茶色素对培养猪离体主动脉内皮细胞功能影响的实验研究
作者：王云开 苏海 程晓曙
单位：王云开 程晓曙 江西医学院第一附属医院心内科，南昌 330006；苏海 江西医学院第二附属医院心内科，南昌 330006
关键词：猪主动脉内皮细胞；一氧化氮；内皮素
高血压杂志/990132 目的 利用体外培养的猪主动脉血管内皮细胞的实验模型，研究茶色素(TP)，左旋精氨酶(L-Arg)，NO合酶抑制剂(L-NAME)对血管内皮细胞增殖及分 泌一氧化氮(NO)、内皮素(ET)的干预作用。 方法 制备3～6代猪主动脉血管内皮细胞的单细胞悬液。分为六个组，每组8孔，5×104个细胞/孔。a.对照组，b.L-Arg(10 μmol/L )组，c.L-NAME(10-2μmol/L)组，d.茶色素分低(10 μg/ml)、中(50μg/ml)、高(100μg/ml)剂量三个组，培养1,3,5天后分别进行细胞计数，培养48小时后测培养液中的NO及ET含量。 结果 (1)细胞生长试验：L-Arg组与对照组相比细胞数明显减少，而L-NAME与对照组相比，细胞数明显增加。茶色素低、中、 高剂量三个组分别与对照组相比，细胞数均明显减少，其抑制作用与剂量相关;(2)PAEC分泌NO及ET含量：L-Arg组与对照组相比，ET降低， NO升高；而L-NAME与对照组相比，ET增高，NO降低。茶色素低、中、高剂量三个组与对照组相比，NO升高，ET降低，并与剂量相关。 结论 茶色素抑制离体培养的PAEC增殖，抑制ET分泌，促进NO释放，且与剂量相关；其作用同L-Arg；而L-NAME则呈相反作用。
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The Effects of Tea Pigment on Functions of Porcine Aorta
Endothelial Cells in vitro
WANG YunKai, Su Hai, CHEN XiaoShu
(Department of Cardiology,The first Affiliated Hospital, JiangXi College, Nangchang. 330006)
ABSTRACT Objective We investigated the effect of tea pigment on the release of nitric oxide(NO) and endothelin in culture endothelial cell from porcine aorta. The effect of l-arginine (L-Arg) and NG-nitro-arginine methylester(L-NAME) on the NO,ET were studied and compared with the effect of tea pigment. Methods PAEC was isolated by collagenase and pancreatin digestion. The 3～6th generation of cultured PAEC were used with the cell count of 5×106/ml in each core.The experiment consisted of 6 groups A.control group B. L-Arg(10 μmol/L) group C. L-NAME(10-2μmol/L) group D.three kind of dosages tea pigment. Low(10 μg/ml),Middle(50 μg/ml),High(100 μg/ml). Results (1) L-Arg inhibited the proliferation of PAEC. L-NAME stimulated proliferation of PAEC, compared with the control group. Tea pigment inhibited the growth of PAEC in a dosage-dependent manner. L-Arg(10 μmol/L) reduced ET and enhanced NO release.L-NAME reduced NO and enhanced ET release,compared with the control group.The tea pigments were dose dependently reduced the release of ET,and increased the release of NO. Conclusions L- Arg and three dosages tea pigment can inhibit prolifertion of PAEC in vitro and inhibit releasing of ET, and increase the secretion of NO.The effects of L-NAME were inverse, compared with that of L-Arg.
