Norplant皮下埋植后子宫内膜形态和雌、孕激素受体含量的变化
作者：王桂敏 郑淑蓉 范正红
单位：100034 北京医科大学第一医院妇产科[王桂敏(现在河北医科大学解剖教研室)，郑淑蓉，范正红]
关键词：左炔诺孕酮；子宫内膜；受体；孕酮；受体；雌激素；子宫出血
中华妇产科杂志980814 【摘要】 目的 探讨Norplant皮下埋植后子宫内膜形态和雌、孕激素受体(ER、PR)含量的变化与子宫异常出血的关系。方法 应用免疫组化、Western Blot和原位杂交技术结合计算机图像分析，观察16例Norplant皮下埋植后和23例正常周期的内膜的形态学改变、细胞增殖状态及ER、PR蛋白及其mRNA的表达。结果 埋植Norplant后，内膜DNA含量降低；螺旋动脉数量减少，腺体的构成比例降低；腺体构成比例与雌二醇(E2)水平呈正相关，与子宫异常出血呈负相关，与年龄和体重无相关性，随使用期延长，腺体构成比增加。埋植后，内膜ER含量低于月经周期各期水平，但PR含量相当于或高于月经周期最高水平。ER、PR mRNA表达减弱，以ER mRNA表达降低更明显。结论 内膜腺体和螺旋动脉再生修复不良和ER、PR表达异常，可能是Norplant致子宫异常出血的病理学基础。
, 百拇医药
The Changes of Sex Steroid Receptors and Morphology in Norplant Treated Endometrium Wang Guimin, Zheng Shurong, Fan Zhenghong. Hebei Medical University ,Shijiazhuang 050017
【Abstract】 Objective To study the relationship between the changes of sex steroid receptors as well as endometrial morphology and abnormal uterine bleeding induced by Norplant. Methods Immunohistochemistry, Western Blot, in situ hybridization and computer image analysis were employed to demonstrate the expression of estrone receptor(ER)、progesterone receptor(PR) protein and mRNA as well as morphometric analysis of the endometrium in Norplant users. Results The content of DNA and the numbers of spiral arterioles decreased in Norplant treated endometrium. The percentage of glandular area in Norplant endometrium was much lower than that in cyclic endometrium. A statistically significant correlation was observed between the percentage of area of glands and abnormal uterine bleeding, as well as serum estrogen(E2) level, but E2 level had no direct relationship with the bleeding abnormality. As the time growing, the percentage of glandular area increased. Immunostaining and relative concentration of glandular and stromal ER in Norplant treated endometrium were significantly weaker and less than all the stage of cyclic endometrium. However, PR, especially stromal PR immunostaining was very intense, which was the same or more than that in all the stage of cyclic endometrium. In situ hybridization detected that the ER and PR mRNA was lower in Norplant treated endometrium than that in cyclic endometrium. The ER mRNA expression was more less abundant than PR mRNA expression. Conclusion These results suggested that poor repair and regeneration of endometrium(especially glands and spiral arterioles) and abnormal expression of ER and PR may be related to pathogenesis of abnormal uterine bleeding induced by Norplant implant.
, 百拇医药
【Key words】 Norplant Endometrium Receptors, progesterone Receptors, estrogen Uterine hemorrhage
