p16、Ki－67和PCNA的表达与胃肠道平滑肌肿瘤性质的关系
作者：孙威 王强 王明德 张凤祥 王东民 黄岩
单位：孙威(中国医科大学第二临床学院外科，沈阳市 110003)；王强(中国医科大学第二临床学院外科，沈阳市 110003)；王明德(中国医科大学第二临床学院外科，沈阳市 110003)；张凤祥(辽宁省西丰县人民医院外科)；王东民(辽宁省铁岭市第二人民医院外科)；黄岩(沈阳市大东区医院外科)
关键词：胃肠肿瘤平滑肌瘤平滑肌肉瘤抑癌基因p16人抗增殖细胞核抗原Ki-67增殖细胞核抗原
摘要
摘要：目的：探讨p16、Ki-67和PCNA的表达与胃肠道平滑肌肿瘤(gastrointestinal smooth muscle tumors,GISMT)性质的关系。方法：采用免疫组织化学S-P法检测86例GISMT患者p16的表达情况,采用微波修复抗原及免疫组织化学S-P法检测人抗增殖细胞核抗原Ki-67及增殖细胞核抗原(proliferating cell nucle arantigen,PCNA)来反映细胞的增殖活性。结果：p16表达按平滑肌瘤、平滑肌肉瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级的顺序依次明显下降(P<0.01)。同时，p16的表达与肿瘤的良恶性生长方式、肿瘤大小、中心有无坏死亦有明显的关系(P<0.01或P<0.05)。p16阳性表达组5年生存率明显高于阴性表达组(P<0.05)。p16阴性表达组的Ki-67和PCNA表达明显高于阳性表达组(P<0.01)。结论：p16可考虑是反映GISMT某些生物学特性的良好标志物，可以用来判断其某些生物学特性、估计预后、指导制定合理的治疗方案。p16与Ki-67、PCNA可以互补作为判断GISMT良恶性、恶性程度、转移及预后的参考指标。
, 百拇医药
Relationship between the Expression of p16,Ki-67,PCNA and Activity of Cell Proliferation in G-I Tract Leiomyomas
Sun Wei Wang Qiang Wang Mingde et al
(Department of Surgery,Second Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang)
Abstract Objective:To study the relationship between the expression of p16,Ki-67,PCNA and the activity of cell proliferation in G-I tract leiomyomas.Methods:The p16 expression in 86 cases of G-I tract leiomyoma were determined by immunohistochemical staining S-P method and the expression of Ki-67,PCNA were evaluated by microwave retrieval antigen and immunohistochemical S-P method to reflect the cell proliferative activity.Results:The expression of p16 declined significantly according to the following order:leiomyoma,leiomyosarcomas of grade Ⅰ ,Ⅱ ,Ⅲ (P<0.01).Meantime,the expression of p16 was prominently delermined by the growing pattern (benign or malignant),size of the tumor,with or without central nectrosis (P<0.01 or P<0.05).The 5-year survival rate was significantly higher in patients with positive p16 expression than those with negative expression (P<0.05).The Ki-67 and PCNA expression of the p16 negative group was significantly higher that of the p16 positive group (P<0.01).Conclusion:p16 is a valuable indicator of some biological characteristics of G-I tract leiomyomas and it can be used to predict the prognosis,to guide the planning of retional therapeutic scheme.The expression of p16 and Ki-67,PCNA have reciprocity in distinguishing malignancies from the benign tumors,judging the maligmant degree,and predicting the prognosis.