, 百拇医药
KEY WORDS Porcine aorta endothelial cells; Nitric oxide; Endothelin
血管内皮细胞(Endothelial Cells,EC )是心血管系统调节介导物质，具有重要的内分泌功能，其分泌的物质与神经递质及体液因素一起，组成了一个较完整的调节心血管激素系统，具有控制心血管活动、 代谢等多种功能，内皮功能的损害是多种心血管疾病发生、发展的病因。 茶色素(Tea pigment,TP)是从茶叶中提取的天然药物， 既往研究表明：有降血脂，清除自由基等作用。利用体外培养的猪主动脉(Porcine aorta endothelial cells,PAEC)血管内皮细胞的实验模型，研究茶色素(Tea pigment,TP)，左旋精氨酸(L-Arginine,L-Arg),NO合酶抑制剂L-NAME对血管内皮细胞增殖及分泌NO,ET的影响，为临床指导用药提供实验依据。
MATERIALS AND METHODS
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1 实验材料与仪器：动物为健康成年公猪：L-Arg, L-NAME, 1640培养粉、胶原酶与胰蛋白酶(均为sigma公司)，茶色素粉剂(江西绿色制药有限公司提供)，CO2细胞培养箱(美国Precision Scientific Co)等。
2 方法
2.1 细胞的收集、接种、传代、培养：参照文献方法[1～3]：按外科常规，取公猪主动脉血管，用胰蛋白酶和胶原酶消化，用含20%小牛血清(CS)-1640制成悬液，将收集的PAEC 移入培养瓶，置培养箱内培养。 用乙酰低密度脂蛋白的吸收法进行鉴别排除平滑肌细胞。将细胞悬液调整细胞密度为 5.0×106/ml进行1:5传代，取3～6代的细胞用于实验[2]。细胞计数采用台盼蓝排除法， 根据需要可调试不同浓度的细胞悬液。
2.2 实验分组：共分六个组，每组8孔。(a)对照组;(b)L-Arg组(10μmol/L)；(c)L-NAME组(10-2μmol/L)；(d)茶色素低(10 μg/ml)、中(50 μg/ml)、高(100 μg/ml)剂量三个组
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2.3 实验指标观察
2.3.1 细胞生长实验：每孔均加入细胞数1.0×104/ml 0.5 ml;放进孵育箱中培养,弃20%小牛血清(CS)1640培养液,加含0.5%小牛血清(cs)-1640 0.5 ml 进行培养维持细胞生长，培养的第1、3、5天分别作细胞计数，同时每天更换培养液和添加相应药物。
2.3.2 PAEC分泌NO、ET的量效关系：每孔加细胞数为1.0×104/ml 0.5ml，放进孵育箱中一起培养，弃20%小牛血清(cs)-1640培养液，改无血清培养后，加入相应药物培养48小时后收集各组份的条件培养液，待测NO,ET含量。
3 PAEC的形态学及条件培养液中NO,ET的测定方法
3.1 PAEC的形态学观察：各实验组的PAEC的形态特征用倒置显微镜观察比较， 观察到猪主动脉内皮细胞呈典型的鹅卵石状态。
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3.2 一氧化氮(酶法)浓度的测定(NO)：一氧化氮试剂盒(酶法)购自南京建成生物工程研究所， 本法用硝酸还原酶特异性将NO3-还原为NO2-，通过显色深浅，测样品吸收值。 公式算出待测样品的NO浓度。
3.3 内皮素浓度的测定(ET)：内皮素放免试剂盒购自解放军总医院东亚免疫技术研究所。 采用特异性RIA测定。
4 数据统计：所有的数据均以±s，均数之间差别检验以t检验分析，P<0.05有显著统计学意义。
RESULTS
1 细胞生长试验：L-Arg(10 μmol/L)明显抑制细胞增殖，L-NAME(10-2μmol/L)促进细胞增殖。茶色素在不同浓度下均抑制细胞增殖(见Tab 1)。
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Tab 1 Effect of L-Arg, L-NAME,and TP on the proliferation of PAEC(
±s) Groups
PAEC(104 cell)
1 st
3 rd
5th d
Control
0.71±0.10
1.89±0.08
4.80±0.12
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L-Arg(10 μmol/L)
0.51±0.12**
0.75±0.18**
1.01±0.08**
L-NAME(10-2μmol/L)
0.85±0.08**
2.26±0.10**
7.70±0.11**
TP(10 μg/ml)
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0.68±0.14*
1.35±0.05*
2.76±0.16*
TP(50 μg/ml)
0.63±0.08*
1.12±0.07*
2.12±0.06*
TP(100 μg/ml)
0.58±0.10**
1.01±0.06**
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1.86±0.07**
*：P<0.05；**：P<0.01 vs control