子宫异常出血是Norplant皮下埋植避孕剂的主要副作用，以不规则出血和出血期延长为特征， 其发生率在使用第1年最高[1]。有研究表明，卵巢功能的抑制程度、激素水平和内膜病理学改变与避孕药所致子宫异常出血之间无明显相关关系[2]，推测雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)的含量和定位可能是循环激素水平与内膜组织学改变之间的重要调节因子，参与子宫异常出血的发生和发展。本研究利用组织学和分子生物学技术结合计算机图像分析，对Norplant皮下埋植后的内膜形态、细胞增殖状态和激素受体含量的变化进行研究，旨在探讨其在子宫异常出血发病中的作用。
资料与方法
, 百拇医药 一、研究对象
1.Norplant组：16例，为1995年10月至1996年10月在北京医科大学第一医院计划生育门诊预约就诊者，年龄28～47岁。埋植期3～60个月，埋植(使用)期≤12个月的9例，>12个月的7例，均有完整的月经记录。在经历了一段非出血期后又见点滴出血的当日取子宫内膜，将内膜固定于4%多聚甲醛中，石蜡包埋，5 μm厚切片。取材同时取静脉血，-30℃保存。用于提取蛋白的标本立即冻存。根据WHO的术语和定义对月经资料进行分析[3]，本研究的参考期限为90天。其中，10例(62.5%)有出血异常(6例埋植≤12个月，4例>12个月)，其中2例出血过稀(整个参照期内有1～2次少量滴血)，5例出血期延长(参照期内出血或滴血天数持续10天以上)，4例出血过频(参照期内出血或滴血超过4次)，5例不规则出血(超过17天的非出血或滴血期少于3个)；6例(37.5%)出血基本正常。规律出血与异常出血者间年龄、体重和埋植期长短无差异。
2.对照组：选取同期在本院妇科因良性疾病而行子宫切除术者的内膜，23例，年龄32～48岁。其中浆膜下肌瘤3例，壁间肌瘤8例，腺肌症和子宫内膜异位症各6例。术前3个月未用过激素类药物，未放置宫内节育器，月经规律。根据Noyes等[4]的内膜评分标准，确定内膜的组织分期，内膜的组织分期与月经资料相符。
, 百拇医药
二、方法
1.内膜病理学改变的形态计量分析：切片HE染色，在德国产IBAS-2000型图像处理系统下分别测量腺体、间质和血管的面积。每张切片随机测量5个视野，分别计算间质、腺体和血管各自所占面积的百分比及间质与腺体和血管的比值。
2.内膜DNA含量分析：切片行福尔根染色，在IBAS-2000图像分析仪下分别测腺体和间质核DNA着色的平均吸光度(A)和积分A。每张切片随机测量5个视野，至少测量1 000个细胞，得出均值。
3.血清雌、孕激素测定：采用天津德普公司激素放射免疫测定试剂盒，按操作说明操作。所有样品在一批内作双管测定，取其均值。批内误差小于10%。所得数据与本实验室激素测定的正常值比较。
4.内膜ER、PR含量测定：(1)免疫组化：采用ABC法。鼠抗人PR单克隆抗体由北京市肿瘤研究所惠赠，鼠抗人ER单克隆抗体、生物素化羊抗鼠IgG和辣根酶标记的链酶亲合素，购自中山生物技术有限公司。以磷酸缓冲液代替一抗作阴性对照。结果判定：ER、PR免疫反应呈棕黄色颗粒位于胞核内。在IBAS-2000型图像分析仪下分别测试基质和腺体ER、PR阳性信号所占各自成分面积的百分比及平均A。每张切片随机测量5个视野，至少计数1 000个细胞。(2)Western Blot： 按参考文献[5]的方法提取蛋白并进行蛋白印记分析。用紫外吸收法进行总蛋白定量。结果判定：根据蛋白分子量确定阳性信号的位置，用IBAS-2000图像处理系统对膜上蛋白带扫描，根据各样本的平均A进行比较。
, 百拇医药
5.内膜ER、PR mRNA表达：ER、PR质粒由国家计划生育研究所惠赠。按参考文献[5]的方法提取质粒DNA。采用德国宝灵曼公司地高辛标记DNA试剂盒和核酸检测试剂盒，随机引物法标记探针。结果判定：ER、PR mRNA阳性呈紫蓝色颗粒位于胞浆，图像分析同免疫组化。
三、统计学方法
采用GOPSI软件行单因素方差分析。
结果
一、激素水平和激素受体含量变化与子宫异常出血的关系
埋植Norplant后，血清雌二醇(E2)水平相当于早、中卵泡期，无黄体发育表现[孕酮(P)<15.9 nmol/L；平均2.8±0.8 nmol/L]。规律出血者平均E2水平(264.3±115.1 pmol/L)高于异常出血者(183.4±86.6 pmol/L)，差异无显著性(P>0.05)。E2水平与ER、PR表达和子宫异常出血之间，无明显的相关性(P>0.05)。规律出血者ER免疫着色强于异常出血者，但差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
二、Norplant埋植后内膜细胞增殖状态
在增殖期子宫内膜腺上皮和间质细胞中，DNA含量高于分泌期，埋植后内膜DNA含量减少，以腺上皮尤为明显(P<0.01)。见表1。
三、埋植后内膜的病理变化与出血的关系
埋植后内膜变薄，腺体小、数量少，螺旋动脉罕见。组织学改变表现为4种类型∶(1)增殖样：占18.8%(3/16)，腺体稍大，柱状腺上皮，长梭形核；间质致密，间质细胞呈小圆形或梭形，腔上皮下可见局灶性出血。(2)分泌样：占25.0%(4/16)，腺上皮呈小立方形，腺细胞分泌不良，间质呈不典型蜕膜样变，薄壁扩张的小静脉多见。(3)不典型：占43.8%(7/16)，腺上皮呈矮立方状，腺腔细小，分泌明显抑制，间质致密，部分区域水肿，腔上皮下有较多的局灶性出血和淋巴细胞聚集。(4)剥脱样：占12.5%(2/16)，大量的出血内有一些内膜碎片，间质致密，可见特征性的星形腺体和较多的淋巴细胞。内膜病理学变化与出血类型的关系见表2。
, 百拇医药
表1 埋植Norplant后内膜DNA相对含量的变化(
±s) 组别
例数
腺体
间质
A
积分A
A
积分A
对照组
增殖期
5
0.26
, 百拇医药
±0.03*
2.52
±1.68*
0.27
±0.03*
2.43
±1.57*
分泌期
5
0.24
±0.02
2.05
, 百拇医药
±1.02*
0.24
±0.02
2.19
±0.33**
Norplant组
5
0.25
±0.02
1.51
±1.73
0.24
, http://www.100md.com
±0.02
1.98
±0.45
注：与Norplant组比较，*P<0.01 **P<0.05(下同)表2 不同出血类型的内膜病理学变化(例数) 出血类型
例数
增殖样
分泌样