, 百拇医药
Key Words Gastrointestinal neoplasm Leiomyoma Leiomyosarcoma p16 gene Ki-67 PCNA
应用免疫组织化学S-P法检测了86例胃肠道平滑肌肿瘤(gastrointestinal smooth muscle tumors,GISMT)患者中p16的表达情况,并结合临床病理、预后指标及反映细胞增殖活性的指标:人抗增殖细胞核抗原Ki-67,增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)进行综合分析,以探讨其临床病理及预后价值。
1 材料与方法
1.1 临床病理资料
从中国医科大学第二临床学院1977年～1996年4月间手术切除的GISMT病例中选择诊断明确，病历完整者86例。其中男性49例，女性37例。年龄1～77岁，平均48.6岁。肿瘤发生于食管11例，胃30例，小肠27例，结直肠18例。根据镜下观察，选择细胞生长活跃区连续计数30个高倍视野(HPF)，确定每10个HPF平均核分裂数；细胞异型性分为0～+++；细胞密度分为+～+++。按Evans[1]和He等[2]的标准(核分裂数≥1个/10HPF即为恶性)来区分平滑肌瘤(leiomyoma,LM)、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma,LS)。LS组织学分级参考Patrick等[3]的标准,其中LM25例；LSⅠ级(LS-Ⅰ)26例，Ⅱ级(LS-Ⅱ)20例，Ⅲ级(LS-Ⅲ)15例。根据大体病理特征LS分为：恶性生长方式组(肿瘤有周围浸润、种植或转移)40例；良性生长方式组(肿瘤无周围浸润、种植或转移)21例。肿瘤直径0.3～5.9cm组15例;≥6cm组46例。肿瘤中心有坏死组38例;无坏死组23例。本组86例GISMT中，除3例因其它原因死亡外，其余83例随访资料完整，随访时间为12～242个月，平均58个月。
, http://www.100md.com
所有标本均经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，常规连续切片，分别做HE染色，Ki-67采用微波修复抗原与免疫组化染色。p16,PCNA采用免疫组织化学染色。
1.2 主要试剂
鼠抗p16多抗和鼠抗Ki-67单抗(MIB-1),鼠抗PCNA单抗PC10及S-P试验盒均购自福州迈新生物制品公司。
1.3 染色方法
p16、PCNA染色均采用免疫组织化学S-P法。Ki-67染色采用微波修复抗原及免疫组织化学S-P法。
1.4 结果判定
PCNA、Ki-67结果判定:以细胞核呈棕红色或细胞核、细胞浆同时呈棕红色为阳性；单纯细胞浆着色而细胞核无着色，或细胞核，细胞浆均无着色为阴性，于40倍光镜下10个视野计数，每个视野计数100个细胞，则标记值:为阳性细胞总和/1000×100%。
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p16结果判定：以细胞浆呈清晰红色为阳性判定标准。根据着色浓度分为：强阳性+++，呈深红色；弱阳性+，呈淡红色；界于两者之间++；以细胞不着色或与背景一致为阴性(-)。
对照：同已知阳性片对照。
1.5 数据处理
采用χ2检验、t检验。患者生存率分析采用Kaplan-Meire寿命表法及Log-rank检验。
2 结果
2.1 p16表达与GISMT临床病理特征的关系
随着GISMT良恶的改变及恶性程度的增高，p16表达率依次明显递减(P<0.05)。另外，LS中p16阳性表达率与肿瘤良恶性生长方式、肿瘤大小、肿瘤中心有无坏死，亦有明显的关系。详见附表。
, 百拇医药
附表p16表达与GISMT临床病理特征的关系
临床病理特征
例数
p16表达
P值
-
+
++
+++
阳性率(%)
分类分级
LM
25
, http://www.100md.com
0
3
8
14
100.00
LS-Ⅰ
26
6
4
10
6
76.92
LS-Ⅱ
20
, http://www.100md.com
11
5
4
0
45.00
LS-Ⅲ
15
14
1
0
0
6.67
<0.05
LS的生长方式
, http://www.100md.com
良性
21
5
3
9
4
76.19
恶性
40
25
7
6
2
37.50
, 百拇医药
<0.01
LS的直径(cm)
0.3～5.9
15
3
3
5
4
80.00
≥6
46
27
8
, http://www.100md.com
9
2
41.30
<0.01
LS中心坏死
无
23
7
4
7
5
69.57
有
38
, 百拇医药
23
7
7
1
39.47
<0.05
2.2 p16表达与GISMT患者预后的关系
p16表达阳性组5年生存率为70.48%；阴性组5年生存率为36.25%。两组间存在显著性差异(P<0.05)。
2.3 p16表达与Ki-67、PCNA表达之间的关系(x±s)
p16阳性表达的Ki-67标记值为3.25±2.47，阴性表达组Ki-67标记值为7.47±3.05,两组间差异有极显著意义(P<0.01)。p16阳性表达的PCNA标记值为11.11±6.22，阴性表达组PCNA标记值为21.92±9.01,两组间差异有极显著意义 (P<0.01)。
