基因工程抗体研究进展
作者：王 琰
单位：王 琰 (海军总医院，北京100037)
关键词：单核细胞；树突状细胞；gp130；表达
中国免疫学杂志/990101
王 琰，男，54岁，教授，解放军海军总医院中心实验科主任，北京医科大学临床肿瘤学院及基础医学院免疫学系兼职教授，第三军医大学兼职教授，主要从事抗体工程研究。
抗体是机体内最复杂的分子，以其特有的基因结构和重组形成了巨大的多样性，可结合任何一种抗原，不仅为机体提供了有效的保护，也成为科学研究、生物技术及临床诊疗的重要工具，在生物试剂产品中，抗体类占了最大份额，因此抗体工程的发展一直是人们关心的热点。从80年代中期，随着DNA重组技术的进展和人们对Ig分子认识的深化，抗体技术由细胞工程抗体(杂交瘤-单克隆抗体)发展到了第三代抗体：基因工程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，将抗体工程推到了一个新的发展阶段。本文将从鼠单抗人源化、小分子抗体、抗体融合蛋白及抗体库技术等方面介绍基因工程抗体的进展情况。
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1 鼠单抗的人源化
鼠单抗作为异源性蛋白在人体内可诱发抗鼠抗体的生成(HAMA)，而用细胞融合-杂交瘤方法制备人单抗未能取得突破性进展，因此尽管单抗在诸多领域得到广泛的应用，但在体内治疗应用却明显滞后。为解决这一难题，鼠单抗人源化成为最早出现的基因工程抗体。从80年代初期发展到现在，鼠单抗人源化经历了如下历程：恒定区人源化→可变区人源化；为保证抗体亲和力而保留某些鼠源残基→利用抗体库技术获得完全人源序列[1]。
1.1 恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体 这一最早出现的方法是将鼠单抗可变区与人抗体恒定区拼接形成人-鼠嵌合抗体。相对于其它人源化方法较易于操作，由于保留了完整的鼠单抗可变区，其亲和力和特异性均得到了保证，但也保留了鼠可变区的异源性，仍可能引起HAMA为其不足，由于不同鼠单抗可变区序列与人可变区序列的同源性不尽相同，他们在人体内引起的HAMA可有很大差别，迄今已研制出很多人-鼠嵌合抗体，有些已陆续进入临床应用，主要用于恶性肿瘤的诊疗。1998年8月美国FDA正式批准了一抗TNF-α人-鼠嵌合抗体用于炎症性肠病，这是首例人-鼠嵌合抗体作为慢性病治疗药品上市，使人-鼠嵌合抗体应用于人体的前景更为乐观。国内从80年代中期开始这方面的研究，已有多株人-鼠嵌合抗体构建成功的报道，有关技术已日臻成熟。
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1.2 可变区的人源化 由于人-鼠嵌合抗体保留了鼠可变区，仍可引起HAMA，有必要将可变区也人源化，最早是通过CDR移植构建“改型抗体”，抗体分子上的抗原结合部位是由VH和VL的6个CDR构成，其它部位(骨架区)的作用是维持特定的立体构象，因此用鼠单抗的CDR替换人可变区中的CDR，所形成的改型抗体应具有亲本鼠单抗的特异性。但实际上改型抗体的构建远非“CDR移植”那么简单，由于骨架区氨基酸残基可影响CDR平面的构象，构建一个理想的“改型抗体”往往涉及到一系列的分析、设计、改建工作。总结27个有亲和力测定数据的改型抗体，63%的亲和力有10%～87%的降低。有人从另一个角度提出了表面残基人源化的路线：鉴于抗原抗体反应仅涉及分子表面，仅改动鼠可变区的表面残基，使其“外表”与人可变区相似，以期消除HAMA，目前只见到经此方法人源化后仍保留亲本鼠单抗特异性和亲和力的报道，未有其消除异源性效果的资料。上面两种方法中，前者最大限度的减少了鼠源序列，可能影响抗体的结合性能，后者最大限度地保留了鼠源序列，可能会更好的维持亲本鼠单抗的抗体结合性能，但其消除异源性的效果将受到影响。目前，这种基于CDR移植的人源化路线是上述二种思路的综合：通过数据库检索、计算机分子模建等寻找有最大同源性的人抗体可变区模板，综合考虑表面残基、与CDR有相互作用或对空间结构有重要影响的残基，确定需要保留和改变的关键残基，再通过分子模建、基因合成、表达检测实际效果，进行必要的修正。这是一个较为复杂的系统工程。迄今国外已构建了相当数量的改型抗体，已有超过20个人源抗体进入临床试用取得较好效果。目前，这种方法是鼠单抗人源化所采取的主要途径，其缺点是具有一定的难度和不确定性(即亲和力可能降低，仍保留不等的鼠源序列)[1]。