不典型
剥脱样
出血规律
6
, 百拇医药
2
3
2
0
出血过稀
2
0
1
1
0
出血不规则
8
1
0
, 百拇医药
4
2
结果表明，分泌样改变的内膜多有正常的出血类型，剥脱样的内膜与子宫异常出血伴随，增殖和不典型改变的内膜出血类型比较复杂。
四、埋植后内膜成分的形态计量分析
埋植后内膜腺体面积百分比减少，间质(包括血管)与腺体的比值增加，是正常内膜的4～9倍(P<0.01)。血管构成的面积百分比虽高于周期中内膜，但差异无显著性(P>0.05)，间质与血管的比值也相似，见表3。表3 两组内膜构成成分的形态计量学分析(%，±s) 类别
例数
腺体面积
, 百拇医药
间质面积
血管面积
间质/
腺体值
间质/
血管值
对照组
增殖期
8
16.9
±14.3*
76.1
±12.1*
, http://www.100md.com
7.1
±2.7
4.9*
11.8
分泌期
15
34.7
±13.9**
59.5
±12.1**
5.8
±2.3
, 百拇医药
1.9**
11.3
Norplant组
16
5.6
±3.7
85.9
±1.4
8.5
±2.5
17.0
11.1
五、埋植后内膜成分与临床参数的相关性分析
, 百拇医药
埋植后内膜成分与年龄、体重和P水平无明显相关关系，与E2水平、使用期长短及子宫异常出血相关。
1.血清E2水平与内膜成分：血清E2水平与腺体面积百分比呈正相关(P<0.01)，与间质面积百分比呈负相关(P<0.01)，与血管面积百分比无明显相关关系(P>0.05)。
2.埋植时间与内膜成分：埋植时间的长短与年龄、体重、E2、P水平无明显关系；间质的构成比例与埋植时间呈负相关(P<0.01)，随时间延长间质腺体比值降低，差异有显著性(P<0.05)。 见表4。表4 Norplant埋植期与内膜成分的关系(%，±s) 埋植时间
(月)
, http://www.100md.com 例数
腺体
间质
血管
间质/
腺体值
间质/
血管值
≤12
9
4.1±3.2
87.9±1.1
8.1±2.2
, 百拇医药
23.5
11.9
>12
7
7.0±4.2
84.0±1.7*
9.0±2.8
13.2**
10.4
注：与埋植时间≤12个月者比较，*P<0.01 **P<0.05 3.异常出血与规律出血内膜的成分：异常出血内膜腺体构成比例低于规律出血内膜(P<0.05)，间质与腺体比值增加(P<0.01)。腺体的构成比例与子宫异常出血呈负相关(P=0.05)。见表5。
, 百拇医药
表5 埋植后子宫异常出血与内膜成分变化的关系(%，±s) 类别
例数
腺体
间质
血管
间质/
腺体值
间质/
血管值
规律出血
6
7.9±3.4
, http://www.100md.com
84.7±2.1
9.6±3.7
12.0
10.0
异常出血
10
3.3±3.2*
87.2±2.0*
7.5±1.9
29.0**
12.7
注：与规律出血者比较，*P<0.05 **P<0.01 六、埋植后内膜ER、PR含量
, 百拇医药
1.免疫组化：埋植后内膜腺体和间质ER染色低于对照组各期水平，差异有显著性(P<0.05, P<0.01)。异常出血比规律出血的内膜ER染色减弱更为明显(图1～4)；腺体PR染色相当于对照组增殖晚期、分泌早期水平，基质PR染色高于对照组各期水平(图5～8)，差异有显著性(P<0.05, P<0.01)。见表6。
2.Western Blot：参照蛋白分子量标志，在67 000的位置可见ER特异性染色条带，116 000和97 000的位置可见两条PR特异性染色条带，阴性对照未见特异性着色。见表7。
结果表明，埋植Norplant后内膜ER含量下降，差异有显著性(P<0.05, P<0.01)。PR含量与增殖期和分泌早期比较无明显差异，但高于分泌中、晚期(P<0.01)。
表6 两组内膜ER、PR蛋白定位和半定量图像分析结果(±s) 组别
, 百拇医药
例
数
ER
PR
腺 体
基 质
腺 体
基 质
面积(%)
A
面积(%)
A
面积(%)
, http://www.100md.com A
面积(%)
A
对照组
增殖中晚期
8
14.9±7.1*
0.274±0.02**
13.7±3.2
0.251±0.03**
12.5±6.1
0.282±0.02**
, 百拇医药
10.3±2.8
0.265±0.02**
分泌早期
6
16.4±8.0*
0.302±0.03**
15.7±5.3
0.282±0.02**
16.8±6.7
0.311±0.02
14.6±8.1
, http://www.100md.com
0.296±0.02**
分泌中期
6
12.2±5.2
0.214±0.03**
15.0±4.9
0.268±0.04**
5.2±2.8*
0.189±0.02**
13.0±4.1
, 百拇医药 0.252±0.02**
分泌晚期
3
4.0±2.9
0.181±0.04**
7.2±3.9
0.197±0.04**
0.2±0.1**
0.098±0.02**
6.8±2.2
0.201±0.02**
, http://www.100md.com
Norplant组
16
6.5±3.9
0.162±0.02
10.9±3.2
0.163±0.01
14.7±3.0
0.314±0.04
11.1±3.5
0.319±0.02
注：与Norplant组比较，*P<0.05 **P<0.01表7 两组内膜ER、PR相对含量的A值(±s) 组别
, 百拇医药
例数
ER
PR
对照组
增殖中晚期
4
0.049±0.015*
0.109±0.016
分泌早期
3
0.051±0.017*
0.136±0.081
, 百拇医药
分泌中期
3
0.039±0.005*
0.064±0.009*
分泌晚期
2
0.018±0.003**
0.031±0.009*
Norplant组
2
0.013±0.002
, http://www.100md.com
0.111±0.019
七、埋植后内膜ER、PR mRNA的表达
