补气与理气中药对慢性缺氧小鼠能量代谢的作用*
作者：李兴泰 张家俊 陈文为 堀口贞次郎 江崎宣久
单位：李兴泰 张家俊 陈文为(北京中医药大学中心实验室 北京100029)；堀口贞次郎 江崎宣久(日本养命酒制造公司中央研究所 日本长野)
关键词：补气药；理气药；慢性缺氧；能量代谢；能荷值；氧化磷酸化
北京中医药大学学报990313 摘 要：从能量的生成、储存和调节3个途径探讨配伍方剂常用的补气药(人参、黄芪、党参、白术)与理气药(枳实、厚朴、青皮、乌药)的作用。实验发现：①能量的生成：补气药人参、黄芪可降低耗氧速度与呼吸控制率，而党参、白术的作用不明显，理气药总的趋势是升高耗氧速度与呼吸控制率；②能量的储存：补气与理气药均显著升高肌酸激酶活力，而理气药又明显高于补气药；③能量的调节：补气药均可增加肝细胞能荷值，而理气药则降低能荷值。
An Approach to the Qi-Invigorating and Qi-Regulating Roles of Herbal Medicines on Energy Metabolism of Chronic Hypoxic Mice
, http://www.100md.com
Li Xingtai, Zhang Jiajun, Chen Wenwei, et al.
(The Central Laboratory of Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT: The roles of qi-invigorating herbal medicine (QIHM) and qi-regulating herbal medicine (QRHM), widely used in prescriptions, are discussed from the perspectives of production, storage and regulation of ATP. QIHM include Renshen(ginseng), Huangqi(Astragalus), Dangshen(Codonopsis) and Baizhu(white atractylodes rhizome); QRHM include Zhishi(immature bitter orange), Houpo(magnolia bark), Qingpi(green tangerine) and Wuyao(lindra root). The results show: 1. In the energy production, Renshen and Huangqi can decrease oxygen-consuming rate(S3) and respiratory control ratio(RCR), but Dangshen and Baizhu haven't obvious effects on them; QRHM tend to increase S3 and RCRgenerally. 2. In the energy storage, both QIHM and QRHM can stimulate activity of creatine kinase(CK) significantly, and QRHM is stronger than QIHM. 3. In the regulation of energy, all the four QIHM can increase the energy charge (EC); on the contrary, all the four QRHM can decrease the EC of liver cells.
, 百拇医药
KEY WORDS: Qi-invigorating herbal medicine (QIHM); Qi-regulating herbal medicine (QRHM); Chronic hypoxia; Energy metabolism; Mitochondrion; Oxidative phosphorylation(OXPHOS)
中医学对“气分疾病”的诊治多是通过补气药与理气药配伍作用来实现的。为此，我们选用小鼠慢性缺氧模型诱导能量代谢障碍，分别观察补气与理气药对其作用的影响，试图从能量的生成、储存和调节3个途径探讨两类气分中药的作用，这将对充实补气与理气中药的药性和药理等中医药基础理论内容，及临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 中药制备
选择具有代表性的常用补气药：人参(红参)，黄芪，党参，白术；理气药：枳实，厚朴，青皮，乌药。上述各单味药均购自北京同仁堂药店，经北京中医药大学中药鉴定学专家李家实教授鉴定，分别煎制成含生药0.2g/mL的水提取液，置4℃冰箱保存备用。
, 百拇医药
1.2 试剂与仪器
ATP，HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethane-sulfonic acid,N-2-羟乙基哌嗪
-N’-2-乙烷磺酸)均为Sigma公司产品，AMP和ADP分别为Boehringer Mannhein和Serva公司产品，CBBG-250(Coomassie Brilliant Blueg-250，考马斯亮蓝G-250)为Fluka公司产品，CK-NAC试剂盒(Creatine Kinase-NAC-activated,肌酸激酶-N-乙酰半胱氨酸激活的试剂盒)为北京中生生物工程高技术公司产品。其它试剂均为进口或国产分析纯。