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1.3 通过抗体库技术人源化 噬菌体抗体库技术问世后，Jespers等报道了表位导向选择法对鼠单抗进行人源化[2]，其要点为：以鼠单抗为模板，将鼠单抗轻或重链可变区基因与人重或轻链可变区基因库配对，形成杂合抗体库，用相应的抗原进行筛选，选出能和鼠配对并保留其结合活性的人重或轻链可变区基因，再用所获人可变区基因与另一条链的可变区基因库配对，筛选出完整的人可变区基因，这个方法的优点是可以获得完全的人源抗体，但国外继该文后再未见类似工作的正式报道，我们尝试该法取得初步成功[3]，但体会到该法成功率不高，所获抗体性能也难以得到保证。最近Rader等报道在类似上述表位导向选择法中，将所有的人重链和轻链可变区基因库中的CDR3用亲本鼠单抗的CDR3取代再进行筛选，得到了性能良好的人源抗体[4]，此法的普遍可行性如能得到证实，当有较好的应用前景。
总之，国内外迄今已建立了大量鼠单抗，其中不乏具有临床冶疗前景者，因此鼠单抗人源化具有重要意义，目前这方面已取得长足进展，有越来越多人源化抗体进入临床，但目前仍没有完全令人满意简单有效的鼠单人源化方法。
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2 小分子抗体和抗体融合蛋白
小分子抗体因其分子量小、穿透性强、抗原性低、可在原核系统表达以及易于进行基因工程操作等优点而受到人们重视。小分子抗体种类较多，且不断有不同形式的小分子抗体出现，但目前研究较多或实用前景较明确的有以下几种：Fab段、Fv段、单链抗体(ScFv)、二硫键固定的Fv段、Diabody、Minibody等。Fab段是异二聚体，较适于分泌型表达，不适于通过包体大量表达；ScFv是研究最多的小分子抗体，其优越性在于可通过包含体大量表达、易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。近来在ScFv的基础上发展了几种性能较好的小分子抗体：DsFv是在轻链可变区和重链可变区适当部位各引入一个半胱氨酸，形成以二硫键固定的Fv段，经证实其结合能力及稳定性均优于ScFv，用DsFv构建的免疫毒素已进入临床试用前期。Diabody 将ScFv中二个可变区之间的接头缩短，迫使二个分子间VH和VL配对形成双价小分子抗体，其结合性能优于单价分子，如将两种不同特异性的可变区基因交叉配对，则可得到双特异性Diabody。与化学交联法和三体、四体杂交瘤方法制备双特异性抗体相比具备制备简便、稳定、高效、分子量小等优点，有较为广泛的应用前景。较典型的一个例子是最近研制的抗CD19/抗CD3双特异性Diabody可介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。除此以外，人们还设计了多种方案构建双价或双特异性小分子抗体，其基本思路是在ScFv的一端加上一个双聚化结构，其中效果较好并已进行了体内应用研究的有Minibody，这是将Ig分子中的CH3拼接在ScFv的羧基端，通过CH3形成双价分子，有人在荷瘤小鼠比较完整Ig、F(ab')2、ScFv、Diabody及Minibody的免疫显像效果和治疗效果，结果发现Minibody和Diabody的显像效果最好，而在治疗效果中以完整Ig和Minibody为佳。
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将抗体分子片段与其它蛋白融合可得到具有多种生物学功能的融合蛋白，可将其分为二大类，一类是将Fv段与其它生物活性蛋白结合，利用抗体的特异性识别功能将某些生物活性引导于特定部位。导向治疗是其主要应用领域，尤其是肿瘤，将抗肿瘤相关抗体与毒素、酶、细胞因子等融合达到杀伤肿瘤细胞的目的。迄今导向治疗在体外实验及动物实验效果较好，人体内的应用较少，尚待进一步评价，目前应用绿脓杆菌外毒和蓖麻毒素的抗体融合蛋白已进入Ⅱ期临床试用。
另一类是含Fc段的抗体融合蛋白。利用Fc段所特有的生物学功能与某些有粘附或结合功能的蛋白融合又被称为免疫粘附素(immunoadhesin)[5]，Fc段可赋予免疫粘附素以下功能：①通过与抗Ig或蛋白A结合用于检测或纯化；②Fc段介导的抗体效应功能，如ADCC、固定补体及调理作用等；③增加该蛋白在血液中的半衰期。
国内小分子抗体研究较多，以ScFv和Fab为主，Diabody也有成功的报道，用于导向治疗的抗体融合蛋白也有一些实验室在研制中，鉴于我国鼠单抗的研究有一定的基础，在此基础上小分子抗体和抗体融合蛋白的研制有临床应用前景。
