，本校实验动物中心提供，参照文献[6]复制肝脏部分切除模型。用乙醚麻醉动物，切除大鼠肝的中叶和左叶，约占肝脏的65%～70%，分别在手术后0.5、1、2、4和7 d时断头取肝制备线粒体，这样分成5个肝再生实验组；同时设5个相应的对照组，对照组的大鼠同样用乙醚麻醉和手术处理但不切肝，并在同样的时点断头取肝分离线粒体。每组为5只大鼠。
(二)主要试剂与仪器：鱼藤酮、腺苷二磷酸(ADP)为Sigma公司产品，蔗糖、甘露醇、琥珀酸、谷氨酸和苹果酸等为国产AR级试剂。主要仪器CR21高速冷冻离心机(日立公司)，SP-2溶氧测定仪(上海植生所)。
(三)肝线粒体的分离：参照文献[7]，动物断头取肝，称重，按10 mL/g tissue加分离介质(250 mmol/L蔗糖、220 mmol/L甘露醇、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA, 0.25%牛血清白蛋白，pH7.4)，用Teflon芯的玻璃匀浆器匀浆，差速离心分离线粒体，制成合适的线粒体悬液。双缩脲法测定线粒体悬液的蛋白量，整个过程严格在冰浴中进行。
, 百拇医药
(四)肝线粒体氧化磷酸化功能参数测定与计算：
1.测定条件：在25℃密闭的连续搅拌的反应体系用氧电极测定线粒体的耗氧速率来反映线粒体的功能。加入测定介质(75 mmol/L蔗糖、220 mmol/L甘露醇、20 mmpl/L KCl、5 mmol/L MgCl2、 5 mmol/L K-Pi,20 mmol/L Tris-HCl、0.1 mmol/L EDTA、pH7.4)和线粒体(1 mg蛋白/mL)后描记本底耗氧(Ⅰ态呼吸)，加入底物琥珀酸或谷氨酸+苹果酸后耗氧加快(Ⅱ态呼吸)，加入ADP刺激呼吸明显加快(Ⅲ态呼吸)，待ADP消耗完后耗氧又减慢(Ⅳ态呼吸)，用记录仪连续描记这呼吸曲线后进行计算。
2.计算方法：①耗氧速率(QO)=氧饱和度×单位时间耗氧格数×反应体积×2/定标格数，单位nmols O/min.mg-1pr.;②呼吸控制率(RCR)=Ⅲ态耗氧速率/Ⅳ态耗氧速率；③磷氧比值(P/O)=ADP(nmoles)/Ⅲ态耗氧总量。
, 百拇医药
(五)统计处理：实验数据用(
)表示，显著性检验用t检验。结果
图1示大鼠肝部分切除后不同时间里肝线粒体以琥珀酸为底物的RCR变化，上面曲线为肝部分切除组，下面曲线为对照组。从图上可以看出肝部分切除后0.5 d时RCR为最高， 明显高于对照组(P<0.01)，以后逐步下降，2 d时为最低但仍高于对照组，而后又升高，至4 d时又显著高于对照组(P<0.05)，第7 d时接近对照组；图2是以苹果酸+谷氨酸为底物的肝线粒体RCR的变化曲线，基本与图1的情况相似，但变化更明显，同样在肝切后0.5和第4 d为高峰与对照组相差极显著(P<0.01)，第1和第2 d也显著高于对照组(P<0.05)。对照组的肝线粒体RCR在整个实验过程中波动很小。
, 百拇医药
Fig 1 Change of mitochondrial RCR with succinate as substrate after rat partial hepatectomy (
,n=5)-○-hepatectomy -△-sham-operation
*P<0.05, **P<0.01, vs sham-operation group
图1 大鼠肝部分切除后肝线粒体以琥珀酸为底物的RCR变化
, 百拇医药
Fig 2 Change of mitochondrial RCR with malate+glutamate as substrate after rat partial hepatectomy (
,n=5)-○-hepatectomy -△-sham-operation
*P<0.05, **P<0.01, vs sham-operation group
图2 大鼠肝部分切除后肝线粒体以苹果酸+谷氨酸为底物的RCR变化