增殖期内膜大部分腺上皮细胞中表达ER、PR mRNA，基质染色弱于腺体，分泌中、晚期染色减弱，腺体染色几乎消失，基质弱阳性。埋植后内膜有2例因标本太少无法观察，其余14例中10例检测出ER mRNA；12/14检测出PR mRNA(图9～12)。图像分析结果见表8。
结果表明，埋植后内膜腺体和间质ER mRNA表达面积和强度低于对照组各期水平，差异有显著性(P<0.05,P<0.01)。腺体和间质PR mRNA的表达范围和强度低于增殖期和分泌早期，高于分泌晚期，差异有显著性(P<0.05)。
讨论
一、内膜病理学变化与子宫异常出血的关系
, 百拇医药
本组Norplant使用1年以上者异常子宫出血的发生率为57%，明显高于文献报道[1]，与该组患者多因出血问题而就诊，资料的获得非随机有关。本研究发现，外源性孕激素可使内膜腺上皮和间质细胞DNA的含量减少，内膜增殖不良，以腺体增生抑制为主，间质/腺体比值明显增加，这种改变与子宫异常出血相关。提示，低雌激素水平与腺体增殖发育不良有关。子宫异常出血的发生，可能与内膜增生抑制程度及雌、孕激素的相对平衡有关。随使用期的延长，子宫异常出血的发生率降低可能与内膜，尤其是腺体的增殖状况改善有关。腺上皮再生修复不良可能是子宫异常出血的重要病理基础之一。推测，腺体增殖不良一方面可影响腺上皮的再生修复过程，导致出血期延长，另一方面腺上皮是卵巢激素作用的重要靶细胞，也是许多生长因子产生和作用的部位，腺上皮发育异常可导致各种生长因子(如血管生成因子等)表达异常，二者互为因果，参与子宫异常出血的发生和发展。本研究未发现埋植后内膜的血管构成比例有明显改变，但螺旋动脉的数量明显减少。推测，螺旋动脉发育不良是子宫异常出血的另一病理基础。
, 百拇医药
表8 两组内膜ERmRNA、PRmRNA定位和半定量图像分析结果(±s) 组别
例数
ER mRNA
PR mRNA
腺体
基质
腺体
基质
面积(%)
A
面积(%)
, 百拇医药
A
面积(%)
A
面积(%)
A
对照组
增殖中晚期
8
8.7±2.2*
0.257±0.04*
5.7±1.9*
0.237±0.03**
, 百拇医药
9.2±2.8**
0.348±0.02**
6.2±1.9
0.321±0.02**
分泌早期
6
7.6±2.4*
0.231±0.02*
6.1±2.3*
0.258±0.04*
, 百拇医药
8.9±2.7**
0.353±0.04*
7.2±2.2
0.325±0.02**
分泌中期
6
4.2±2.0**
0.211±0.05**
5.0±1.7*
0.227±0.05
, 百拇医药
2.7±1.9
0.318±0.04
3.1±1.7
0.301±0.04
分泌晚期
3
1.1±1.0
0.187±0.04
2.1±1.5
0.217±0.03
0.01±0.2**
0.309±0.02**
, http://www.100md.com
1.9±0.9**
0.286±0.04**
Norplant组
10
0.8±0.1
0.190±0.02
1.0±0.1
0.218±0.03
4.5±2.3
0.326±0.02
4.2±1.2
, 百拇医药
0.303±0.03
注：与埋植后内膜比较，*P<0.01 **P<0.05 二、激素受体的改变与子宫异常出血
有报道，Norplant埋植后内膜间质和腺体ER含量降低，而间质PR含量增加[6]。本结果表明，在正常月经周期中，内膜腺体和间质ER、PR蛋白和mRNA的表达时相基本一致。埋植后内膜ER、PR的改变有两个特点，一是ER、PR蛋白表达分离，较低的ER与较高的PR伴随；二是PR蛋白和PR mRNA表达分离，PR蛋白高表达，但PR mRNA低表达。
埋植后内膜ER、PR生成失衡的机理还不清楚。已知雌激素可以在转录水平上诱导ER、PR生成，而P可以在转录和转录后水平上使其下调[7]。本结果提示，Norplant对ER、PR生成代谢的影响不一。埋植后内膜ER mRNA表达减少与其蛋白的低表达一致，提示Norplant可从转录水平抑制ER mRNA的表达，影响ER蛋白的生成，PR mRNA的表达低于PR蛋白的表达，提示Norplant除影响PR的生成外，还可能使PR蛋白的降解和利用减少。
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埋植Norplant后内膜虽然PR含量增加，但内膜的形态学改变并无明显的孕激素效应。推测，Norplant长期皮下埋植可能导致内膜激素受体的不应性，埋植后的长期低E2水平不仅使ER mRNA表达减少，而且ER对E2的敏感性降低，雌激素效应降低又影响孕激素效应的发挥，导致PR的结构或亲合力改变，使内外源性孕激素所致的PR下调减少，加重了内膜的低雌、孕激素状态。适当补充雌激素确实可改善单纯孕激素避孕药所致的出血，复方避孕药可使子宫异常出血的发生率降低。推测，一方面雌激素可促进内膜和血管增殖，另一方面可诱导ER、PR的生成，进而改善雌、孕激素的生物效应。由此可见，内膜局部激素受体异常是单纯孕激素避孕药所致子宫异常出血的主要原因。
本研究发现，埋植后内膜ER的改变与E2水平之间无直接相关关系，既使有较高的E2水平仍表现为较低的ER水平。因此，除E2外， 还有其它因子参与ER生成调节，需进一步研究。
, 百拇医药
图1 增殖期内膜腺上皮和间质细胞ER染色强阳性。免疫组化ABC(下同)×200 图2 分泌晚期内膜ER染色减弱。×200 图3 Norplant埋植后规律出血内膜ER染色明显示减弱。×200 图4 Norplant埋植后异常出血内膜ER染色低于规律出血内膜。×200 图5 增殖期内膜腺上皮和间质细胞PR染色强阳性。×200 图6 分泌早期内膜PR染色强阳性。×200 图7 分泌中期内膜腺体PR明显示消失。×200 图8 Norplant埋植后内膜PR染色强阳性。×200 图9 增殖期内膜ER mRNA的表达。原位杂交(下同)×200 图10 Norplant埋植后内膜ER mRNA表达减弱。×200 图11 分泌早期内膜PR mRNA表达。×200 图12 Norplant埋植后内膜PR mRNA表达低于分泌早期。×200