2 PAEC分泌一氧化氮(NO)及内皮素(ET)含量：L-Arg明显促进NO含量产生和抑制ET的产生，而L-NAME则相反。茶色素在不同浓度下有L-Arg同样的作用，尤其在高浓度时其效果接近L-Arg(10 μmol/L)的作用(见Tab 2)。
Tab 2 Effect of L-Arg, L-NAME,and TP on the NO,ET secretion by PAEC(±s) Groups
PAEC(Cultured 2 d)
NO
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(μmol/L)/104 cell
ET
(pg/ml)/104 cell
Control
40.20±2.10
350.10±12.01
L-Arg(10μmol/L)
63.03±5.20**
221.01±25.01**
L-NAME(10-2μmol/L)
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27.07±3.20**
408.02±10.02**
TP(10μg/ml)
45.10±4.21*
325.02±14.05*
TP(50μg/ml)
48.10±4.07*
298.12±13.20*
TP(100μg/ml)
53.01±7.63**
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279.05±15.02**
*:P<0.05; **：P<0.01 vs controlDISCUSSION
众所周知,内皮细胞不仅是全身血管内膜的屏障结构，而且是一个重要的内分泌器官，近来研究发现具有多方面的生理功能。 正常情况下，血管内皮细胞可释放多种生物活性物质，如前列环素(PGI2)， 内皮衍生性松驰因子(EDRF)及ET等在调节血管壁张力， 维持血液在血管内的流动性等方面起着重要作用， 一旦血管内皮细胞受到一些损伤因素如缺氧、药物等损害，很多内源性物质如凝血酶、ADP、ATP和5-HT 等的舒血管作用转变缩血管效应[4,5]。使ET/NO协调状态受到影响。1987年，Palmer等[6]用生物化学分析法确定内皮衍生性松驰因子就是NO。NO 合成与释放的生理调节机制仍不清楚。
NG-硝基-L-精氨酸甲基酯(NG-nitro-arginine methylester,L-NAME)是一种NO生成的抑制剂。研究证实，L-NAME可以抑制大鼠主动脉环内皮依赖性血管扩张，并可增加大鼠体循环平均压[7]。L-NAME水溶性，长期给大鼠口服则导致持续性全身血压升高，L-Arg不能逆转L- NAME 抑制NOS的作用[8]。
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本实验结果显示，L-NAME对培养离体PAEC增殖具有促进作用， 还发现促使PAEC分泌ET增高，抑制NO分泌。可能是由于L-NAME 作用于血管内皮细胞激活细胞内Ca2+、钙调素，抑制内皮源性舒张因子，也就是NO 的分泌，激活内皮源性收缩因子，尤其是ET的分泌。
本研究发现，L-NAME促进ET分泌作用，可能机制是血管内皮细胞在药物作用下，致使细胞通透性增加，激活细胞内信息传递途径， 产生一系列生化反应，最终导致收缩装置的收缩[9]。可刺激磷酯酶C(PLC)及磷酯酶A2(PLA2)，同时还可刺激电压依赖型钙通道( VDC) 及受体调控型钙通道(ROC)。由二磷酸磷酰肌醇(PIP2)形成三磷酸肌醇(IP3)， 使钙离子从钙贮备部位释放，二酰甘油(DG)激活蛋白酶C(PKC) 后使细胞内游离钙离子浓度增高，产生和分泌ET增加。
, 百拇医药 L-Arg是体内NO合成的前体，由细胞内NOS催化生成NO， 体内许多器官组织都有NO合成系统。NO是嗜脂性物质，极易通过细胞膜进入靶细胞，使细胞内的环磷酸鸟苷(cGMP)水平增高而介导血管扩张。
有报道长期给予L-Arg可减轻家兔动脉粥样硬化(AS)的程度[10]，提示补充L-Arg可能有利于AS的防治。L-Arg 输入高胆固醇血症患者和兔的冠状动脉后，可逆转NO释放的减少[11]， 也可减轻猪心肌缺血再灌注损伤。Candipan等[12]做的动物实验也表明，给具内膜损伤的动物口服L-Arg能增强血管NO的生成和减少超氧阴离子的形成，并且口服L-Arg和损伤表面积减少呈相关性，因而说明NO活性的恢复能导致内膜损伤的消退，所以用L-Arg治疗具有潜在的临床意义。
本研究发现，L-Arg对培养离体PAEC是抑制其增殖，使其功能或形态免受损害，促进NO分泌，抑制ET分泌，其结果同L-NAME相反。其可能机制是合成NO的底物L-Arg增多，使Ca2+/钙调素依赖的NO 合酶激活，L-Arg N端胍基脱氨氧化生成NO和L-瓜氨酸增多，并在自体活性物、P物质、组胺、凝血酶等可启动，激活NO进一步的释放。
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茶色素是从绿茶叶中提取的一种以儿茶素为主的多元酚类物质及其衍生物质，茶叶以及茶叶中的某些提取物(茶多酚、 儿茶素)具有抗氧化作用[13]，抗脂质过氧化物(LPO)含量，能清除自由基，保护细胞免受损害。