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3 抗体库技术
噬菌体抗体库技术是抗体工程领域的最重要进展，在该技术出现以前，基因工程抗体主要是用DNA重组技术对已有单抗进行改造，而抗体库技术发展到了用基因工程技术克隆新的抗体，使抗体工程进入了一个全新的时期。其主要应用价值体现在下述3个方面：
3.1 人源抗体的制备[1] 由于人杂交瘤-单抗体系的低效性，使人单抗的制备一直进展缓慢，抗体库技术为人单抗的制备提供了有效的手段。对于能获得体内免疫的抗原(如微生物感染、疫苗注射等)，从被免疫者获取淋巴细胞构建抗体库，很容易得到高亲和力的人源抗体，国外已研制出了多种抗病毒的人源抗体(包括RSV、HIV、HCV、HBV等)，国内也报道了多株抗肝炎病毒的人源抗体。随着抗体库技术的成熟，大容量抗体库的构建，已能够不经免疫从总抗体库(Master library)筛选出高亲和力的人源抗体[6]，这一技术的普及推广将大大促进人源抗体的制备。现在已有二株来源于抗体库的人源抗体进入了临床Ⅰ/Ⅱ期试用，治疗类风湿性关节炎(抗TNF-α)和眼纤维化(抗TGF-β)。这些进展显示临床人源抗体的应用正面临大的发展。
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3.2 改善抗体的性能 在抗体库技术出现以前，基因工程对抗体的改造限于通过性能明确的已知结构的操作改造抗体，如抗体的人源化、多种小分子抗体和抗体融合蛋白的构建等。抗体库技术使抗体改造能力提高到新的层次：能够以某种特定性能为目标筛选具有该性能的未知结构，尤其可对抗原结合性能进行改良，通常在相应序列引入突变，通过亲合吸附筛选性能得到改进的变种。例如Turner等将ScFv中连接VH和VL的接头序列随机化，建成抗体库筛选到表达量增加，易于复性的接头序列；Hennecke等用类似的方法筛选到更为稳定易于基因操作的接头；Coia等将ScFv基因通过致突菌株引入随机突变，筛选到表达量增加的变种；Saviranta等对睾丸酮有交叉反应的抗雌二醇Fab进行特异性改善，以错配PCR法在VH引入突变，筛选到没有交叉反应的变种；Ftdji等通过对VHCDR3随机化，筛选到催化能力增强的催化抗体。尤为重要的是抗体库技术可以在体外模拟体内的抗体亲和力成熟过程，提高抗体亲和力。此类工作已有不少成功的报道，较典型的例子有Schier等报道的将一抗c-erbB-2 ScFv的亲和力提高了1 230倍，达到0.77×1011M-1[7]，Yang等将一抗HIV抗体的亲和力提高420倍，达到0.67×1011M-1。这些报道显示通过抗体库技术有可能对抗体多方面性能进行改良，获得更具实用价值的抗体。
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3.3 不经免疫制备抗体 抗体库技术可以在体外模拟体内的抗体生成过程，开辟了不经免疫制备抗体的新时代，体内抗体生成的关键有三点：多样性的B细胞群体(B cell repertiore)；克隆选择；亲和力成熟。抗体库技术所具有的强大筛选能力和上节所述的抗体性能改良能力已基本解决了后两点，因此不经免疫制备抗体的关键就在于第一点：即构建性能优良的噬菌体抗体库，这里需要考虑二个参数：大容量和良好的多样性。①抗体库的容量：据报道迄今为止尝试不经免疫制备抗体而构建的抗体库已有十多个[8]，库容从107～6.5×1010不等，分析其效果，发现库容与所获抗体的亲和力大体成正比，107-8的库容所获抗体的亲和力一般在106～107M-1，108～109库容所获抗体亲和力多在107～108M-1，109以上库容可获得108～109M-1的高亲和力抗体。因此构建大容量抗体库是不经免疫制备抗体的关键。目前库容主要受大肠杆菌转化效率的限制，用最有效的电穿孔法，1 μg DNA连接反应物可获得107左右库容，因此构建109以上库容需反复多次构建积累，工作量很大。有人提出组合感染法，将抗体一条链的基因库转化到大肠杆菌中，而将另一条链的基因库制备成噬菌体颗粒进行感染，由于噬菌体感染的效率接近100%，所得库容接近细菌数，可充分利用轻重链的配对获得大容量抗体库，为使位于不同载体的轻重链基因进入同一细菌后能重组到同一载体并形成正确的表达单位，可在二个载体上设计定位重组序列，如噬菌体P1的LoxP序列，该序列在cre蛋白存在时可发生高效率的定位重组。Griffiths等用这个方法构建了迄今报道容量最大的抗体库[9]。但其后再未见到用类似方法成功构建抗体库的报道，故此技术路线的普遍可行性尚有待证明。