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(收稿：1997-07-04 修回：1998-05-06), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一医院妇产科[王桂敏(现在河北医科大学解剖教研室)，郑淑蓉，范正红]
关键词：左炔诺孕酮；子宫内膜；受体；孕酮；受体；雌激素；子宫出血
中华妇产科杂志980814 【摘要】 目的 探讨Norplant皮下埋植后子宫内膜形态和雌、孕激素受体(ER、PR)含量的变化与子宫异常出血的关系。方法 应用免疫组化、Western Blot和原位杂交技术结合计算机图像分析，观察16例Norplant皮下埋植后和23例正常周期的内膜的形态学改变、细胞增殖状态及ER、PR蛋白及其mRNA的表达。结果 埋植Norplant后，内膜DNA含量降低；螺旋动脉数量减少，腺体的构成比例降低；腺体构成比例与雌二醇(E2)水平呈正相关，与子宫异常出血呈负相关，与年龄和体重无相关性，随使用期延长，腺体构成比增加。埋植后，内膜ER含量低于月经周期各期水平，但PR含量相当于或高于月经周期最高水平。ER、PR mRNA表达减弱，以ER mRNA表达降低更明显。结论 内膜腺体和螺旋动脉再生修复不良和ER、PR表达异常，可能是Norplant致子宫异常出血的病理学基础。
, 百拇医药
The Changes of Sex Steroid Receptors and Morphology in Norplant Treated Endometrium Wang Guimin, Zheng Shurong, Fan Zhenghong. Hebei Medical University ,Shijiazhuang 050017
【Abstract】 Objective To study the relationship between the changes of sex steroid receptors as well as endometrial morphology and abnormal uterine bleeding induced by Norplant. Methods Immunohistochemistry, Western Blot, in situ hybridization and computer image analysis were employed to demonstrate the expression of estrone receptor(ER)、progesterone receptor(PR) protein and mRNA as well as morphometric analysis of the endometrium in Norplant users. Results The content of DNA and the numbers of spiral arterioles decreased in Norplant treated endometrium. The percentage of glandular area in Norplant endometrium was much lower than that in cyclic endometrium. A statistically significant correlation was observed between the percentage of area of glands and abnormal uterine bleeding, as well as serum estrogen(E2) level, but E2 level had no direct relationship with the bleeding abnormality. As the time growing, the percentage of glandular area increased. Immunostaining and relative concentration of glandular and stromal ER in Norplant treated endometrium were significantly weaker and less than all the stage of cyclic endometrium. However, PR, especially stromal PR immunostaining was very intense, which was the same or more than that in all the stage of cyclic endometrium. In situ hybridization detected that the ER and PR mRNA was lower in Norplant treated endometrium than that in cyclic endometrium. The ER mRNA expression was more less abundant than PR mRNA expression. Conclusion These results suggested that poor repair and regeneration of endometrium(especially glands and spiral arterioles) and abnormal expression of ER and PR may be related to pathogenesis of abnormal uterine bleeding induced by Norplant implant.
, 百拇医药
【Key words】 Norplant Endometrium Receptors, progesterone Receptors, estrogen Uterine hemorrhage