本研究发现，茶色素对培养离体PAEC具有抑制其增殖， 并与剂量相关，抑制血管内皮细胞分泌ET、促进血管内皮细胞分泌NO。 动脉粥样硬化症患者血浆脂质过氧化物(LPO)含量增加[14]，LPO 引起的主动脉内膜损伤是人类动脉粥样硬化症发生中最早出现的变化[15]。活性氧自由基、H2O2和LPO可以引起血小板膜的损伤， 促进血小板在受损的主动脉内膜表面聚集粘着，加重内膜损伤程度，加速动脉粥样斑块的形成[16]。 细胞损伤的主要原因之一，可能是脂质过氧化过程中生成的氧自由基， 对生物膜磷脂中多不饱和脂肪酸细胞中的酶和其它成分造成破坏。 茶色素中的茶多酚是一种十分有效的抗氧化剂，其清除活性自由基的有效率达92%～98%[13]。茶色素可能是通过其清除氧自由基的作用而导致LPO含量降低，保护血管内皮细胞免遭损伤，抑制细胞增殖，且使Ca2+/钙调素依赖的NO合酶激活，也可能还有象L-Arg一样的其它机制存在，升高NO，降低ET，值得进一步探讨。 茶色素的作用将有利于临床上高血压病对靶器官损害的早期逆转，延缓高血压病的进展，其抑制内膜细胞增生， 减少动脉粥样斑块的形成，从而利于减轻血管的病理性狭窄，改善心肌缺血， 有益于冠心病的防治。总之， 茶色素在临床上应用于心血管疾病有一定的治疗价值，值得进一步研究。
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REFERENCES
1 尹小川,刘建康,周序珑,等.三七总皂甙对培养的猪主动脉内皮细胞释放一氧化氮的影响 中国动脉硬化杂志 1996;4(1),21-23
2 鄂征主编. 组织培养技术 第二版.北京:人民卫生出版社
3 盛民立主编. 血管内皮细胞与疾病 第一版.上海:上海医科大学出版社 1993；37-38,163-165
4 Lin PJ, Pearson PJ,Cartier R, Schaff HV. Superoxide anion mediates the endothelium dependent contractions to secrete by regenerated endothelium J Thorac Cardiovasc Surg 1991；102(3):378-385
, 百拇医药
5 Steinbrecher UP, Zhang HF,lougheed M. Role of oxidatively modified LDL in atherosclerosis Free Radic Biol Med 1990；9(2):155-168
6 Palmer RMJ, Terrige AG, Moncada S. Nitric Oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor Nature 1987；327:524-526
7 Rees DD, Palmer RMJ, Schulz R, et al. Characterization of three inhibitors of endothelial nitric oxide synthase in vitro and in vivo Br J Pharmacol 1990；101:746
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8 Boger RH, Boda-Boger SM, Gerecke U, et al. Long term administration of L-arginine, L-NAME and the exogenous No doner molsidomine modulates urinary nitrate and cGMP excretion in rats Cardivovasc Res 1994；28:494
9 Tamirisa P, Frishman WH, Kumar A. Endothelin and endothelin antagonism: Roles in Cardiovascular health and disease Am Heart J 1995；130(3,Pt I):601-610
10 Cooke JP, et al. Antiatherogenic affects of Larginine in the hypercholesterolemic rabbit J Clin Invest 1992;90: 1168
, http://www.100md.com
11 Warren JB, Pons F, Brady AJB. Nitric oxide biology: Implications for cardiovascular therapeuties. Cardiovasc Res, 1994;28:25-30
12 Candipan RC Wang BY, Buitrago R, et al. Regression or progression dependency on vascular nitric oxide Atheroscler Thromb Vasc Biol 1996;16:44-50
13 杨贤强，等. 茶多酚生物学活性的研究 茶叶科学 1993;13:51
14 Goto Y. Lipid peroxides as a carse of vascular disease IN: Yagi K ed. Lipid peroxides in biology and medicine. New York: Academic Press, 1982:285-303