20PR-52D型高速低温离心机与记录器为Hitachi公司产品，840型HPLC仪(高效液相色谱仪)和恒温水浴分别为美国Waters公司和德国Lauda公司产品，UV-120-02分光光度计为日本Shimadzu公司产品，CY-2型测氧仪购自上海华光仪器仪表厂。氧氮混合气体瓶由北京氦普北分气体工业有限公司供应。
, 百拇医药
1.3 动物及分组
昆明种雄性小鼠，体重20～25g，4周龄，随机分为10组，各组小鼠数(n)参见表2。模型组及各给药(人参、黄芪、党参、白术、枳实、厚朴、青皮、乌药)组置于缺氧装置中，对照组常规条件下饲养(室内空气含21% O2)。
1.4 慢性缺氧模型的建立
用改装的塑料鼠笼(70cm×40cm×40cm)饲养小鼠，内放垫料、食物及钠石灰布袋(吸收鼠呼出的CO2)，笼壁上有数个孔供装置饮水瓶用，盖上有机玻璃板(90cm×50cm)，板面有3个孔(直径1cm)供进气、排气及测氧含量用。通入含10.5% O2、89.5% N2的混合气体，调节气体流量约为1.5L/min，以排除湿气及氨气的聚积。用测氧仪监测笼内氧含量，氧含量控制在10.5%左右(相当于海拔5 000米高度空气的含氧量)，温度控制在23～25℃，每日更换垫料、补充食物，各给药组每只小鼠灌胃中药水提取液1次(相当于80 mg生药)，保持缺氧环境8～10 d(亦是给药天数)。对照组置于敞口鼠笼内饲养，对照组及模型组小鼠分别灌胃等体积的生理盐水。
, 百拇医药
1.5 测定方法
1.5.1 肝线粒体耗氧速度和呼吸控制率的测定
肝线粒体的提取按差速离心法，分离介质是0.25mol/L蔗糖，0.5mmol/L EDTA-Na2，3mmol/L HEPES,pH 7.0。线粒体呼吸功能用Clark氧电极法测定[1]，线粒体蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定[2]。反应系统为1.9mL基质液(0.225 mol/L蔗糖，1mmol/L EDTA，5mmol/L MgCl2，15mmol/L KCl，15mmol/L KH2PO4，50mmol/L Tris,5mmol/L L-谷氨酸，10mmol/L DL-苹果酸，pH 7.5)中加入100 μL新鲜的鼠肝线粒体悬液(约含10 mg蛋白)，总反应体积为2mL，于30℃测定线粒体的呼吸曲线(加入0.5 μmol ADP)。根据呼吸曲线求出呼吸态3(S3，加入ADP后耗氧速率)和呼吸态4(S4，ADP经氧化磷酸化反应生成ATP后的耗氧速率)，分别计算出S3即为耗氧速度，和S3/S4即为呼吸控制率(RCR)，该值变化可反映ATP生成情况。
, 百拇医药
1.5.2 肌酸激酶(CK)活力的测定
采用肌酸激酶试剂盒测定酶活性。取鼠后腿肌肉用生理盐水制成1%匀浆，3 000 r/min离心10min，取上清液0.1mL于Eppendorf管内，加0.9mL生理盐水，测定时从中取出10 μL，加2.0mL预恒温至30℃的工作液，于30℃温育2.5min，以空气为对照，立刻倒入石英比色杯，于340nm记录吸光度(A)(此为初始值即A0min)，1min、2min、3min时分别精确读取A，并计算△A/min，按下式计算肌酸激酶活力：
注：Vt=反应总体积，Vs=样品体积，该条件下消光系数=6.3，C=测定样品所含蛋白量(mg)。
1.5.3 肝细胞能荷值(Energy Charge,EC)的测定
, 百拇医药
用HPLC仪梯度洗脱，测定ATP、ADP和AMP的含量[3]。色谱柱：Waters Spherisorb C18填料，4.6mm×150mm不锈钢柱(中国科学院大连化学物理研究所填充)。流动相A液：0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 6.0)，B液：为含10%甲醇的A液。梯度洗脱程序：0～3min为A液，3～6min内A液由100%→0，B液由0→100%，6～9min为B液，9min以后为A液，共运行12min。流速：0.8mL/min。检测波长254nm，柱温18～22℃。按以下公式计算能荷：
1.5.4 统计方法
因本实验分组较多，小鼠数量大，各组样本数多，难以同时完成全部各项指标的测定，所以严格控制同一操作条件分批进行，各组数据经t检验分析。
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2 结果
2.1 慢性缺氧模型的评估
本实验采用中等程度的慢性缺氧模型。结果：模型组与对照组比较，小鼠平均体重的增量(△W)、肝线粒体耗氧速度(S3)、呼吸控制率(RCR)、能荷(EC)均显著低于对照组(P<0.001)，仅肌酸激酶(CK)活力与对照组无显著性差异(见表1)。缺氧小鼠行为表现：最初烦躁，频频高跳；随后活动明显减少，呼吸急促，神疲乏力。
表1 模型组与对照组各项指标的比较 (
±s) 组别
n
△W/g
S3/nmol/(min.mg)
, 百拇医药
S4/nmol/(min.mg)
RCR/S3/S4
CK/U/mg
EC
对照组
44
+6.12
81.5±19.8
20.7±2.2
3.94±1.07
2229±408