图3以琥珀酸为底物的R3、R4的变化曲线，上二条曲线代表肝部分切除组和对照组的R3，下二条曲线为肝部分切除组和对照组的R4。肝部分切除后0.5 d，R3极明显高于对照组(P<0.01)，以后迅速下降，并与对照组无明显差异；而R4在肝部分切除后1 d以后逐渐低于对照组，在第2和第4 d时显著低于对照组(P<0.05)，7 d时基本恢复与对照组无差别。图4是以苹果酸+谷氨酸为底物的R3、R4变化曲线，其变化情形与图3类似，其中肝切后1 d时R4就显著低于对照组(P<0.05)，在第4 d时下降最明显，与对照组相差极显著(P<0.01)。从R3、R4的变化可以看出，肝部分切除后早期(0.5 d)RCR的升高主要是R3升高所至，而第2 d以后RCR升高是由于R4下降所至。
, 百拇医药
Fig 3 Change of mitochondrial oxygen comsuption with succinate as substrate after rat partial hepatectomy (
,n=5)-●-R3 (hepatectomy) -▲-R4 (hepatectomy)
-○-R3 (sham-operation) -△-R4 (sham-operation)
*P<0.05, **P<0.01, vs sham-operation group
, http://www.100md.com
图3 大鼠肝部分切除后肝线粒体以琥珀酸为底物的耗氧变化
Fig 4 Change of mitochondrial oxygen comsuption with malate+glutamate as substrate after rat partial hepatectomy (
,n=5)-●-R3 (hepatectomy) -▲-R4 (hepatectomy)
, 百拇医药
-○-R3 (sham-operation) -△-R4 (sham-operation)
*P<0.05, **P<0.01, vs sham-operation group
图4 大鼠肝部分切除后肝线粒体以苹果酸+谷氨酸为底物的耗氧变化
表1表明肝部分切除后分别以琥珀酸和谷氨酸+苹果酸为底物的肝线粒体磷氧比值(P/O)的变化。P/O在肝部分切除组各个时点皆高于对照组，与RCR的变化是一致的，反映了肝再生期肝线粒体氧化磷酸化偶联增强和效率提高。
表1 大鼠肝再生过程中线粒体磷氧比值(P/O)的变化
Tab 1 Change of mitochondrial P/O ratio during rat
, 百拇医药
liver regeneration (
,n=5)Time
Succinate
Malate+glutamate
(day)
Hepatectomy
Sham-operation
Hepatectomy
Sham-operation
, 百拇医药
0.5
1.64±0.12*
1.49±0.14
2.46±0.21*
2.2±0.15
1.0
1.49±0.20
1.34±0.11
2.14±0.17
2.0±0.12
2.0
1.44±0.16
, 百拇医药
1.38±0.13
2.30±0.14*
2.04±0.10
4.0
1.51±0.13*
1.38±0.15
2.38±0.13*
2.06±0.17
7.0
1.40±0.13
1.39±0.11
, http://www.100md.com
2.11±0.12
2.08±0.11
*P<0.05,vs sham-operation group
讨论
研究结果表明，肝部分切除后的再生过程中肝线粒体氧化磷酸化功能发生了明显的变化，肝 部分切除组的线粒体功能明显高于对照组，经历了早期升高而后下降，又升高，最后下降接近对照组的过程。这表明在肝再生时，肝细胞以及线粒体发生了调控，以满足肝再生时对能量需求的增强，也提示细胞及线粒体的结构和代谢功能发生了很大的变化。同时发现依赖NADH(苹果酸+谷氨酸)呼吸链的功能增强要比琥珀酸呼吸链的明显，这对能量供应更有意义。