15 Yagi Y. Assay for serum lipid peroxide level and its dinical significance In: Yagi K ed.Lipid peroxides in biology and medicine, New York: Academic Press 1982:223-242
16 陈瑗，等. 自由基医学 北京：人民军医出版社，1991:223-258
收稿日期：1998-09-03, 百拇医药
单位：王云开 程晓曙 江西医学院第一附属医院心内科，南昌 330006；苏海 江西医学院第二附属医院心内科，南昌 330006
关键词：猪主动脉内皮细胞；一氧化氮；内皮素
高血压杂志/990132 目的 利用体外培养的猪主动脉血管内皮细胞的实验模型，研究茶色素(TP)，左旋精氨酶(L-Arg)，NO合酶抑制剂(L-NAME)对血管内皮细胞增殖及分 泌一氧化氮(NO)、内皮素(ET)的干预作用。 方法 制备3～6代猪主动脉血管内皮细胞的单细胞悬液。分为六个组，每组8孔，5×104个细胞/孔。a.对照组，b.L-Arg(10 μmol/L )组，c.L-NAME(10-2μmol/L)组，d.茶色素分低(10 μg/ml)、中(50μg/ml)、高(100μg/ml)剂量三个组，培养1,3,5天后分别进行细胞计数，培养48小时后测培养液中的NO及ET含量。 结果 (1)细胞生长试验：L-Arg组与对照组相比细胞数明显减少，而L-NAME与对照组相比，细胞数明显增加。茶色素低、中、 高剂量三个组分别与对照组相比，细胞数均明显减少，其抑制作用与剂量相关;(2)PAEC分泌NO及ET含量：L-Arg组与对照组相比，ET降低， NO升高；而L-NAME与对照组相比，ET增高，NO降低。茶色素低、中、高剂量三个组与对照组相比，NO升高，ET降低，并与剂量相关。 结论 茶色素抑制离体培养的PAEC增殖，抑制ET分泌，促进NO释放，且与剂量相关；其作用同L-Arg；而L-NAME则呈相反作用。
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The Effects of Tea Pigment on Functions of Porcine Aorta
Endothelial Cells in vitro
WANG YunKai, Su Hai, CHEN XiaoShu
(Department of Cardiology,The first Affiliated Hospital, JiangXi College, Nangchang. 330006)
ABSTRACT Objective We investigated the effect of tea pigment on the release of nitric oxide(NO) and endothelin in culture endothelial cell from porcine aorta. The effect of l-arginine (L-Arg) and NG-nitro-arginine methylester(L-NAME) on the NO,ET were studied and compared with the effect of tea pigment. Methods PAEC was isolated by collagenase and pancreatin digestion. The 3～6th generation of cultured PAEC were used with the cell count of 5×106/ml in each core.The experiment consisted of 6 groups A.control group B. L-Arg(10 μmol/L) group C. L-NAME(10-2μmol/L) group D.three kind of dosages tea pigment. Low(10 μg/ml),Middle(50 μg/ml),High(100 μg/ml). Results (1) L-Arg inhibited the proliferation of PAEC. L-NAME stimulated proliferation of PAEC, compared with the control group. Tea pigment inhibited the growth of PAEC in a dosage-dependent manner. L-Arg(10 μmol/L) reduced ET and enhanced NO release.L-NAME reduced NO and enhanced ET release,compared with the control group.The tea pigments were dose dependently reduced the release of ET,and increased the release of NO. Conclusions L- Arg and three dosages tea pigment can inhibit prolifertion of PAEC in vitro and inhibit releasing of ET, and increase the secretion of NO.The effects of L-NAME were inverse, compared with that of L-Arg.