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0.748±0.058
模型组
40
+0.50
54.9±12.7***
19.3±2.0**
2.85±0.57***
2084±464
0.672±0.044***
注：与对照组比较**P<0.01 ***P<0.001 从小鼠体重看出，模型组小鼠的正常代谢与体重增长均明显受到缺氧抑制，平均仅增加0.50g，而对照组却增加6.12g。该模型显著降低线粒体的耗氧速度及呼吸控制率，说明线粒体呼吸链的电子传递速度受到明显的抑制，电子传递与氧化磷酸化之间偶联反应的“紧密程度”随之下降，ATP的生成速度减慢。但肌肉肌酸激酶活力未表现明显改变。能荷值的显著降低证明肝细胞的能量平衡状态发生改变，ATP的生成量减少而AMP的量增加，说明该缺氧模型可诱发能量代谢障碍。上述结果证实，控制氧供应所塑造的慢性缺氧模型是可以采用的。
, 百拇医药
2.2 补气与理气中药对肝线粒体耗氧速度(S3)、呼吸控制率(RCR)及肌酸激酶(CK)活力的影响
从线粒体耗氧速度分析，补气药组均不同程度地降低耗氧速度，以人参、黄芪较为明显。理气药组中厚朴、青皮、枳实均增加耗氧速度，以厚朴、青皮较为明显，乌药对耗氧速度影响不明显。其顺序如下：对照>厚朴>青皮>枳实>模型>白术>乌药>党参>黄芪>人参。
补气药组的呼吸控制率表现低于理气药组的趋势，以人参、黄芪降低幅度最大，理气药组中以乌药、青皮增加的幅度最大。其顺序如下，对照>乌药>青皮>厚朴>党参>模型>白术>枳实>黄芪>人参。
补气药与理气药均可显著增加肌酸激酶活力，理气药组又显著高于补气药组。其顺序如下：乌药>青皮>厚朴>枳实>白术>黄芪>人参>党参>对照>模型。
耗氧速率和呼吸控制率未表现出一致的趋势，而是局部交叉的(白术的耗氧速度与乌药交叉，党参、白术的呼吸控制率与枳实交叉)(见表2)。
, 百拇医药
表2 补气与理气药对鼠S3、S4、RCR及CK活力的影响 〔nmol/(min.mg);±s〕 组别
n
S3
S4
RCR/S3/S4
CK/U/mg
对照
44
81.5±19.8***
, 百拇医药
20.7±2.2**
3.94±1.07***
2229±408
模型
40
54.9±12.7
19.3±2.0
2.85±0.57
2084±464
人参
20
44.5±11.7**
, 百拇医药
18.3±1.9
2.43±0.42**
2493±399***
黄芪
21
44.8±9.2***
18.4±1.8
2.44±0.48**
2512±323***
党参
19
, 百拇医药
53.0±15.9**
17.8±2.3*
2.98±0.60
2452±405**
白术
19
53.7±12.0
19.0±2.2
2.83±0.55
2558±467**
枳实
, 百拇医药
21
59.5±9.9**
21.6±2.3**
2.76±0.62
2903±323**
厚朴
20
69.0±12.4***
20.8±2.2**
3.32±0.70*
, 百拇医药 3167±472***
青皮
19
66.5±11.8**
19.1±2.2
3.48±0.86*
3173±463***
乌药
20
53.1±21.0
13.9±2.5***
, 百拇医药
3.82±0.95***
3256±344***
注：与模型组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.0012.3 补气与理气中药对小鼠体重(△W)与肝细胞能荷(EC)的影响
结果见表3。
表3 补气与理气药对小鼠体重及EC的影响 (±s) 组别
n
△W/g
EC
对照
, 百拇医药
44
+6.12
0.748±0.058***
模型
40
+0.50
0.672±0.044
人参
20
+2.29
0.712±0.039***
黄芪
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21
+1.13
0.676±0.035
党参
19
+0.25
0.701±0.052*
白术
19
+1.10
0.689±0.055
枳实
, 百拇医药 21
-1.28
0.637±0.053**
厚朴
20
-0.67
0.635±0.064*
青皮
19
+0.32
0.636±0.065*
乌药
, 百拇医药
20
-0.19
0.605±0.074**
注：与对照组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001 表3所示，补气药组小鼠的体重增加量高于缺氧模型组，而模型组又高于理气药组，理气药各组体重几乎均减轻。其中以补气药人参组体重增加最多，理气药枳实组体重减轻最多。其顺序如下：对照>人参>黄芪>白术>模型>青皮>党参>乌药>厚朴>枳实。
补气药均可增加肝细胞能荷值，其中以人参、党参较为明显，白术、黄芪次之；理气药均降低能荷值，并有显著性差异，以乌药降低幅度最大。其顺序如下：对照>人参>党参>白术>黄芪>模型>枳实>青皮>厚朴>乌药。
3 讨论
, 百拇医药 在正常生理情况下，机体ATP主要由ADP经氧化磷酸化反应生成；在应急状态下，ATP亦可由ADP与磷酸肌酸经肌酸激酶催化途径获得补充，或由ADP经腺苷酸激酶催化反应而得到代偿性调节补充，可见ADP在能量代谢方面是关键物质，它在高能化合物的转换过程中起到枢纽作用(见图1)。
(1)氧化磷酸化反应； (2)腺苷酸激酶(能荷)； (3)肌酸激酶(CK)
