作者:许韩师 汤洁如 陈述枚 孙林
单位:510080 广州,中山医科大学附属第一医院儿科(许韩师、汤洁如、陈述枚),肾内科(孙林)
关键词:红斑狼疮,系统性;白细胞介素6;白细胞,单核;原位杂交
中华儿科杂志990606 【摘要】 目的 确定系统性红斑狼疮(SLE)患儿体内是否存在内源性白细胞介素6(IL-6)表达增高及其来源。方法 分别用ELISA方法和细胞原位杂交技术检测18例活动期和12例非活动期SLE患儿血清、外周血单个核细胞(PBMC)内IL-6含量及PBMC内IL-6 mRNA的表达,并分析三者之间的关系。另设15例作为对照组。结果 活动期血清IL-6为(82±38)ng/L,PBMC内为(12.1±9.7)ng/L;非活动期分别为(38±26)ng/L、(7.9±5.4)ng/L;对照组分别为(9±4)ng/L、(1.2±2.0)ng/L。SLE活动期和非活动期患儿血清IL-6水平和PBMC内IL-6含量均显著高于对照组,其PBMC内IL-6 mRNA表达量亦显著高于对照组,上述三者之间均呈直线正相关关系;非活动期SLE IL-6血清水平、PBMC内含量及mRNA表达则明显低于活动期组。血清dsDNA抗体阳性组IL-6水平明显高于阴性组。结论 SLE患儿体内存在的PBMC内源性过度表达和合成IL-6是其外周血IL-6水平异常增高的原因之一,异常增高的循环IL-6与SLE患儿自身抗体的产生有关,血清IL-6水平的过高提示SLE处于活动期,对病情判断有一定的意义。
High levels of interleukin-6 production from peripheral blood mononuclear cells of children with systemic lupus erythematosus XU Hanshi, TANG Jieru, CHEN Shumei, et al. Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences. Guangzhou 510080
【Abstract】 Objective To investigate the endogeneous overexpression of IL-6 gene and abnormal high production of IL-6 protein in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of children with active and inactive systemic lupus erythematosus (SLE).Methods The serum IL-6 level and freshly-isolated PBMC lysate IL-6 content in 18 children with active SLE (1 boy and 17 girls, aged 6.5~16 years old, average 9.2 years old) and 12 children with inactive SLE (2 boys and 10 girls, aged 7~14 years, average 8.3 years old) were measured by ELIAS, and IL-6 gene expression in the PBMC in the same groups of children was measured by in situ hybridization.Results The levels of IL-6 in sera and PBMC lysates as well as IL-6 mRNA expression in PBMC in children with active and inactive SLE were higher than those in the normal group. A linear positive relationship was found among them. The serum IL-6 level, IL-6 content and mRNA expression in PBMC in children with inactive SLE were lower than that in children with active SLE. The serum IL-6 level in positive anti-dsDNA antibody group was higher compared with that in negative group.Conclusion Endogeneous overexpression of IL-6 derived from PBMC in children with SLE might be one of the causes that result in elevated level of IL-6 in blood, which may be associated with the production of autoantibodies. The high level of serum IL-6 in SLE may be an indicator of disease activity.