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KEY WORDS Porcine aorta endothelial cells; Nitric oxide; Endothelin
血管内皮细胞(Endothelial Cells,EC )是心血管系统调节介导物质，具有重要的内分泌功能，其分泌的物质与神经递质及体液因素一起，组成了一个较完整的调节心血管激素系统，具有控制心血管活动、 代谢等多种功能，内皮功能的损害是多种心血管疾病发生、发展的病因。 茶色素(Tea pigment,TP)是从茶叶中提取的天然药物， 既往研究表明：有降血脂，清除自由基等作用。利用体外培养的猪主动脉(Porcine aorta endothelial cells,PAEC)血管内皮细胞的实验模型，研究茶色素(Tea pigment,TP)，左旋精氨酸(L-Arginine,L-Arg),NO合酶抑制剂L-NAME对血管内皮细胞增殖及分泌NO,ET的影响，为临床指导用药提供实验依据。
MATERIALS AND METHODS
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1 实验材料与仪器：动物为健康成年公猪：L-Arg, L-NAME, 1640培养粉、胶原酶与胰蛋白酶(均为sigma公司)，茶色素粉剂(江西绿色制药有限公司提供)，CO2细胞培养箱(美国Precision Scientific Co)等。
2 方法
2.1 细胞的收集、接种、传代、培养：参照文献方法[1～3]：按外科常规，取公猪主动脉血管，用胰蛋白酶和胶原酶消化，用含20%小牛血清(CS)-1640制成悬液，将收集的PAEC 移入培养瓶，置培养箱内培养。 用乙酰低密度脂蛋白的吸收法进行鉴别排除平滑肌细胞。将细胞悬液调整细胞密度为 5.0×106/ml进行1:5传代，取3～6代的细胞用于实验[2]。细胞计数采用台盼蓝排除法， 根据需要可调试不同浓度的细胞悬液。
2.2 实验分组：共分六个组，每组8孔。(a)对照组;(b)L-Arg组(10μmol/L)；(c)L-NAME组(10-2μmol/L)；(d)茶色素低(10 μg/ml)、中(50 μg/ml)、高(100 μg/ml)剂量三个组
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2.3 实验指标观察
2.3.1 细胞生长实验：每孔均加入细胞数1.0×104/ml 0.5 ml;放进孵育箱中培养,弃20%小牛血清(CS)1640培养液,加含0.5%小牛血清(cs)-1640 0.5 ml 进行培养维持细胞生长，培养的第1、3、5天分别作细胞计数，同时每天更换培养液和添加相应药物。
2.3.2 PAEC分泌NO、ET的量效关系：每孔加细胞数为1.0×104/ml 0.5ml，放进孵育箱中一起培养，弃20%小牛血清(cs)-1640培养液，改无血清培养后，加入相应药物培养48小时后收集各组份的条件培养液，待测NO,ET含量。
3 PAEC的形态学及条件培养液中NO,ET的测定方法
3.1 PAEC的形态学观察：各实验组的PAEC的形态特征用倒置显微镜观察比较， 观察到猪主动脉内皮细胞呈典型的鹅卵石状态。
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3.2 一氧化氮(酶法)浓度的测定(NO)：一氧化氮试剂盒(酶法)购自南京建成生物工程研究所， 本法用硝酸还原酶特异性将NO3-还原为NO2-，通过显色深浅，测样品吸收值。 公式算出待测样品的NO浓度。
3.3 内皮素浓度的测定(ET)：内皮素放免试剂盒购自解放军总医院东亚免疫技术研究所。 采用特异性RIA测定。
4 数据统计：所有的数据均以±s，均数之间差别检验以t检验分析，P<0.05有显著统计学意义。
RESULTS