图1 机体内ATP的主要来源、调节与储存
我们试从能量的生成、储存和调节3个途径探讨补气与理气中药对慢性缺氧鼠的作用，结果表明：补气药的作用趋势是降低耗氧速度与呼吸控制率，升高肌酸激酶活力与肝细胞能荷值；理气药的作用趋势是升高耗氧速度、呼吸控制率和肌酸激酶活力，降低肝细胞能荷值。补气药与理气药仅对三项指标中能荷值的作用差异明显。
, 百拇医药
补气药与理气药对能量的生成和储存的影响程度存在着强弱之分。人参、黄芪组的耗氧速度与呼吸控制率显著低于模型组，且其氧化磷酸化反应线型表现一定程度的解偶联现象，呼吸控制率降低，表示ATP的生成减少，能量则以热的形式散布。这种现象符合前人对人参的体外研究报告[4]。人参、黄芪出现这种解偶联现象可解释其温煦四肢、改善外周微循环的调理作用，但党参、白术及各理气药组则很少出现解偶联现象。也有文献指出，人参皂甙具有抗缺氧作用[5]，人参茎叶黄酮能明显降低麻醉狗的耗氧量，能提高小鼠常压、低压的耐缺氧能力[6]。人参、黄芪使线粒体的耗氧速度降低可能与其抗缺氧作用相适应，这对机体是一种保护性适应。
ATP是机体内生物能源的瞬时供体，不能储存，仅磷酸肌酸是可以储存的。肌酸激酶可逆性催化磷酸肌酸(phosphocreatine, PCr)生成ATP与肌酸(Creatine,Cr)，它主要分布在骨骼肌、心肌及大脑等组织中[7]，当ATP供应不足，该酶可代偿性补充能量需求。补气药和理气药均可增加肌酸激酶活力，且理气药增加的幅度大于补气药，缺氧模型使能量合成受到阻碍，ATP生成减少；理气药很可能是通过激活肌酸激酶的活性而调整体内的能量储备(PCr)，以补偿机体能量的不足；补气药在增加能荷的同时，亦增加肌酸激酶活力，所以其对体内能量状态的改善可能要优于理气药。
, 百拇医药
能荷是动态调节细胞能量平衡的一个参数[8]，ATP是生命活动过程中首要的能源物质，也是细胞进行各种生命活动过程的直接能源，ATP被描述为机体内生物能的“通用货币”。机体没有储存ATP和O2的能力，在生理和应急状态下，能荷值通过腺苷酸激酶对能量代谢起短暂可逆性调节作用：AMP+ATP
2ADP。本实验所选用的四味补气药均能不同程度地升高肝细胞能荷值，其中人参和党参的作用较为显著。四味理气药均降低能荷值，差异显著。这一结果说明，补气药可使机体能量供应不足的状态得以改善；而理气药的作用与其恰恰相反，这可能是补气药与理气药对能荷影响的差异所在。
* 教育部博士学科点专项科研基金资助；日本养命酒制造公司中央研究所资助课题
作者简介：李兴泰，男，32岁，在读医学博士生
, 百拇医药
参考文献
1 Estabrook RW. Mitochondrial respiratory control and the polarographic measurement of ADP:0 ratios. Methods Enzymol, 1967,10:41～47
2 Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976,72(1):248～254
3 张家俊，刘春梅，陈文为.补气、理气中药对大鼠肝细胞能荷的影响.中西医结合杂志，1988，8(8)：477～478
, 百拇医药
4 邱洪法，陈文为，薛 延，等.气血实质的探讨：四种中药和生脉液对鼠肝线粒体(体外)氧化磷酸化的影响.中西医结合杂志，1981，1(1)：32～35
5 吴克媛，罗顺德.人参茎、叶皂甙研究概况.中成药研究，1987，(8)：36～38
6 张宝凤，杨志博，王 兰，等.人参茎叶黄酮抗心肌缺血作用的研究.中草药，1988，19(12)：21～22
7 Boehm EA, Radda GK, Tomlin H, et al. The utilisation of creatine and its analogues by cytosolic and mitochondrial creatine kinase. Biochim Biophys Acta, 1996,1274:119～128
8 Lubert Stryer. Biochemistry (3rd ed). New York： W.H.Freeman and Company， 1988.326
(收稿日期：1998-11-20), 百拇医药
单位：李兴泰 张家俊 陈文为(北京中医药大学中心实验室 北京100029)；堀口贞次郎 江崎宣久(日本养命酒制造公司中央研究所 日本长野)
关键词：补气药；理气药；慢性缺氧；能量代谢；能荷值；氧化磷酸化
北京中医药大学学报990313 摘 要：从能量的生成、储存和调节3个途径探讨配伍方剂常用的补气药(人参、黄芪、党参、白术)与理气药(枳实、厚朴、青皮、乌药)的作用。实验发现：①能量的生成：补气药人参、黄芪可降低耗氧速度与呼吸控制率，而党参、白术的作用不明显，理气药总的趋势是升高耗氧速度与呼吸控制率；②能量的储存：补气与理气药均显著升高肌酸激酶活力，而理气药又明显高于补气药；③能量的调节：补气药均可增加肝细胞能荷值，而理气药则降低能荷值。
An Approach to the Qi-Invigorating and Qi-Regulating Roles of Herbal Medicines on Energy Metabolism of Chronic Hypoxic Mice
, http://www.100md.com
Li Xingtai, Zhang Jiajun, Chen Wenwei, et al.