, 百拇医药
3 讨论
p16基因是位于人9号染色体的P21区域。Roe等[4]在研究细胞周期时发现，细胞进入分裂周期依赖于周期蛋白依赖性激酶(cdks,cyclin)的活化，cdks只有与周期蛋白结合才被激活。今发现p16可直接作用于cdk4，cyclinD和P110RB的反馈回路，通过调节P110RB蛋白活性防止细胞增殖，故称依赖性细胞周期蛋白激酶(cdk4)抑制剂。
p16基因突变在人恶性肿瘤中相当普遍[5]。本研究结果显示：GISMT中从LM到LSⅠ、Ⅱ、Ⅲ，随着组织分级的升高，阳性表达率依次下降(P<0.05)。在LS中较大肿瘤、中心有坏死、恶性生长方式组中p16表达率明显低于相应对照组。因而说明p16基因在GISMT的增殖、分化及复发、转移过程中起着重要的负性调控作用。随访结果提示p16阳性表达组的5年生存率较阴性表达组高(P<0.05)。说明检测p16在GISMT中的表达情况，有助于进一步了解GISMT的生物学行为，并可作为判断预后的一项指标。
, http://www.100md.com
Ki-67是由Gerdes等[6]于1983年首次制备成功，它存在于增殖细胞当中，在静止细胞则不表达。微波修复抗原方法的出现[7]，使Ki-67的应用范围明显扩大了。PCNA是36KD的核蛋白,是DNA多聚酶的一种辅助蛋白。PCNA在G0细胞中含量很少,G1晚期开始增加,S期达到高峰,G2期和M期开始下降,是评价细胞增殖状态的重要指标。在多种肿瘤的研究中,人们发现PCNA表达与肿瘤的生物学特性、预后有良好的相关性。
目前认为Ki-67、PCNA均是反映增生活性的单抗，而p16则是最近发现的一种新型抑癌基因；Ki-67、PCNA均是反映增殖的直接指标，而p16则是一种间接的指标。本研究发现该两种指标在随着恶性程度的升高的同时，它们的表达呈相反趋势。在p16表达阳性与阴性组的Ki-67,PCNA表达均有显著差异(P<0.01)。p16的缺失使其对细胞增殖的负性调控作用下降或消失，细胞增殖过度，表现为Ki-67、PCNA表达的明显升高。因此有理由认为Ki-67、PCNA高表达而p16阴性表达的GISMT恶性程度很高，预后非常差。
, 百拇医药
(李梦兰 校对)
本文课题受辽宁省自然科学基金资助(课题号:972254)
参 考 文 献
1，Evans HL.Smooth muscle tumors of the gastrointestinal tract:a study of 56 cases followed for a minimum of 10 years.Cancer,1985,56:2242～50
2，He LJ,Wang BS,Chen CC.Smooth muscle tumors of the digestive tract:Report of 160 cases.Br J Surg,1988,75:184～6
3，Patrick CM,James PN,Walter L,et al.Gastrointestinal Sarcomas:Analysis of prognostic factors.Ann Surg,1987;2060:706～10
, 百拇医药
4，Roe JL ,Rivin CJ ,Sessions RA,et al.The tousled gene in A.Thaliana encodes a protein kinase homolog that is required for leaf and flower development.Cell,1993,75:939～50
5，Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994,264:436～40
6，Gerdes J,Schwab U,Lemke H,et al.Production of A mouse monocolonal antibody reactive with a human nuclear antigen associate with cell proliferation.Int.J.Cancer,1983,31:13～20
7，Shi SR ,Key ME ,Kalra KL.Antigen retrieval in formalin-fixed,paraffin-embedded tissues:An enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections.J histochemistry and cytochemistry,1991,6:41～48
1999-06-25收稿
1999-11-26修回, 百拇医药
单位：孙威(中国医科大学第二临床学院外科，沈阳市 110003)；王强(中国医科大学第二临床学院外科，沈阳市 110003)；王明德(中国医科大学第二临床学院外科，沈阳市 110003)；张凤祥(辽宁省西丰县人民医院外科)；王东民(辽宁省铁岭市第二人民医院外科)；黄岩(沈阳市大东区医院外科)