1 细胞生长试验：L-Arg(10 μmol/L)明显抑制细胞增殖，L-NAME(10-2μmol/L)促进细胞增殖。茶色素在不同浓度下均抑制细胞增殖(见Tab 1)。
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Tab 1 Effect of L-Arg, L-NAME,and TP on the proliferation of PAEC(
±s) GroupsPAEC(104 cell)
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3 rd
5th d
Control
0.71±0.10
1.89±0.08
4.80±0.12
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L-Arg(10 μmol/L)
0.51±0.12**
0.75±0.18**
1.01±0.08**
L-NAME(10-2μmol/L)
0.85±0.08**
2.26±0.10**
7.70±0.11**
TP(10 μg/ml)
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0.68±0.14*
1.35±0.05*
2.76±0.16*
TP(50 μg/ml)
0.63±0.08*
1.12±0.07*
2.12±0.06*
TP(100 μg/ml)
0.58±0.10**
1.01±0.06**
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1.86±0.07**
*：P<0.05；**：P<0.01 vs control
2 PAEC分泌一氧化氮(NO)及内皮素(ET)含量：L-Arg明显促进NO含量产生和抑制ET的产生，而L-NAME则相反。茶色素在不同浓度下有L-Arg同样的作用，尤其在高浓度时其效果接近L-Arg(10 μmol/L)的作用(见Tab 2)。
Tab 2 Effect of L-Arg, L-NAME,and TP on the NO,ET secretion by PAEC(
±s) GroupsPAEC(Cultured 2 d)
NO
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(μmol/L)/104 cell
ET
(pg/ml)/104 cell
Control
40.20±2.10
350.10±12.01
L-Arg(10μmol/L)
63.03±5.20**
221.01±25.01**
L-NAME(10-2μmol/L)
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27.07±3.20**
408.02±10.02**
TP(10μg/ml)
45.10±4.21*
325.02±14.05*
TP(50μg/ml)
48.10±4.07*
298.12±13.20*
TP(100μg/ml)
53.01±7.63**
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279.05±15.02**
*:P<0.05; **：P<0.01 vs controlDISCUSSION
众所周知,内皮细胞不仅是全身血管内膜的屏障结构，而且是一个重要的内分泌器官，近来研究发现具有多方面的生理功能。 正常情况下，血管内皮细胞可释放多种生物活性物质，如前列环素(PGI2)， 内皮衍生性松驰因子(EDRF)及ET等在调节血管壁张力， 维持血液在血管内的流动性等方面起着重要作用， 一旦血管内皮细胞受到一些损伤因素如缺氧、药物等损害，很多内源性物质如凝血酶、ADP、ATP和5-HT 等的舒血管作用转变缩血管效应[4,5]。使ET/NO协调状态受到影响。1987年，Palmer等[6]用生物化学分析法确定内皮衍生性松驰因子就是NO。NO 合成与释放的生理调节机制仍不清楚。