(The Central Laboratory of Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT: The roles of qi-invigorating herbal medicine (QIHM) and qi-regulating herbal medicine (QRHM), widely used in prescriptions, are discussed from the perspectives of production, storage and regulation of ATP. QIHM include Renshen(ginseng), Huangqi(Astragalus), Dangshen(Codonopsis) and Baizhu(white atractylodes rhizome); QRHM include Zhishi(immature bitter orange), Houpo(magnolia bark), Qingpi(green tangerine) and Wuyao(lindra root). The results show: 1. In the energy production, Renshen and Huangqi can decrease oxygen-consuming rate(S3) and respiratory control ratio(RCR), but Dangshen and Baizhu haven't obvious effects on them; QRHM tend to increase S3 and RCRgenerally. 2. In the energy storage, both QIHM and QRHM can stimulate activity of creatine kinase(CK) significantly, and QRHM is stronger than QIHM. 3. In the regulation of energy, all the four QIHM can increase the energy charge (EC); on the contrary, all the four QRHM can decrease the EC of liver cells.
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KEY WORDS: Qi-invigorating herbal medicine (QIHM); Qi-regulating herbal medicine (QRHM); Chronic hypoxia; Energy metabolism; Mitochondrion; Oxidative phosphorylation(OXPHOS)
中医学对“气分疾病”的诊治多是通过补气药与理气药配伍作用来实现的。为此，我们选用小鼠慢性缺氧模型诱导能量代谢障碍，分别观察补气与理气药对其作用的影响，试图从能量的生成、储存和调节3个途径探讨两类气分中药的作用，这将对充实补气与理气中药的药性和药理等中医药基础理论内容，及临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 中药制备
选择具有代表性的常用补气药：人参(红参)，黄芪，党参，白术；理气药：枳实，厚朴，青皮，乌药。上述各单味药均购自北京同仁堂药店，经北京中医药大学中药鉴定学专家李家实教授鉴定，分别煎制成含生药0.2g/mL的水提取液，置4℃冰箱保存备用。
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1.2 试剂与仪器
ATP，HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethane-sulfonic acid,N-2-羟乙基哌嗪
-N’-2-乙烷磺酸)均为Sigma公司产品，AMP和ADP分别为Boehringer Mannhein和Serva公司产品，CBBG-250(Coomassie Brilliant Blueg-250，考马斯亮蓝G-250)为Fluka公司产品，CK-NAC试剂盒(Creatine Kinase-NAC-activated,肌酸激酶-N-乙酰半胱氨酸激活的试剂盒)为北京中生生物工程高技术公司产品。其它试剂均为进口或国产分析纯。
20PR-52D型高速低温离心机与记录器为Hitachi公司产品，840型HPLC仪(高效液相色谱仪)和恒温水浴分别为美国Waters公司和德国Lauda公司产品，UV-120-02分光光度计为日本Shimadzu公司产品，CY-2型测氧仪购自上海华光仪器仪表厂。氧氮混合气体瓶由北京氦普北分气体工业有限公司供应。
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1.3 动物及分组