②抗体库的多样性：目前有3种策略构建多样性抗体库：天然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库。天然抗体库从人体获取淋巴细胞扩增多样性抗体基因构建抗体库；半合成抗体库是在体外模拟V(D)J重排，即人工合成随机化CDR3，与基因组V段(含CDR1和CDR2)组合构建抗体库；全合成抗体库则人工合成全部可变区序列。天然抗体库迄今报道的有5个，最早尝试不经免疫制备抗体就是通过天然抗体库，因库容小效果不甚理想，近来报道了二个大库容天然抗体库[10，11]，对20多个抗原均筛选到高亲和力抗体，效果颇佳。半合成抗体库报道较多，约有10个，其效果也与库容直接相关。其中Griffiths等所构建的达6.5×1010，用30多种抗原筛选均获得较高亲和力抗体[9]。对于天然抗体库和半合成抗体库的优劣，目前评价不一，天然库因自身免疫耐受和接触多种抗原而造成多样性的偏向，因此有些人偏爱半合成抗体库，但体内通过V(D)J重组选择而形成的V基因均具有活性，VH CDR3长度也极广泛，可为5～30多个氨基酸残基不等，半合成抗体库中随机合成的CDR3则可能产生无活性克隆，人工合成的CDR3的长度也受限制。尽管二者各有优缺点，从目前报道看二者均获成功。全合成抗体库尚无正式文献，仅在学术会议上有报道，Pack等在对人抗体序列和立体结构分析的基础上合成了7个VH和7个VL基因，可代表所有抗体类型和结构，这7个VH和VL可组合成49个子抗体库，其CDR为盒式结构，可方便地替换，密码子的设计选用了大肠杆菌偏爱的密码子。Pack等介绍了一个小样本试用的结果：选一个VH和VL构建了一个子抗体库，VHCDR3进行了随机化，库容仅为3×107，对8个抗原筛选全部成功，亲和力为0.2×108 M-1，这一结果确实不错，但由于资料过少，对全合成抗体库的综合评价尚待数据的进一步积累。国内已有半合成抗体库的初步研究，鉴于利用“总抗体库”不经免疫制备抗体的可行性已得到证实，且极具应用潜能，国内应当发展自己的总抗体库。
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综上所述，基因工程抗体的进展已使抗体制备技术进入了一个全新时代，尤其噬菌体抗体库的进展，解决了人源抗体的研制，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发，可以预见基因工程抗体的研制正在进入一个新的高峰。
4 参考文献
[1] Vaughan T, Osbourn J K, Tempest P R et al. Human antibodies by design. Nat Biotechnol, 1998；16:535
[2] Jespers L S, Roberts A, Mahler S M et al. Guiding the selection ofhuman antibodies from phage display repertoires to a single epitope of an antigen. Bio/technol， 1994; 12:899
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[3] 王卓智，王 琰，李 竞et al. 用抗原表位定向选择法人源化抗TNF-α抗体Fab段.中华微生物学和免疫学杂志，1998；18(6)：490
[4] Rader C, Cheresh D A, Barbas C F. A phage display approach for rapid antibody humanization: designed combinatorial V gene library. Proc Natl Acad Sci, 1998;95:8910
[5] Chamow S M, Ashkenazi A. Immunoadhisin: principles and applications. TIBECH, 1996；14:52
[6] Winter G. Synthetic human antibodies and a strategy for protein engineering. FEBS Letts, 1998; 430:92