子宫异常出血是Norplant皮下埋植避孕剂的主要副作用，以不规则出血和出血期延长为特征， 其发生率在使用第1年最高[1]。有研究表明，卵巢功能的抑制程度、激素水平和内膜病理学改变与避孕药所致子宫异常出血之间无明显相关关系[2]，推测雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)的含量和定位可能是循环激素水平与内膜组织学改变之间的重要调节因子，参与子宫异常出血的发生和发展。本研究利用组织学和分子生物学技术结合计算机图像分析，对Norplant皮下埋植后的内膜形态、细胞增殖状态和激素受体含量的变化进行研究，旨在探讨其在子宫异常出血发病中的作用。
资料与方法
, 百拇医药 一、研究对象
1.Norplant组：16例，为1995年10月至1996年10月在北京医科大学第一医院计划生育门诊预约就诊者，年龄28～47岁。埋植期3～60个月，埋植(使用)期≤12个月的9例，>12个月的7例，均有完整的月经记录。在经历了一段非出血期后又见点滴出血的当日取子宫内膜，将内膜固定于4%多聚甲醛中，石蜡包埋，5 μm厚切片。取材同时取静脉血，-30℃保存。用于提取蛋白的标本立即冻存。根据WHO的术语和定义对月经资料进行分析[3]，本研究的参考期限为90天。其中，10例(62.5%)有出血异常(6例埋植≤12个月，4例>12个月)，其中2例出血过稀(整个参照期内有1～2次少量滴血)，5例出血期延长(参照期内出血或滴血天数持续10天以上)，4例出血过频(参照期内出血或滴血超过4次)，5例不规则出血(超过17天的非出血或滴血期少于3个)；6例(37.5%)出血基本正常。规律出血与异常出血者间年龄、体重和埋植期长短无差异。
2.对照组：选取同期在本院妇科因良性疾病而行子宫切除术者的内膜，23例，年龄32～48岁。其中浆膜下肌瘤3例，壁间肌瘤8例，腺肌症和子宫内膜异位症各6例。术前3个月未用过激素类药物，未放置宫内节育器，月经规律。根据Noyes等[4]的内膜评分标准，确定内膜的组织分期，内膜的组织分期与月经资料相符。
, 百拇医药
二、方法
1.内膜病理学改变的形态计量分析：切片HE染色，在德国产IBAS-2000型图像处理系统下分别测量腺体、间质和血管的面积。每张切片随机测量5个视野，分别计算间质、腺体和血管各自所占面积的百分比及间质与腺体和血管的比值。
2.内膜DNA含量分析：切片行福尔根染色，在IBAS-2000图像分析仪下分别测腺体和间质核DNA着色的平均吸光度(A)和积分A。每张切片随机测量5个视野，至少测量1 000个细胞，得出均值。
3.血清雌、孕激素测定：采用天津德普公司激素放射免疫测定试剂盒，按操作说明操作。所有样品在一批内作双管测定，取其均值。批内误差小于10%。所得数据与本实验室激素测定的正常值比较。
4.内膜ER、PR含量测定：(1)免疫组化：采用ABC法。鼠抗人PR单克隆抗体由北京市肿瘤研究所惠赠，鼠抗人ER单克隆抗体、生物素化羊抗鼠IgG和辣根酶标记的链酶亲合素，购自中山生物技术有限公司。以磷酸缓冲液代替一抗作阴性对照。结果判定：ER、PR免疫反应呈棕黄色颗粒位于胞核内。在IBAS-2000型图像分析仪下分别测试基质和腺体ER、PR阳性信号所占各自成分面积的百分比及平均A。每张切片随机测量5个视野，至少计数1 000个细胞。(2)Western Blot： 按参考文献[5]的方法提取蛋白并进行蛋白印记分析。用紫外吸收法进行总蛋白定量。结果判定：根据蛋白分子量确定阳性信号的位置，用IBAS-2000图像处理系统对膜上蛋白带扫描，根据各样本的平均A进行比较。
, 百拇医药
5.内膜ER、PR mRNA表达：ER、PR质粒由国家计划生育研究所惠赠。按参考文献[5]的方法提取质粒DNA。采用德国宝灵曼公司地高辛标记DNA试剂盒和核酸检测试剂盒，随机引物法标记探针。结果判定：ER、PR mRNA阳性呈紫蓝色颗粒位于胞浆，图像分析同免疫组化。
三、统计学方法
采用GOPSI软件行单因素方差分析。
结果
一、激素水平和激素受体含量变化与子宫异常出血的关系
埋植Norplant后，血清雌二醇(E2)水平相当于早、中卵泡期，无黄体发育表现[孕酮(P)<15.9 nmol/L；平均2.8±0.8 nmol/L]。规律出血者平均E2水平(264.3±115.1 pmol/L)高于异常出血者(183.4±86.6 pmol/L)，差异无显著性(P>0.05)。E2水平与ER、PR表达和子宫异常出血之间，无明显的相关性(P>0.05)。规律出血者ER免疫着色强于异常出血者，但差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
二、Norplant埋植后内膜细胞增殖状态
在增殖期子宫内膜腺上皮和间质细胞中，DNA含量高于分泌期，埋植后内膜DNA含量减少，以腺上皮尤为明显(P<0.01)。见表1。
三、埋植后内膜的病理变化与出血的关系
埋植后内膜变薄，腺体小、数量少，螺旋动脉罕见。组织学改变表现为4种类型∶(1)增殖样：占18.8%(3/16)，腺体稍大，柱状腺上皮，长梭形核；间质致密，间质细胞呈小圆形或梭形，腔上皮下可见局灶性出血。(2)分泌样：占25.0%(4/16)，腺上皮呈小立方形，腺细胞分泌不良，间质呈不典型蜕膜样变，薄壁扩张的小静脉多见。(3)不典型：占43.8%(7/16)，腺上皮呈矮立方状，腺腔细小，分泌明显抑制，间质致密，部分区域水肿，腔上皮下有较多的局灶性出血和淋巴细胞聚集。(4)剥脱样：占12.5%(2/16)，大量的出血内有一些内膜碎片，间质致密，可见特征性的星形腺体和较多的淋巴细胞。内膜病理学变化与出血类型的关系见表2。
, 百拇医药
表1 埋植Norplant后内膜DNA相对含量的变化(
±s) 组别例数
腺体
间质
A
积分A
A
积分A
对照组
增殖期
5
0.26
, 百拇医药
±0.03*
2.52
±1.68*
0.27
±0.03*
2.43
±1.57*
分泌期
5
0.24
±0.02
2.05
, 百拇医药
±1.02*
0.24
±0.02
2.19
±0.33**
Norplant组
5
0.25
±0.02
1.51
±1.73
0.24
, http://www.100md.com
±0.02
1.98
±0.45
注：与Norplant组比较，*P<0.01 **P<0.05(下同)表2 不同出血类型的内膜病理学变化(例数) 出血类型
例数
增殖样
分泌样
不典型
剥脱样