昆明种雄性小鼠，体重20～25g，4周龄，随机分为10组，各组小鼠数(n)参见表2。模型组及各给药(人参、黄芪、党参、白术、枳实、厚朴、青皮、乌药)组置于缺氧装置中，对照组常规条件下饲养(室内空气含21% O2)。
1.4 慢性缺氧模型的建立
用改装的塑料鼠笼(70cm×40cm×40cm)饲养小鼠，内放垫料、食物及钠石灰布袋(吸收鼠呼出的CO2)，笼壁上有数个孔供装置饮水瓶用，盖上有机玻璃板(90cm×50cm)，板面有3个孔(直径1cm)供进气、排气及测氧含量用。通入含10.5% O2、89.5% N2的混合气体，调节气体流量约为1.5L/min，以排除湿气及氨气的聚积。用测氧仪监测笼内氧含量，氧含量控制在10.5%左右(相当于海拔5 000米高度空气的含氧量)，温度控制在23～25℃，每日更换垫料、补充食物，各给药组每只小鼠灌胃中药水提取液1次(相当于80 mg生药)，保持缺氧环境8～10 d(亦是给药天数)。对照组置于敞口鼠笼内饲养，对照组及模型组小鼠分别灌胃等体积的生理盐水。
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1.5 测定方法
1.5.1 肝线粒体耗氧速度和呼吸控制率的测定
肝线粒体的提取按差速离心法，分离介质是0.25mol/L蔗糖，0.5mmol/L EDTA-Na2，3mmol/L HEPES,pH 7.0。线粒体呼吸功能用Clark氧电极法测定[1]，线粒体蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定[2]。反应系统为1.9mL基质液(0.225 mol/L蔗糖，1mmol/L EDTA，5mmol/L MgCl2，15mmol/L KCl，15mmol/L KH2PO4，50mmol/L Tris,5mmol/L L-谷氨酸，10mmol/L DL-苹果酸，pH 7.5)中加入100 μL新鲜的鼠肝线粒体悬液(约含10 mg蛋白)，总反应体积为2mL，于30℃测定线粒体的呼吸曲线(加入0.5 μmol ADP)。根据呼吸曲线求出呼吸态3(S3，加入ADP后耗氧速率)和呼吸态4(S4，ADP经氧化磷酸化反应生成ATP后的耗氧速率)，分别计算出S3即为耗氧速度，和S3/S4即为呼吸控制率(RCR)，该值变化可反映ATP生成情况。
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1.5.2 肌酸激酶(CK)活力的测定
采用肌酸激酶试剂盒测定酶活性。取鼠后腿肌肉用生理盐水制成1%匀浆，3 000 r/min离心10min，取上清液0.1mL于Eppendorf管内，加0.9mL生理盐水，测定时从中取出10 μL，加2.0mL预恒温至30℃的工作液，于30℃温育2.5min，以空气为对照，立刻倒入石英比色杯，于340nm记录吸光度(A)(此为初始值即A0min)，1min、2min、3min时分别精确读取A，并计算△A/min，按下式计算肌酸激酶活力：
注：Vt=反应总体积，Vs=样品体积，该条件下消光系数=6.3，C=测定样品所含蛋白量(mg)。
1.5.3 肝细胞能荷值(Energy Charge,EC)的测定
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用HPLC仪梯度洗脱，测定ATP、ADP和AMP的含量[3]。色谱柱：Waters Spherisorb C18填料，4.6mm×150mm不锈钢柱(中国科学院大连化学物理研究所填充)。流动相A液：0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH 6.0)，B液：为含10%甲醇的A液。梯度洗脱程序：0～3min为A液，3～6min内A液由100%→0，B液由0→100%，6～9min为B液，9min以后为A液，共运行12min。流速：0.8mL/min。检测波长254nm，柱温18～22℃。按以下公式计算能荷：
1.5.4 统计方法
因本实验分组较多，小鼠数量大，各组样本数多，难以同时完成全部各项指标的测定，所以严格控制同一操作条件分批进行，各组数据经t检验分析。
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2 结果
2.1 慢性缺氧模型的评估
本实验采用中等程度的慢性缺氧模型。结果：模型组与对照组比较，小鼠平均体重的增量(△W)、肝线粒体耗氧速度(S3)、呼吸控制率(RCR)、能荷(EC)均显著低于对照组(P<0.001)，仅肌酸激酶(CK)活力与对照组无显著性差异(见表1)。缺氧小鼠行为表现：最初烦躁，频频高跳；随后活动明显减少，呼吸急促，神疲乏力。
表1 模型组与对照组各项指标的比较 (
±s) 组别n
△W/g
S3/nmol/(min.mg)
, 百拇医药
S4/nmol/(min.mg)
RCR/S3/S4
CK/U/mg
EC
对照组
44
+6.12