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[7] Schier R, McCall A, Adams G P et al. Isolation of picomolar affinity anti-c-erbB-2 single-chain Fv by molecular evolution of the complementarity determining region in the center of the antibody binding site. J Mol Biol， 1996； 263:551
[8] Aujme L, Geoffroy F, Sodoyer R. High affinity human antibodies by phage display. Human antibodies，1997; 8:155
[9] Griffiths A D, Williams S C, Hartley O et al. Isolation of high affinity human antibodies directly from large syntheitc repertiores. EMBO J, 1994; 13:3245
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[10] Vaughan T J, Williams A J, Finnern R et al. Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nat biotechnol, 1996; 14:309
[11] Sheets M D, Amersdorfer P, Finnerm R et al. Efficient construction of large non-immune phage antibody library: the production of high affinity human single-chainantibodies to protein antigens. Proc Natl Acad Sci, 1998; 95:6157
〔收稿1999-02-18〕, 百拇医药
单位：王 琰 (海军总医院，北京100037)
关键词：单核细胞；树突状细胞；gp130；表达
中国免疫学杂志/990101
王 琰，男，54岁，教授，解放军海军总医院中心实验科主任，北京医科大学临床肿瘤学院及基础医学院免疫学系兼职教授，第三军医大学兼职教授，主要从事抗体工程研究。
抗体是机体内最复杂的分子，以其特有的基因结构和重组形成了巨大的多样性，可结合任何一种抗原，不仅为机体提供了有效的保护，也成为科学研究、生物技术及临床诊疗的重要工具，在生物试剂产品中，抗体类占了最大份额，因此抗体工程的发展一直是人们关心的热点。从80年代中期，随着DNA重组技术的进展和人们对Ig分子认识的深化，抗体技术由细胞工程抗体(杂交瘤-单克隆抗体)发展到了第三代抗体：基因工程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，将抗体工程推到了一个新的发展阶段。本文将从鼠单抗人源化、小分子抗体、抗体融合蛋白及抗体库技术等方面介绍基因工程抗体的进展情况。
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1 鼠单抗的人源化
鼠单抗作为异源性蛋白在人体内可诱发抗鼠抗体的生成(HAMA)，而用细胞融合-杂交瘤方法制备人单抗未能取得突破性进展，因此尽管单抗在诸多领域得到广泛的应用，但在体内治疗应用却明显滞后。为解决这一难题，鼠单抗人源化成为最早出现的基因工程抗体。从80年代初期发展到现在，鼠单抗人源化经历了如下历程：恒定区人源化→可变区人源化；为保证抗体亲和力而保留某些鼠源残基→利用抗体库技术获得完全人源序列[1]。
1.1 恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体 这一最早出现的方法是将鼠单抗可变区与人抗体恒定区拼接形成人-鼠嵌合抗体。相对于其它人源化方法较易于操作，由于保留了完整的鼠单抗可变区，其亲和力和特异性均得到了保证，但也保留了鼠可变区的异源性，仍可能引起HAMA为其不足，由于不同鼠单抗可变区序列与人可变区序列的同源性不尽相同，他们在人体内引起的HAMA可有很大差别，迄今已研制出很多人-鼠嵌合抗体，有些已陆续进入临床应用，主要用于恶性肿瘤的诊疗。1998年8月美国FDA正式批准了一抗TNF-α人-鼠嵌合抗体用于炎症性肠病，这是首例人-鼠嵌合抗体作为慢性病治疗药品上市，使人-鼠嵌合抗体应用于人体的前景更为乐观。国内从80年代中期开始这方面的研究，已有多株人-鼠嵌合抗体构建成功的报道，有关技术已日臻成熟。