关键词：胃肠肿瘤平滑肌瘤平滑肌肉瘤抑癌基因p16人抗增殖细胞核抗原Ki-67增殖细胞核抗原
摘要
摘要：目的：探讨p16、Ki-67和PCNA的表达与胃肠道平滑肌肿瘤(gastrointestinal smooth muscle tumors,GISMT)性质的关系。方法：采用免疫组织化学S-P法检测86例GISMT患者p16的表达情况,采用微波修复抗原及免疫组织化学S-P法检测人抗增殖细胞核抗原Ki-67及增殖细胞核抗原(proliferating cell nucle arantigen,PCNA)来反映细胞的增殖活性。结果：p16表达按平滑肌瘤、平滑肌肉瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级的顺序依次明显下降(P<0.01)。同时，p16的表达与肿瘤的良恶性生长方式、肿瘤大小、中心有无坏死亦有明显的关系(P<0.01或P<0.05)。p16阳性表达组5年生存率明显高于阴性表达组(P<0.05)。p16阴性表达组的Ki-67和PCNA表达明显高于阳性表达组(P<0.01)。结论：p16可考虑是反映GISMT某些生物学特性的良好标志物，可以用来判断其某些生物学特性、估计预后、指导制定合理的治疗方案。p16与Ki-67、PCNA可以互补作为判断GISMT良恶性、恶性程度、转移及预后的参考指标。
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Relationship between the Expression of p16,Ki-67,PCNA and Activity of Cell Proliferation in G-I Tract Leiomyomas
Sun Wei Wang Qiang Wang Mingde et al
(Department of Surgery,Second Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang)
Abstract Objective:To study the relationship between the expression of p16,Ki-67,PCNA and the activity of cell proliferation in G-I tract leiomyomas.Methods:The p16 expression in 86 cases of G-I tract leiomyoma were determined by immunohistochemical staining S-P method and the expression of Ki-67,PCNA were evaluated by microwave retrieval antigen and immunohistochemical S-P method to reflect the cell proliferative activity.Results:The expression of p16 declined significantly according to the following order:leiomyoma,leiomyosarcomas of grade Ⅰ ,Ⅱ ,Ⅲ (P<0.01).Meantime,the expression of p16 was prominently delermined by the growing pattern (benign or malignant),size of the tumor,with or without central nectrosis (P<0.01 or P<0.05).The 5-year survival rate was significantly higher in patients with positive p16 expression than those with negative expression (P<0.05).The Ki-67 and PCNA expression of the p16 negative group was significantly higher that of the p16 positive group (P<0.01).Conclusion:p16 is a valuable indicator of some biological characteristics of G-I tract leiomyomas and it can be used to predict the prognosis,to guide the planning of retional therapeutic scheme.The expression of p16 and Ki-67,PCNA have reciprocity in distinguishing malignancies from the benign tumors,judging the maligmant degree,and predicting the prognosis.