81.5±19.8
20.7±2.2
3.94±1.07
2229±408
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0.748±0.058
模型组
40
+0.50
54.9±12.7***
19.3±2.0**
2.85±0.57***
2084±464
0.672±0.044***
注：与对照组比较**P<0.01 ***P<0.001 从小鼠体重看出，模型组小鼠的正常代谢与体重增长均明显受到缺氧抑制，平均仅增加0.50g，而对照组却增加6.12g。该模型显著降低线粒体的耗氧速度及呼吸控制率，说明线粒体呼吸链的电子传递速度受到明显的抑制，电子传递与氧化磷酸化之间偶联反应的“紧密程度”随之下降，ATP的生成速度减慢。但肌肉肌酸激酶活力未表现明显改变。能荷值的显著降低证明肝细胞的能量平衡状态发生改变，ATP的生成量减少而AMP的量增加，说明该缺氧模型可诱发能量代谢障碍。上述结果证实，控制氧供应所塑造的慢性缺氧模型是可以采用的。
, 百拇医药
2.2 补气与理气中药对肝线粒体耗氧速度(S3)、呼吸控制率(RCR)及肌酸激酶(CK)活力的影响
从线粒体耗氧速度分析，补气药组均不同程度地降低耗氧速度，以人参、黄芪较为明显。理气药组中厚朴、青皮、枳实均增加耗氧速度，以厚朴、青皮较为明显，乌药对耗氧速度影响不明显。其顺序如下：对照>厚朴>青皮>枳实>模型>白术>乌药>党参>黄芪>人参。
补气药组的呼吸控制率表现低于理气药组的趋势，以人参、黄芪降低幅度最大，理气药组中以乌药、青皮增加的幅度最大。其顺序如下，对照>乌药>青皮>厚朴>党参>模型>白术>枳实>黄芪>人参。
补气药与理气药均可显著增加肌酸激酶活力，理气药组又显著高于补气药组。其顺序如下：乌药>青皮>厚朴>枳实>白术>黄芪>人参>党参>对照>模型。
耗氧速率和呼吸控制率未表现出一致的趋势，而是局部交叉的(白术的耗氧速度与乌药交叉，党参、白术的呼吸控制率与枳实交叉)(见表2)。
, 百拇医药
表2 补气与理气药对鼠S3、S4、RCR及CK活力的影响 〔nmol/(min.mg);
±s〕 组别n
S3
S4
RCR/S3/S4
CK/U/mg
对照
44
81.5±19.8***
, 百拇医药
20.7±2.2**
3.94±1.07***
2229±408
模型
40
54.9±12.7
19.3±2.0
2.85±0.57
2084±464
人参
20
44.5±11.7**
, 百拇医药
18.3±1.9
2.43±0.42**
2493±399***
黄芪
21
44.8±9.2***
18.4±1.8
2.44±0.48**
2512±323***
党参
19
, 百拇医药
53.0±15.9**
17.8±2.3*
2.98±0.60
2452±405**
白术
19
53.7±12.0
19.0±2.2
2.83±0.55
2558±467**
枳实
, 百拇医药
21
59.5±9.9**
21.6±2.3**
2.76±0.62
2903±323**
厚朴
20
69.0±12.4***
20.8±2.2**
3.32±0.70*
, 百拇医药 3167±472***
青皮
19
66.5±11.8**
19.1±2.2
3.48±0.86*
3173±463***
乌药
20
53.1±21.0
13.9±2.5***
, 百拇医药
3.82±0.95***
3256±344***
注：与模型组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.0012.3 补气与理气中药对小鼠体重(△W)与肝细胞能荷(EC)的影响
结果见表3。
表3 补气与理气药对小鼠体重及EC的影响 (
±s) 组别n
△W/g
EC
对照
, 百拇医药
44
+6.12
0.748±0.058***
模型
40
+0.50
0.672±0.044
人参
20
+2.29
0.712±0.039***
黄芪
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21
+1.13
0.676±0.035
党参
19
+0.25
0.701±0.052*
白术
19
+1.10
0.689±0.055
枳实
, 百拇医药 21
-1.28
0.637±0.053**
厚朴
20
-0.67
0.635±0.064*
青皮
19
+0.32
0.636±0.065*
乌药
, 百拇医药
20
-0.19
0.605±0.074**
注：与对照组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001 表3所示，补气药组小鼠的体重增加量高于缺氧模型组，而模型组又高于理气药组，理气药各组体重几乎均减轻。其中以补气药人参组体重增加最多，理气药枳实组体重减轻最多。其顺序如下：对照>人参>黄芪>白术>模型>青皮>党参>乌药>厚朴>枳实。