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1.2 可变区的人源化 由于人-鼠嵌合抗体保留了鼠可变区，仍可引起HAMA，有必要将可变区也人源化，最早是通过CDR移植构建“改型抗体”，抗体分子上的抗原结合部位是由VH和VL的6个CDR构成，其它部位(骨架区)的作用是维持特定的立体构象，因此用鼠单抗的CDR替换人可变区中的CDR，所形成的改型抗体应具有亲本鼠单抗的特异性。但实际上改型抗体的构建远非“CDR移植”那么简单，由于骨架区氨基酸残基可影响CDR平面的构象，构建一个理想的“改型抗体”往往涉及到一系列的分析、设计、改建工作。总结27个有亲和力测定数据的改型抗体，63%的亲和力有10%～87%的降低。有人从另一个角度提出了表面残基人源化的路线：鉴于抗原抗体反应仅涉及分子表面，仅改动鼠可变区的表面残基，使其“外表”与人可变区相似，以期消除HAMA，目前只见到经此方法人源化后仍保留亲本鼠单抗特异性和亲和力的报道，未有其消除异源性效果的资料。上面两种方法中，前者最大限度的减少了鼠源序列，可能影响抗体的结合性能，后者最大限度地保留了鼠源序列，可能会更好的维持亲本鼠单抗的抗体结合性能，但其消除异源性的效果将受到影响。目前，这种基于CDR移植的人源化路线是上述二种思路的综合：通过数据库检索、计算机分子模建等寻找有最大同源性的人抗体可变区模板，综合考虑表面残基、与CDR有相互作用或对空间结构有重要影响的残基，确定需要保留和改变的关键残基，再通过分子模建、基因合成、表达检测实际效果，进行必要的修正。这是一个较为复杂的系统工程。迄今国外已构建了相当数量的改型抗体，已有超过20个人源抗体进入临床试用取得较好效果。目前，这种方法是鼠单抗人源化所采取的主要途径，其缺点是具有一定的难度和不确定性(即亲和力可能降低，仍保留不等的鼠源序列)[1]。
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1.3 通过抗体库技术人源化 噬菌体抗体库技术问世后，Jespers等报道了表位导向选择法对鼠单抗进行人源化[2]，其要点为：以鼠单抗为模板，将鼠单抗轻或重链可变区基因与人重或轻链可变区基因库配对，形成杂合抗体库，用相应的抗原进行筛选，选出能和鼠配对并保留其结合活性的人重或轻链可变区基因，再用所获人可变区基因与另一条链的可变区基因库配对，筛选出完整的人可变区基因，这个方法的优点是可以获得完全的人源抗体，但国外继该文后再未见类似工作的正式报道，我们尝试该法取得初步成功[3]，但体会到该法成功率不高，所获抗体性能也难以得到保证。最近Rader等报道在类似上述表位导向选择法中，将所有的人重链和轻链可变区基因库中的CDR3用亲本鼠单抗的CDR3取代再进行筛选，得到了性能良好的人源抗体[4]，此法的普遍可行性如能得到证实，当有较好的应用前景。
总之，国内外迄今已建立了大量鼠单抗，其中不乏具有临床冶疗前景者，因此鼠单抗人源化具有重要意义，目前这方面已取得长足进展，有越来越多人源化抗体进入临床，但目前仍没有完全令人满意简单有效的鼠单人源化方法。
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2 小分子抗体和抗体融合蛋白
小分子抗体因其分子量小、穿透性强、抗原性低、可在原核系统表达以及易于进行基因工程操作等优点而受到人们重视。小分子抗体种类较多，且不断有不同形式的小分子抗体出现，但目前研究较多或实用前景较明确的有以下几种：Fab段、Fv段、单链抗体(ScFv)、二硫键固定的Fv段、Diabody、Minibody等。Fab段是异二聚体，较适于分泌型表达，不适于通过包体大量表达；ScFv是研究最多的小分子抗体，其优越性在于可通过包含体大量表达、易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。近来在ScFv的基础上发展了几种性能较好的小分子抗体：DsFv是在轻链可变区和重链可变区适当部位各引入一个半胱氨酸，形成以二硫键固定的Fv段，经证实其结合能力及稳定性均优于ScFv，用DsFv构建的免疫毒素已进入临床试用前期。Diabody 将ScFv中二个可变区之间的接头缩短，迫使二个分子间VH和VL配对形成双价小分子抗体，其结合性能优于单价分子，如将两种不同特异性的可变区基因交叉配对，则可得到双特异性Diabody。与化学交联法和三体、四体杂交瘤方法制备双特异性抗体相比具备制备简便、稳定、高效、分子量小等优点，有较为广泛的应用前景。较典型的一个例子是最近研制的抗CD19/抗CD3双特异性Diabody可介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。除此以外，人们还设计了多种方案构建双价或双特异性小分子抗体，其基本思路是在ScFv的一端加上一个双聚化结构，其中效果较好并已进行了体内应用研究的有Minibody，这是将Ig分子中的CH3拼接在ScFv的羧基端，通过CH3形成双价分子，有人在荷瘤小鼠比较完整Ig、F(ab')2、ScFv、Diabody及Minibody的免疫显像效果和治疗效果，结果发现Minibody和Diabody的显像效果最好，而在治疗效果中以完整Ig和Minibody为佳。