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Key Words Gastrointestinal neoplasm Leiomyoma Leiomyosarcoma p16 gene Ki-67 PCNA
应用免疫组织化学S-P法检测了86例胃肠道平滑肌肿瘤(gastrointestinal smooth muscle tumors,GISMT)患者中p16的表达情况,并结合临床病理、预后指标及反映细胞增殖活性的指标:人抗增殖细胞核抗原Ki-67,增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)进行综合分析,以探讨其临床病理及预后价值。
1 材料与方法
1.1 临床病理资料
从中国医科大学第二临床学院1977年～1996年4月间手术切除的GISMT病例中选择诊断明确，病历完整者86例。其中男性49例，女性37例。年龄1～77岁，平均48.6岁。肿瘤发生于食管11例，胃30例，小肠27例，结直肠18例。根据镜下观察，选择细胞生长活跃区连续计数30个高倍视野(HPF)，确定每10个HPF平均核分裂数；细胞异型性分为0～+++；细胞密度分为+～+++。按Evans[1]和He等[2]的标准(核分裂数≥1个/10HPF即为恶性)来区分平滑肌瘤(leiomyoma,LM)、平滑肌肉瘤(leiomyosarcoma,LS)。LS组织学分级参考Patrick等[3]的标准,其中LM25例；LSⅠ级(LS-Ⅰ)26例，Ⅱ级(LS-Ⅱ)20例，Ⅲ级(LS-Ⅲ)15例。根据大体病理特征LS分为：恶性生长方式组(肿瘤有周围浸润、种植或转移)40例；良性生长方式组(肿瘤无周围浸润、种植或转移)21例。肿瘤直径0.3～5.9cm组15例;≥6cm组46例。肿瘤中心有坏死组38例;无坏死组23例。本组86例GISMT中，除3例因其它原因死亡外，其余83例随访资料完整，随访时间为12～242个月，平均58个月。
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所有标本均经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，常规连续切片，分别做HE染色，Ki-67采用微波修复抗原与免疫组化染色。p16,PCNA采用免疫组织化学染色。
1.2 主要试剂
鼠抗p16多抗和鼠抗Ki-67单抗(MIB-1),鼠抗PCNA单抗PC10及S-P试验盒均购自福州迈新生物制品公司。
1.3 染色方法
p16、PCNA染色均采用免疫组织化学S-P法。Ki-67染色采用微波修复抗原及免疫组织化学S-P法。
1.4 结果判定
PCNA、Ki-67结果判定:以细胞核呈棕红色或细胞核、细胞浆同时呈棕红色为阳性；单纯细胞浆着色而细胞核无着色，或细胞核，细胞浆均无着色为阴性，于40倍光镜下10个视野计数，每个视野计数100个细胞，则标记值:为阳性细胞总和/1000×100%。
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p16结果判定：以细胞浆呈清晰红色为阳性判定标准。根据着色浓度分为：强阳性+++，呈深红色；弱阳性+，呈淡红色；界于两者之间++；以细胞不着色或与背景一致为阴性(-)。
对照：同已知阳性片对照。
1.5 数据处理
采用χ2检验、t检验。患者生存率分析采用Kaplan-Meire寿命表法及Log-rank检验。
2 结果
2.1 p16表达与GISMT临床病理特征的关系
随着GISMT良恶的改变及恶性程度的增高，p16表达率依次明显递减(P<0.05)。另外，LS中p16阳性表达率与肿瘤良恶性生长方式、肿瘤大小、肿瘤中心有无坏死，亦有明显的关系。详见附表。
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附表p16表达与GISMT临床病理特征的关系
临床病理特征
例数
p16表达
P值
-
+
++
+++
阳性率(%)
分类分级
LM
25
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0
3
8
14
100.00
LS-Ⅰ
26
6
4
10
6
76.92
LS-Ⅱ
20
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11
5
4
0
45.00
LS-Ⅲ
15
14
1
0
0
6.67
<0.05
LS的生长方式
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良性
21
5
3
9
4
76.19
恶性
40
25
7
6
2
37.50
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<0.01
LS的直径(cm)
0.3～5.9
15
3
3
5
4
80.00
≥6
46
27
8
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9
2
41.30
<0.01
LS中心坏死
无
23
7
4
7
5
69.57
有
38
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23
7
7
1
39.47
<0.05
2.2 p16表达与GISMT患者预后的关系