【Key words】 Lupus erythematosus, systemic Interlleukin-6 Leukocytes, mononuclear In situ hybridizatiom
系统性红斑狼疮(SLE)是儿科常见的自身免疫性疾病,其发病机制未明。白细胞介素6(IL-6)是一种多功能的细胞因子,其异常表达可能参与一些免疫性疾病的发生发展,但目前国内外报道小儿SLE与IL-6相关研究的文章甚少。因此,本研究采用ELISA方法检测SLE患儿血清及外周血单个核细胞(PBMC)内IL-6含量,原位杂交方法检测新鲜分离的SLE患儿PBMC在未受任何刺激情况下IL-6 mRNA的表达,并探讨三者之间的相互关系,以确定SLE患儿体内是否存在内源性IL-6过度表达及其来源。
对象和方法
一、研究对象
30例SLE患儿诊断符合美国风湿病学会1982年修订的SLE诊断标准
[1]。参照SLE疾病活动指数(SLEDAI)分为:活动期18例,其中男1例,女17例;年龄6岁5个月~16岁,平均9岁2个月。非活动期12例,男2例,女10例;年龄7~14岁,平均8岁3个月。SLEDAI评分标准见参考文献[2]。对照组15例为门诊体检的健康小儿,男2例,女13例;年龄7~14岁,平均年龄9岁10个月。
二、试剂和仪器
IL-6 ELISA检测试剂盒(法国国际免疫试剂公司),DIG寡核苷酸3′端标记试剂盒,DIG核酸检测试剂盒(德国宝灵曼公司),淋巴细胞分离液(上海试剂二厂,批号940427),Modell450酶标仪(Bio-Rad公司,美国),BX50系统生物显微镜照像系统(Olympus, 日本),IBAAS2.0计算机图像分析系统(KONTRON,德国),SZK-202超净工作台(蚌埠净化设备厂)。
三、原位杂交用寡核苷酸探针、原位杂交玻片处理及程序
IL-6引物序列;3′-CATTTGCCGAAGAGCCA-5′;β-肌动朊引物序列:3′GTCATGCTTAACTCTGCAGG-5′(以上寡核苷酸序列由软件设计,上海细胞生物研究所合成)。玻片经去污剂、清洁液处理,3×Denhart′s溶液65℃3小时,180℃烤24小时,置盒中保存,使用前用多聚赖氨酸溶液推片,晾干。取5 μl细胞悬液涂于载玻片上,晾干,4%多聚甲醛固定10分钟,乙醇逐级脱水,空气干燥,蛋白酶K(10~30 μl/ml)37℃、10分钟,37℃预杂交1~2小时,2×SSC/0.1%SDS15分钟,0.5×SSC15分钟,缓冲液Ⅰ15分钟,1∶1 000抗地高辛抗体1~2小时,缓冲液Ⅰ15分钟,缓冲液Ⅲ5分钟,显色反应2~5小时,苏木精5秒,伊红10秒,二甲苯透明,中性树胶封片。
四、方法
1.血标本采集:(1)抽静脉血6 ml,2 ml置于干燥管中,余下的4 ml等分后各自置于2% EDTA 0.4 ml抗凝的灭菌刻度离心管中,摇匀,血标本置冰箱,2小时内处理。(2)PBMC分离:无菌条件下采集抗凝血2 ml,加等量PBS稀释,然后沿管壁缓缓加入至分离液的上方,以2 500 r/min离心20分钟得细胞沉积物,再用PBS冲洗1~2次后配成1×10
6/ml细胞悬液备用。
2.血清IL-6含量测定:干燥管中血以2 500 r/min离心5分钟,所得血清置-20℃储存待测。用ELISA方法检测(按说明书操作)。
3.PBMC内IL-6含量测定:取上述方法分离出的细胞悬液再用生理盐水洗涤三次后悬浮于生理盐水,配成10
5/ml细胞悬液。然后反复冻融,待细胞溶解后过滤,取滤出液按上述ELISA法测IL-6含量。
4.目的探针标记:按试剂盒说明书操作。
5.对照组:以β-actin寡核苷酸探针为阳性对照。阴性对照:(1)杂交前细胞涂片经Rnase A处理;(2)用2×SSC代替目的探针。
6.血清抗dsDNA抗体的检测:按本院中心实验室常规测定。
五、结果分析
原位杂交阳性杂交信号为细胞浆中出现的黑色或紫蓝色的颗粒状、絮条状物。将所得玻片进行计算机图像分析系统处理以杂交信号比值[阳性信号总面积(μm)/细胞总面积(μm)×100]半定量地表示mRNA表达量。比值越大,说明mRNA表达量愈多。
六、统计学处理
数据以均数±标准差(
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±s)表示,统计学方法采用t检验及直线相关分析。
结 果
一、活动期和非活动期SLE患儿血清及PBMC内IL-6含量
SLE患儿血清及PBMC内IL-6含量均较对照组显著升高。非活动期组明显低于活动期组(表1)。
表1 SLE患儿血清及PBMC内IL-6含量(
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±s, ng/L) 组别
例数
血清IL-6含量
PBMC内IL-6含量
对照组
15
9±4
1.2±2.0
SLE活动组
18
82±38
*△
12.1±9.7
*△
SLE非活动组
12
38±26
*
7.9±5.4
*
注:与正常对照组比较,
*P<0.001,与非活动组相比
△P<0.05
二、SLE患儿血清IL-6含量与PBMC内IL-6含量相关分析
两者呈显著的直线正相关关系(r=0.631,P<0.05)。
三、SLE患儿PBMC IL-6 mRNA表达
对照组IL-6 mRNA表达为(0.11±0.09)%,活动期18例表达量为(3.5±1.7)%,非活动期12例表达量为(1.7±1.1)%。后两组IL-6mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05),非活动期组则显著低于活动期组(P<0.05)。