RCR是指线粒体在有ADP时的快速摄氧速率(R3)与ADP耗尽后较低的摄氧速率(R4)之比值，它是评价线粒体结构完整性和氧化磷酸化偶联程度的灵敏指标之一，主要包括线粒体内膜呼吸链和内膜通透性。R3反映了底物通透性(底物载体)、呼吸链、ATP合成酶和ATP/ADP移位体。R4则依赖于膜的天然质子传导性即内膜通透性[8]。从实验结果可能得出：肝再生早期RCR的高峰(见图1，2)，主要是R3上升结果，R4只有轻微上升(见图3、4)，这表明与R3相关的因素即呼吸链酶系、ATP合成酶、ATP/ADP移位体和底物载体等活性增强，而线粒体内膜通透性没有发生明显的改变。早期(12 h)的线粒体功能增强未见有报导，其机制可能与应激有关[9]，但不能完全用应激来解释，因为同时观察到对照组的R3、R4仅轻微升高(见图3、4)。手术1 d以后，肝切组和对照组的R3没有差别，而肝切组的R4却明显低于对照组，这是肝切组RCR高于对照组的主要原因。表明在这个时期再生肝线粒体内膜通透性明显降低即氧化磷酸化偶联增强、效率提高，这对肝再生提供更多的ATP具有重要意义；内膜通透性下降直接反映了内膜结构和组成发生了改变，这也说明细胞和线粒体本身进行了一系列的调控，以适应肝细胞再生时的能量需求。
, 百拇医药
线粒体功能增强有二个方面：一方面可能通过表达合成大量有关氧化磷酸化酶系的蛋白质来提高ATP的合成功能，这样必然会消耗过多的ATP，这显然是不经济的；另一方面通过调节线粒体内膜理化特性，呼吸链多酶复合体的结构以及内环境等提高氧化磷酸化的功能和效率，这是一个经济的途径。从本文研究结果分析提示，整个肝再生过程中线粒体内膜理化特性的变孔，可能是一个主要的方面。为了验证上述假设，就必须进一步研究肝部分切除后线粒体内膜的理化特性，如内膜膜脂组分分析、膜电位(ΔΨm)、膜流动性、膜通透性转换(PT孔)等。
*国家自然科学基金资助(39600139)
参考文献
1 Tsai IL,King KL, Chang CC, et al. Changes of mitochondrial respiratory functions and superoxide dismutase activity during liver regeneration. Biochem Int 1992, 28:205.
, 百拇医药
2 韩淑媛，黄志强，刘永雄，等.大鼠肝部分切除后肝再生细胞超微结构的动态变化.中华实验外科杂志，1993，10(2)：54.
3 Nagino M, Tanaka M, Nishikimi M, et al. Stimulated rat liver mitochondrial biogenesis after partial hepatectomy. Cancer Res, 1989,49:4913.
4 Buckle M, Guerrieri F, Papa S.Changes in activity and F1 content of mitochondrial H+-ATPase in regenerating rat liver. Eur J Biochem 1986, 155:439.
5 Guerrieri F, Muolo L, Cocco T, et al. Correlation between rat liver regenerating and mitochondrial energy metabolism. Biochim Biophy Acta, 1995, 1272:95.
, http://www.100md.com
6 Buckle M, Guerrieri F, Pazienza A,et al. Studies on polypeptide composition, hydrolytic activity and proton conduction of mitochondrial F0 F1-ATPase in regenerating rat liver. Eur J Biochem,1986,155:439.
7 缪明永，朱善宏，石汉平，等.失血性休克时大鼠肝线粒体内膜的损伤.中国病理生理杂志，1995，11(1)：86.
8 尼柯尔斯DG著.张玉中，阎一林译.生物化学-化学渗透理论介绍.北京：北京科学技术出版社，1987.87.
9 王学敏，缪明永，陈克明，等.大鼠急性应激时肝线粒体质子跨膜转运活性的调控.生物化学杂志，1993，9(6)：725.
(1997年10月8日收稿，1998年3月3日修回), 百拇医药