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将抗体分子片段与其它蛋白融合可得到具有多种生物学功能的融合蛋白，可将其分为二大类，一类是将Fv段与其它生物活性蛋白结合，利用抗体的特异性识别功能将某些生物活性引导于特定部位。导向治疗是其主要应用领域，尤其是肿瘤，将抗肿瘤相关抗体与毒素、酶、细胞因子等融合达到杀伤肿瘤细胞的目的。迄今导向治疗在体外实验及动物实验效果较好，人体内的应用较少，尚待进一步评价，目前应用绿脓杆菌外毒和蓖麻毒素的抗体融合蛋白已进入Ⅱ期临床试用。
另一类是含Fc段的抗体融合蛋白。利用Fc段所特有的生物学功能与某些有粘附或结合功能的蛋白融合又被称为免疫粘附素(immunoadhesin)[5]，Fc段可赋予免疫粘附素以下功能：①通过与抗Ig或蛋白A结合用于检测或纯化；②Fc段介导的抗体效应功能，如ADCC、固定补体及调理作用等；③增加该蛋白在血液中的半衰期。
国内小分子抗体研究较多，以ScFv和Fab为主，Diabody也有成功的报道，用于导向治疗的抗体融合蛋白也有一些实验室在研制中，鉴于我国鼠单抗的研究有一定的基础，在此基础上小分子抗体和抗体融合蛋白的研制有临床应用前景。
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3 抗体库技术
噬菌体抗体库技术是抗体工程领域的最重要进展，在该技术出现以前，基因工程抗体主要是用DNA重组技术对已有单抗进行改造，而抗体库技术发展到了用基因工程技术克隆新的抗体，使抗体工程进入了一个全新的时期。其主要应用价值体现在下述3个方面：
3.1 人源抗体的制备[1] 由于人杂交瘤-单抗体系的低效性，使人单抗的制备一直进展缓慢，抗体库技术为人单抗的制备提供了有效的手段。对于能获得体内免疫的抗原(如微生物感染、疫苗注射等)，从被免疫者获取淋巴细胞构建抗体库，很容易得到高亲和力的人源抗体，国外已研制出了多种抗病毒的人源抗体(包括RSV、HIV、HCV、HBV等)，国内也报道了多株抗肝炎病毒的人源抗体。随着抗体库技术的成熟，大容量抗体库的构建，已能够不经免疫从总抗体库(Master library)筛选出高亲和力的人源抗体[6]，这一技术的普及推广将大大促进人源抗体的制备。现在已有二株来源于抗体库的人源抗体进入了临床Ⅰ/Ⅱ期试用，治疗类风湿性关节炎(抗TNF-α)和眼纤维化(抗TGF-β)。这些进展显示临床人源抗体的应用正面临大的发展。
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3.2 改善抗体的性能 在抗体库技术出现以前，基因工程对抗体的改造限于通过性能明确的已知结构的操作改造抗体，如抗体的人源化、多种小分子抗体和抗体融合蛋白的构建等。抗体库技术使抗体改造能力提高到新的层次：能够以某种特定性能为目标筛选具有该性能的未知结构，尤其可对抗原结合性能进行改良，通常在相应序列引入突变，通过亲合吸附筛选性能得到改进的变种。例如Turner等将ScFv中连接VH和VL的接头序列随机化，建成抗体库筛选到表达量增加，易于复性的接头序列；Hennecke等用类似的方法筛选到更为稳定易于基因操作的接头；Coia等将ScFv基因通过致突菌株引入随机突变，筛选到表达量增加的变种；Saviranta等对睾丸酮有交叉反应的抗雌二醇Fab进行特异性改善，以错配PCR法在VH引入突变，筛选到没有交叉反应的变种；Ftdji等通过对VHCDR3随机化，筛选到催化能力增强的催化抗体。尤为重要的是抗体库技术可以在体外模拟体内的抗体亲和力成熟过程，提高抗体亲和力。此类工作已有不少成功的报道，较典型的例子有Schier等报道的将一抗c-erbB-2 ScFv的亲和力提高了1 230倍，达到0.77×1011M-1[7]，Yang等将一抗HIV抗体的亲和力提高420倍，达到0.67×1011M-1。这些报道显示通过抗体库技术有可能对抗体多方面性能进行改良，获得更具实用价值的抗体。