补气药均可增加肝细胞能荷值，其中以人参、党参较为明显，白术、黄芪次之；理气药均降低能荷值，并有显著性差异，以乌药降低幅度最大。其顺序如下：对照>人参>党参>白术>黄芪>模型>枳实>青皮>厚朴>乌药。
3 讨论
, 百拇医药 在正常生理情况下，机体ATP主要由ADP经氧化磷酸化反应生成；在应急状态下，ATP亦可由ADP与磷酸肌酸经肌酸激酶催化途径获得补充，或由ADP经腺苷酸激酶催化反应而得到代偿性调节补充，可见ADP在能量代谢方面是关键物质，它在高能化合物的转换过程中起到枢纽作用(见图1)。
(1)氧化磷酸化反应； (2)腺苷酸激酶(能荷)； (3)肌酸激酶(CK)
图1 机体内ATP的主要来源、调节与储存
我们试从能量的生成、储存和调节3个途径探讨补气与理气中药对慢性缺氧鼠的作用，结果表明：补气药的作用趋势是降低耗氧速度与呼吸控制率，升高肌酸激酶活力与肝细胞能荷值；理气药的作用趋势是升高耗氧速度、呼吸控制率和肌酸激酶活力，降低肝细胞能荷值。补气药与理气药仅对三项指标中能荷值的作用差异明显。
, 百拇医药
补气药与理气药对能量的生成和储存的影响程度存在着强弱之分。人参、黄芪组的耗氧速度与呼吸控制率显著低于模型组，且其氧化磷酸化反应线型表现一定程度的解偶联现象，呼吸控制率降低，表示ATP的生成减少，能量则以热的形式散布。这种现象符合前人对人参的体外研究报告[4]。人参、黄芪出现这种解偶联现象可解释其温煦四肢、改善外周微循环的调理作用，但党参、白术及各理气药组则很少出现解偶联现象。也有文献指出，人参皂甙具有抗缺氧作用[5]，人参茎叶黄酮能明显降低麻醉狗的耗氧量，能提高小鼠常压、低压的耐缺氧能力[6]。人参、黄芪使线粒体的耗氧速度降低可能与其抗缺氧作用相适应，这对机体是一种保护性适应。
ATP是机体内生物能源的瞬时供体，不能储存，仅磷酸肌酸是可以储存的。肌酸激酶可逆性催化磷酸肌酸(phosphocreatine, PCr)生成ATP与肌酸(Creatine,Cr)，它主要分布在骨骼肌、心肌及大脑等组织中[7]，当ATP供应不足，该酶可代偿性补充能量需求。补气药和理气药均可增加肌酸激酶活力，且理气药增加的幅度大于补气药，缺氧模型使能量合成受到阻碍，ATP生成减少；理气药很可能是通过激活肌酸激酶的活性而调整体内的能量储备(PCr)，以补偿机体能量的不足；补气药在增加能荷的同时，亦增加肌酸激酶活力，所以其对体内能量状态的改善可能要优于理气药。
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能荷是动态调节细胞能量平衡的一个参数[8]，ATP是生命活动过程中首要的能源物质，也是细胞进行各种生命活动过程的直接能源，ATP被描述为机体内生物能的“通用货币”。机体没有储存ATP和O2的能力，在生理和应急状态下，能荷值通过腺苷酸激酶对能量代谢起短暂可逆性调节作用：AMP+ATP
2ADP。本实验所选用的四味补气药均能不同程度地升高肝细胞能荷值，其中人参和党参的作用较为显著。四味理气药均降低能荷值，差异显著。这一结果说明，补气药可使机体能量供应不足的状态得以改善；而理气药的作用与其恰恰相反，这可能是补气药与理气药对能荷影响的差异所在。* 教育部博士学科点专项科研基金资助；日本养命酒制造公司中央研究所资助课题
作者简介：李兴泰，男，32岁，在读医学博士生
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参考文献
1 Estabrook RW. Mitochondrial respiratory control and the polarographic measurement of ADP:0 ratios. Methods Enzymol, 1967,10:41～47
2 Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976,72(1):248～254
3 张家俊，刘春梅，陈文为.补气、理气中药对大鼠肝细胞能荷的影响.中西医结合杂志，1988，8(8)：477～478
, 百拇医药
4 邱洪法，陈文为，薛 延，等.气血实质的探讨：四种中药和生脉液对鼠肝线粒体(体外)氧化磷酸化的影响.中西医结合杂志，1981，1(1)：32～35
5 吴克媛，罗顺德.人参茎、叶皂甙研究概况.中成药研究，1987，(8)：36～38
6 张宝凤，杨志博，王 兰，等.人参茎叶黄酮抗心肌缺血作用的研究.中草药，1988，19(12)：21～22
7 Boehm EA, Radda GK, Tomlin H, et al. The utilisation of creatine and its analogues by cytosolic and mitochondrial creatine kinase. Biochim Biophys Acta, 1996,1274:119～128
8 Lubert Stryer. Biochemistry (3rd ed). New York： W.H.Freeman and Company， 1988.326
(收稿日期：1998-11-20), 百拇医药