p16表达阳性组5年生存率为70.48%；阴性组5年生存率为36.25%。两组间存在显著性差异(P<0.05)。
2.3 p16表达与Ki-67、PCNA表达之间的关系(x±s)
p16阳性表达的Ki-67标记值为3.25±2.47，阴性表达组Ki-67标记值为7.47±3.05,两组间差异有极显著意义(P<0.01)。p16阳性表达的PCNA标记值为11.11±6.22，阴性表达组PCNA标记值为21.92±9.01,两组间差异有极显著意义 (P<0.01)。
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3 讨论
p16基因是位于人9号染色体的P21区域。Roe等[4]在研究细胞周期时发现，细胞进入分裂周期依赖于周期蛋白依赖性激酶(cdks,cyclin)的活化，cdks只有与周期蛋白结合才被激活。今发现p16可直接作用于cdk4，cyclinD和P110RB的反馈回路，通过调节P110RB蛋白活性防止细胞增殖，故称依赖性细胞周期蛋白激酶(cdk4)抑制剂。
p16基因突变在人恶性肿瘤中相当普遍[5]。本研究结果显示：GISMT中从LM到LSⅠ、Ⅱ、Ⅲ，随着组织分级的升高，阳性表达率依次下降(P<0.05)。在LS中较大肿瘤、中心有坏死、恶性生长方式组中p16表达率明显低于相应对照组。因而说明p16基因在GISMT的增殖、分化及复发、转移过程中起着重要的负性调控作用。随访结果提示p16阳性表达组的5年生存率较阴性表达组高(P<0.05)。说明检测p16在GISMT中的表达情况，有助于进一步了解GISMT的生物学行为，并可作为判断预后的一项指标。
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Ki-67是由Gerdes等[6]于1983年首次制备成功，它存在于增殖细胞当中，在静止细胞则不表达。微波修复抗原方法的出现[7]，使Ki-67的应用范围明显扩大了。PCNA是36KD的核蛋白,是DNA多聚酶的一种辅助蛋白。PCNA在G0细胞中含量很少,G1晚期开始增加,S期达到高峰,G2期和M期开始下降,是评价细胞增殖状态的重要指标。在多种肿瘤的研究中,人们发现PCNA表达与肿瘤的生物学特性、预后有良好的相关性。
目前认为Ki-67、PCNA均是反映增生活性的单抗，而p16则是最近发现的一种新型抑癌基因；Ki-67、PCNA均是反映增殖的直接指标，而p16则是一种间接的指标。本研究发现该两种指标在随着恶性程度的升高的同时，它们的表达呈相反趋势。在p16表达阳性与阴性组的Ki-67,PCNA表达均有显著差异(P<0.01)。p16的缺失使其对细胞增殖的负性调控作用下降或消失，细胞增殖过度，表现为Ki-67、PCNA表达的明显升高。因此有理由认为Ki-67、PCNA高表达而p16阴性表达的GISMT恶性程度很高，预后非常差。
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(李梦兰 校对)
本文课题受辽宁省自然科学基金资助(课题号:972254)
参 考 文 献
1，Evans HL.Smooth muscle tumors of the gastrointestinal tract:a study of 56 cases followed for a minimum of 10 years.Cancer,1985,56:2242～50
2，He LJ,Wang BS,Chen CC.Smooth muscle tumors of the digestive tract:Report of 160 cases.Br J Surg,1988,75:184～6
3，Patrick CM,James PN,Walter L,et al.Gastrointestinal Sarcomas:Analysis of prognostic factors.Ann Surg,1987;2060:706～10
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4，Roe JL ,Rivin CJ ,Sessions RA,et al.The tousled gene in A.Thaliana encodes a protein kinase homolog that is required for leaf and flower development.Cell,1993,75:939～50
5，Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994,264:436～40
6，Gerdes J,Schwab U,Lemke H,et al.Production of A mouse monocolonal antibody reactive with a human nuclear antigen associate with cell proliferation.Int.J.Cancer,1983,31:13～20
7，Shi SR ,Key ME ,Kalra KL.Antigen retrieval in formalin-fixed,paraffin-embedded tissues:An enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections.J histochemistry and cytochemistry,1991,6:41～48
1999-06-25收稿
1999-11-26修回, 百拇医药