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3.3 不经免疫制备抗体 抗体库技术可以在体外模拟体内的抗体生成过程，开辟了不经免疫制备抗体的新时代，体内抗体生成的关键有三点：多样性的B细胞群体(B cell repertiore)；克隆选择；亲和力成熟。抗体库技术所具有的强大筛选能力和上节所述的抗体性能改良能力已基本解决了后两点，因此不经免疫制备抗体的关键就在于第一点：即构建性能优良的噬菌体抗体库，这里需要考虑二个参数：大容量和良好的多样性。①抗体库的容量：据报道迄今为止尝试不经免疫制备抗体而构建的抗体库已有十多个[8]，库容从107～6.5×1010不等，分析其效果，发现库容与所获抗体的亲和力大体成正比，107-8的库容所获抗体的亲和力一般在106～107M-1，108～109库容所获抗体亲和力多在107～108M-1，109以上库容可获得108～109M-1的高亲和力抗体。因此构建大容量抗体库是不经免疫制备抗体的关键。目前库容主要受大肠杆菌转化效率的限制，用最有效的电穿孔法，1 μg DNA连接反应物可获得107左右库容，因此构建109以上库容需反复多次构建积累，工作量很大。有人提出组合感染法，将抗体一条链的基因库转化到大肠杆菌中，而将另一条链的基因库制备成噬菌体颗粒进行感染，由于噬菌体感染的效率接近100%，所得库容接近细菌数，可充分利用轻重链的配对获得大容量抗体库，为使位于不同载体的轻重链基因进入同一细菌后能重组到同一载体并形成正确的表达单位，可在二个载体上设计定位重组序列，如噬菌体P1的LoxP序列，该序列在cre蛋白存在时可发生高效率的定位重组。Griffiths等用这个方法构建了迄今报道容量最大的抗体库[9]。但其后再未见到用类似方法成功构建抗体库的报道，故此技术路线的普遍可行性尚有待证明。②抗体库的多样性：目前有3种策略构建多样性抗体库：天然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库。天然抗体库从人体获取淋巴细胞扩增多样性抗体基因构建抗体库；半合成抗体库是在体外模拟V(D)J重排，即人工合成随机化CDR3，与基因组V段(含CDR1和CDR2)组合构建抗体库；全合成抗体库则人工合成全部可变区序列。天然抗体库迄今报道的有5个，最早尝试不经免疫制备抗体就是通过天然抗体库，因库容小效果不甚理想，近来报道了二个大库容天然抗体库[10，11]，对20多个抗原均筛选到高亲和力抗体，效果颇佳。半合成抗体库报道较多，约有10个，其效果也与库容直接相关。其中Griffiths等所构建的达6.5×1010，用30多种抗原筛选均获得较高亲和力抗体[9]。对于天然抗体库和半合成抗体库的优劣，目前评价不一，天然库因自身免疫耐受和接触多种抗原而造成多样性的偏向，因此有些人偏爱半合成抗体库，但体内通过V(D)J重组选择而形成的V基因均具有活性，VH CDR3长度也极广泛，可为5～30多个氨基酸残基不等，半合成抗体库中随机合成的CDR3则可能产生无活性克隆，人工合成的CDR3的长度也受限制。尽管二者各有优缺点，从目前报道看二者均获成功。全合成抗体库尚无正式文献，仅在学术会议上有报道，Pack等在对人抗体序列和立体结构分析的基础上合成了7个VH和7个VL基因，可代表所有抗体类型和结构，这7个VH和VL可组合成49个子抗体库，其CDR为盒式结构，可方便地替换，密码子的设计选用了大肠杆菌偏爱的密码子。Pack等介绍了一个小样本试用的结果：选一个VH和VL构建了一个子抗体库，VHCDR3进行了随机化，库容仅为3×107，对8个抗原筛选全部成功，亲和力为0.2×108 M-1，这一结果确实不错，但由于资料过少，对全合成抗体库的综合评价尚待数据的进一步积累。国内已有半合成抗体库的初步研究，鉴于利用“总抗体库”不经免疫制备抗体的可行性已得到证实，且极具应用潜能，国内应当发展自己的总抗体库。
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综上所述，基因工程抗体的进展已使抗体制备技术进入了一个全新时代，尤其噬菌体抗体库的进展，解决了人源抗体的研制，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发，可以预见基因工程抗体的研制正在进入一个新的高峰。
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〔收稿1999-02-18〕, 百拇医药