出血规律
6
, 百拇医药
2
3
2
0
出血过稀
2
0
1
1
0
出血不规则
8
1
0
, 百拇医药
4
2
结果表明，分泌样改变的内膜多有正常的出血类型，剥脱样的内膜与子宫异常出血伴随，增殖和不典型改变的内膜出血类型比较复杂。
四、埋植后内膜成分的形态计量分析
埋植后内膜腺体面积百分比减少，间质(包括血管)与腺体的比值增加，是正常内膜的4～9倍(P<0.01)。血管构成的面积百分比虽高于周期中内膜，但差异无显著性(P>0.05)，间质与血管的比值也相似，见表3。表3 两组内膜构成成分的形态计量学分析(%，
±s) 类别例数
腺体面积
, 百拇医药
间质面积
血管面积
间质/
腺体值
间质/
血管值
对照组
增殖期
8
16.9
±14.3*
76.1
±12.1*
, http://www.100md.com
7.1
±2.7
4.9*
11.8
分泌期
15
34.7
±13.9**
59.5
±12.1**
5.8
±2.3
, 百拇医药
1.9**
11.3
Norplant组
16
5.6
±3.7
85.9
±1.4
8.5
±2.5
17.0
11.1
五、埋植后内膜成分与临床参数的相关性分析
, 百拇医药
埋植后内膜成分与年龄、体重和P水平无明显相关关系，与E2水平、使用期长短及子宫异常出血相关。
1.血清E2水平与内膜成分：血清E2水平与腺体面积百分比呈正相关(P<0.01)，与间质面积百分比呈负相关(P<0.01)，与血管面积百分比无明显相关关系(P>0.05)。
2.埋植时间与内膜成分：埋植时间的长短与年龄、体重、E2、P水平无明显关系；间质的构成比例与埋植时间呈负相关(P<0.01)，随时间延长间质腺体比值降低，差异有显著性(P<0.05)。 见表4。表4 Norplant埋植期与内膜成分的关系(%，
±s) 埋植时间(月)
, http://www.100md.com 例数
腺体
间质
血管
间质/
腺体值
间质/
血管值
≤12
9
4.1±3.2
87.9±1.1
8.1±2.2
, 百拇医药
23.5
11.9
>12
7
7.0±4.2
84.0±1.7*
9.0±2.8
13.2**
10.4
注：与埋植时间≤12个月者比较，*P<0.01 **P<0.05 3.异常出血与规律出血内膜的成分：异常出血内膜腺体构成比例低于规律出血内膜(P<0.05)，间质与腺体比值增加(P<0.01)。腺体的构成比例与子宫异常出血呈负相关(P=0.05)。见表5。
, 百拇医药
表5 埋植后子宫异常出血与内膜成分变化的关系(%，
±s) 类别例数
腺体
间质
血管
间质/
腺体值
间质/
血管值
规律出血
6
7.9±3.4
, http://www.100md.com
84.7±2.1
9.6±3.7
12.0
10.0
异常出血
10
3.3±3.2*
87.2±2.0*
7.5±1.9
29.0**
12.7
注：与规律出血者比较，*P<0.05 **P<0.01 六、埋植后内膜ER、PR含量
, 百拇医药
1.免疫组化：埋植后内膜腺体和间质ER染色低于对照组各期水平，差异有显著性(P<0.05, P<0.01)。异常出血比规律出血的内膜ER染色减弱更为明显(图1～4)；腺体PR染色相当于对照组增殖晚期、分泌早期水平，基质PR染色高于对照组各期水平(图5～8)，差异有显著性(P<0.05, P<0.01)。见表6。
2.Western Blot：参照蛋白分子量标志，在67 000的位置可见ER特异性染色条带，116 000和97 000的位置可见两条PR特异性染色条带，阴性对照未见特异性着色。见表7。
结果表明，埋植Norplant后内膜ER含量下降，差异有显著性(P<0.05, P<0.01)。PR含量与增殖期和分泌早期比较无明显差异，但高于分泌中、晚期(P<0.01)。
表6 两组内膜ER、PR蛋白定位和半定量图像分析结果(
±s) 组别, 百拇医药
例
数
ER
PR
腺 体
基 质
腺 体
基 质
面积(%)
A
面积(%)
A
面积(%)
, http://www.100md.com A
面积(%)
A
对照组
增殖中晚期
8
14.9±7.1*
0.274±0.02**
13.7±3.2
0.251±0.03**
12.5±6.1
0.282±0.02**
, 百拇医药
10.3±2.8
0.265±0.02**
分泌早期
6
16.4±8.0*
0.302±0.03**
15.7±5.3
0.282±0.02**
16.8±6.7
0.311±0.02
14.6±8.1
, http://www.100md.com
0.296±0.02**
分泌中期
6
12.2±5.2
0.214±0.03**
15.0±4.9
0.268±0.04**
5.2±2.8*
0.189±0.02**
13.0±4.1
, 百拇医药 0.252±0.02**
分泌晚期
3
4.0±2.9
0.181±0.04**
7.2±3.9
0.197±0.04**
0.2±0.1**
0.098±0.02**
6.8±2.2
0.201±0.02**
, http://www.100md.com
Norplant组
16
6.5±3.9
0.162±0.02
10.9±3.2
0.163±0.01
14.7±3.0
0.314±0.04
11.1±3.5
0.319±0.02
注：与Norplant组比较，*P<0.05 **P<0.01表7 两组内膜ER、PR相对含量的A值(
±s) 组别, 百拇医药
例数
ER
PR
对照组
增殖中晚期
4
0.049±0.015*
0.109±0.016
分泌早期
3
0.051±0.017*
0.136±0.081
, 百拇医药
分泌中期
3
0.039±0.005*
0.064±0.009*
分泌晚期
2
0.018±0.003**
0.031±0.009*
Norplant组
2
0.013±0.002
, http://www.100md.com
0.111±0.019
七、埋植后内膜ER、PR mRNA的表达