四、SLE患儿PBMC内IL-6mRNA表达与其血清IL-6含量的相关分析:两者呈直线正相关(r=0.628,P<0.05)。
五、SLE患儿PBMC内IL-6mRNA表达与其PBMC内IL-6蛋白含量的相关分析
两者呈直线正相关(r=0.920,P<0.01)。
六、SLE患儿血清IL-6水平与抗dsDNA抗体的关系
血清抗dsDNA抗体阳性患儿血清IL-6水平为(83±40) pg/ml(n=14),显著高于血清抗dsDNA抗体阴性患儿的(46±26) pg/ml(n=16)(P<0.01)。
讨 论
IL-6是一种多功能的细胞因子,具有广泛的生物学活性。在生理情况下,正常人外周血中含有极少量的IL-6,肝、脾、肾、外周血白细胞内均能检测到IL-6mRNA表达,本研究检测发现,正常小儿外周血清有少量IL-6存在,单个核细胞内亦有极少量的IL-6含量及IL-6mRNA表达,与文献报道一致
[3],提示IL-6在维持正常人体内环境稳定中有一定的作用。以往已有报道成人SLE患者IL-6表达水平明显高于正常
[4],但有关小儿SLE在这方面的报道甚少。本研究采用简便、快速、敏感且特异的ELISA方法检测,发现SLE患儿血清及新鲜分离的PBMC内IL-6含量均显著高于正常,提示在SLE患儿存在IL-6的过度分泌。正常情况下,单核细胞、纤维母细胞、内皮细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞等众多细胞均能分泌IL-6,SLE患儿体内外周血增高的IL-6从何而来呢?目前尚不清楚。国外有学者从蛋白水平发现,SLE患者的B淋巴细胞在体外进行短期培养时可自发产生IL-1、IL-4、IL-6
[5]。本研究在检测SLE患儿血清及PBMC内IL-6蛋白含量的基础上,为避免体外细胞培养过程各种人为或自然因素的影响,采用原位杂交方法直接检测刚从新鲜外周血分离出来的PBMC的mRNA表达量,发现患儿PBMC内IL-6mRNA表达量显著高于对照组,提示SLE患儿体内PBMC存在IL-6mRNA的过度表达;亦同时证实SLE患儿体内PBMCIL-6mRNA表达与其IL-6蛋白合成相一致,即PBMC内IL-6mRNA表达愈高,PBMC内合成和分泌IL-6蛋白愈多,SLE患儿血清IL-6含量与其PBMC内IL-6含量亦呈正相关。上述研究提示SLE患儿PBMC过度分泌IL-6是其外周血IL-6增高的原因之一。此外,本研究发现活动期SLE患儿血清IL-6水平明显高于非活动期,而后者又高于正常对照组,提示升高的血清IL-6水平可作为SLE活动的一个辅助判断指标。
有学者采用免疫电镜技术发现IL-6抗原存在于SLE患者肾小球系膜细胞内,而正常人则未检出
[6]。本研究亦发现SLE患儿抗dsDNA抗体阳性组血清IL-6水平显著高于阴性组。这些研究结果提示SLE患儿体内异常增高的IL-6可引起机体免疫调节紊乱,促进抗dsDNA自身抗体产生,参与全身性组织损伤,特别是肾损害。
本课题受国家自然科学基金资助(基金编号:39400143)
参考文献
1 王海燕,主编.肾脏病学.第2版.北京:人民卫生出版社,1996,877.
2 Bombardier C, Gladman DD, Urowitz MB, et al. Committee on prognosis in SLE deviation of SLEDAI. Arthritis Rheum, 1992, 35: 630-640.
3 Tovey MG, Content J, Gresser I, et al. Genes for IFN-β-2(IL-6), tumor necrosis factor, and IL-1 are expressed at high levels in the organs of normal individuals. J Immunol, 1988, 141: 3106-3110.
4 Kitani A, Hara M, Hirose T, et al. Autostimulatory effects of IL-6 on excessive B cell differentiation in patients with systemic lupus erythrematosus: analysis of IL-6 production and IL-6R expression. Clin Exp Immunol, 1992, 88:75-83.
5 Tanaka Y, Saito K, Shirakawa F, et al. Production of B-cell stimulating factors by B cells in patients with systemic lupus erythrematosus. J Immunol, 1988, 141:3043-3049.
6 Malide D, Russo P, Bendayan M. Presence of tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 in renal mesangial cells of lupus nephritis patients. Hum Pathol, 1995, 26: 558-564.
(收稿:1998-03-10 修回:1998-06-23)
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