增殖期内膜大部分腺上皮细胞中表达ER、PR mRNA，基质染色弱于腺体，分泌中、晚期染色减弱，腺体染色几乎消失，基质弱阳性。埋植后内膜有2例因标本太少无法观察，其余14例中10例检测出ER mRNA；12/14检测出PR mRNA(图9～12)。图像分析结果见表8。
结果表明，埋植后内膜腺体和间质ER mRNA表达面积和强度低于对照组各期水平，差异有显著性(P<0.05,P<0.01)。腺体和间质PR mRNA的表达范围和强度低于增殖期和分泌早期，高于分泌晚期，差异有显著性(P<0.05)。
讨论
一、内膜病理学变化与子宫异常出血的关系
, 百拇医药
本组Norplant使用1年以上者异常子宫出血的发生率为57%，明显高于文献报道[1]，与该组患者多因出血问题而就诊，资料的获得非随机有关。本研究发现，外源性孕激素可使内膜腺上皮和间质细胞DNA的含量减少，内膜增殖不良，以腺体增生抑制为主，间质/腺体比值明显增加，这种改变与子宫异常出血相关。提示，低雌激素水平与腺体增殖发育不良有关。子宫异常出血的发生，可能与内膜增生抑制程度及雌、孕激素的相对平衡有关。随使用期的延长，子宫异常出血的发生率降低可能与内膜，尤其是腺体的增殖状况改善有关。腺上皮再生修复不良可能是子宫异常出血的重要病理基础之一。推测，腺体增殖不良一方面可影响腺上皮的再生修复过程，导致出血期延长，另一方面腺上皮是卵巢激素作用的重要靶细胞，也是许多生长因子产生和作用的部位，腺上皮发育异常可导致各种生长因子(如血管生成因子等)表达异常，二者互为因果，参与子宫异常出血的发生和发展。本研究未发现埋植后内膜的血管构成比例有明显改变，但螺旋动脉的数量明显减少。推测，螺旋动脉发育不良是子宫异常出血的另一病理基础。
, 百拇医药
表8 两组内膜ERmRNA、PRmRNA定位和半定量图像分析结果(
±s) 组别例数
ER mRNA
PR mRNA
腺体
基质
腺体
基质
面积(%)
A
面积(%)
, 百拇医药
A
面积(%)
A
面积(%)
A
对照组
增殖中晚期
8
8.7±2.2*
0.257±0.04*
5.7±1.9*
0.237±0.03**
, 百拇医药
9.2±2.8**
0.348±0.02**
6.2±1.9
0.321±0.02**
分泌早期
6
7.6±2.4*
0.231±0.02*
6.1±2.3*
0.258±0.04*
, 百拇医药
8.9±2.7**
0.353±0.04*
7.2±2.2
0.325±0.02**
分泌中期
6
4.2±2.0**
0.211±0.05**
5.0±1.7*
0.227±0.05
, 百拇医药
2.7±1.9
0.318±0.04
3.1±1.7
0.301±0.04
分泌晚期
3
1.1±1.0
0.187±0.04
2.1±1.5
0.217±0.03
0.01±0.2**
0.309±0.02**
, http://www.100md.com
1.9±0.9**
0.286±0.04**
Norplant组
10
0.8±0.1
0.190±0.02
1.0±0.1
0.218±0.03
4.5±2.3
0.326±0.02
4.2±1.2
, 百拇医药
0.303±0.03
注：与埋植后内膜比较，*P<0.01 **P<0.05 二、激素受体的改变与子宫异常出血
有报道，Norplant埋植后内膜间质和腺体ER含量降低，而间质PR含量增加[6]。本结果表明，在正常月经周期中，内膜腺体和间质ER、PR蛋白和mRNA的表达时相基本一致。埋植后内膜ER、PR的改变有两个特点，一是ER、PR蛋白表达分离，较低的ER与较高的PR伴随；二是PR蛋白和PR mRNA表达分离，PR蛋白高表达，但PR mRNA低表达。
埋植后内膜ER、PR生成失衡的机理还不清楚。已知雌激素可以在转录水平上诱导ER、PR生成，而P可以在转录和转录后水平上使其下调[7]。本结果提示，Norplant对ER、PR生成代谢的影响不一。埋植后内膜ER mRNA表达减少与其蛋白的低表达一致，提示Norplant可从转录水平抑制ER mRNA的表达，影响ER蛋白的生成，PR mRNA的表达低于PR蛋白的表达，提示Norplant除影响PR的生成外，还可能使PR蛋白的降解和利用减少。
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埋植Norplant后内膜虽然PR含量增加，但内膜的形态学改变并无明显的孕激素效应。推测，Norplant长期皮下埋植可能导致内膜激素受体的不应性，埋植后的长期低E2水平不仅使ER mRNA表达减少，而且ER对E2的敏感性降低，雌激素效应降低又影响孕激素效应的发挥，导致PR的结构或亲合力改变，使内外源性孕激素所致的PR下调减少，加重了内膜的低雌、孕激素状态。适当补充雌激素确实可改善单纯孕激素避孕药所致的出血，复方避孕药可使子宫异常出血的发生率降低。推测，一方面雌激素可促进内膜和血管增殖，另一方面可诱导ER、PR的生成，进而改善雌、孕激素的生物效应。由此可见，内膜局部激素受体异常是单纯孕激素避孕药所致子宫异常出血的主要原因。
本研究发现，埋植后内膜ER的改变与E2水平之间无直接相关关系，既使有较高的E2水平仍表现为较低的ER水平。因此，除E2外， 还有其它因子参与ER生成调节，需进一步研究。
, 百拇医药
图1 增殖期内膜腺上皮和间质细胞ER染色强阳性。免疫组化ABC(下同)×200 图2 分泌晚期内膜ER染色减弱。×200 图3 Norplant埋植后规律出血内膜ER染色明显示减弱。×200 图4 Norplant埋植后异常出血内膜ER染色低于规律出血内膜。×200 图5 增殖期内膜腺上皮和间质细胞PR染色强阳性。×200 图6 分泌早期内膜PR染色强阳性。×200 图7 分泌中期内膜腺体PR明显示消失。×200 图8 Norplant埋植后内膜PR染色强阳性。×200 图9 增殖期内膜ER mRNA的表达。原位杂交(下同)×200 图10 Norplant埋植后内膜ER mRNA表达减弱。×200 图11 分泌早期内膜PR mRNA表达。×200 图12 Norplant埋植后内膜PR mRNA表达低于分泌早期。×200
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(收稿：1997-07-04 修回：1998-05-06), 百拇医药