NG-硝基-L-精氨酸甲基酯(NG-nitro-arginine methylester,L-NAME)是一种NO生成的抑制剂。研究证实，L-NAME可以抑制大鼠主动脉环内皮依赖性血管扩张，并可增加大鼠体循环平均压[7]。L-NAME水溶性，长期给大鼠口服则导致持续性全身血压升高，L-Arg不能逆转L- NAME 抑制NOS的作用[8]。
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本实验结果显示，L-NAME对培养离体PAEC增殖具有促进作用， 还发现促使PAEC分泌ET增高，抑制NO分泌。可能是由于L-NAME 作用于血管内皮细胞激活细胞内Ca2+、钙调素，抑制内皮源性舒张因子，也就是NO 的分泌，激活内皮源性收缩因子，尤其是ET的分泌。
本研究发现，L-NAME促进ET分泌作用，可能机制是血管内皮细胞在药物作用下，致使细胞通透性增加，激活细胞内信息传递途径， 产生一系列生化反应，最终导致收缩装置的收缩[9]。可刺激磷酯酶C(PLC)及磷酯酶A2(PLA2)，同时还可刺激电压依赖型钙通道( VDC) 及受体调控型钙通道(ROC)。由二磷酸磷酰肌醇(PIP2)形成三磷酸肌醇(IP3)， 使钙离子从钙贮备部位释放，二酰甘油(DG)激活蛋白酶C(PKC) 后使细胞内游离钙离子浓度增高，产生和分泌ET增加。
, 百拇医药 L-Arg是体内NO合成的前体，由细胞内NOS催化生成NO， 体内许多器官组织都有NO合成系统。NO是嗜脂性物质，极易通过细胞膜进入靶细胞，使细胞内的环磷酸鸟苷(cGMP)水平增高而介导血管扩张。
有报道长期给予L-Arg可减轻家兔动脉粥样硬化(AS)的程度[10]，提示补充L-Arg可能有利于AS的防治。L-Arg 输入高胆固醇血症患者和兔的冠状动脉后，可逆转NO释放的减少[11]， 也可减轻猪心肌缺血再灌注损伤。Candipan等[12]做的动物实验也表明，给具内膜损伤的动物口服L-Arg能增强血管NO的生成和减少超氧阴离子的形成，并且口服L-Arg和损伤表面积减少呈相关性，因而说明NO活性的恢复能导致内膜损伤的消退，所以用L-Arg治疗具有潜在的临床意义。
本研究发现，L-Arg对培养离体PAEC是抑制其增殖，使其功能或形态免受损害，促进NO分泌，抑制ET分泌，其结果同L-NAME相反。其可能机制是合成NO的底物L-Arg增多，使Ca2+/钙调素依赖的NO 合酶激活，L-Arg N端胍基脱氨氧化生成NO和L-瓜氨酸增多，并在自体活性物、P物质、组胺、凝血酶等可启动，激活NO进一步的释放。
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茶色素是从绿茶叶中提取的一种以儿茶素为主的多元酚类物质及其衍生物质，茶叶以及茶叶中的某些提取物(茶多酚、 儿茶素)具有抗氧化作用[13]，抗脂质过氧化物(LPO)含量，能清除自由基，保护细胞免受损害。
本研究发现，茶色素对培养离体PAEC具有抑制其增殖， 并与剂量相关，抑制血管内皮细胞分泌ET、促进血管内皮细胞分泌NO。 动脉粥样硬化症患者血浆脂质过氧化物(LPO)含量增加[14]，LPO 引起的主动脉内膜损伤是人类动脉粥样硬化症发生中最早出现的变化[15]。活性氧自由基、H2O2和LPO可以引起血小板膜的损伤， 促进血小板在受损的主动脉内膜表面聚集粘着，加重内膜损伤程度，加速动脉粥样斑块的形成[16]。 细胞损伤的主要原因之一，可能是脂质过氧化过程中生成的氧自由基， 对生物膜磷脂中多不饱和脂肪酸细胞中的酶和其它成分造成破坏。 茶色素中的茶多酚是一种十分有效的抗氧化剂，其清除活性自由基的有效率达92%～98%[13]。茶色素可能是通过其清除氧自由基的作用而导致LPO含量降低，保护血管内皮细胞免遭损伤，抑制细胞增殖，且使Ca2+/钙调素依赖的NO合酶激活，也可能还有象L-Arg一样的其它机制存在，升高NO，降低ET，值得进一步探讨。 茶色素的作用将有利于临床上高血压病对靶器官损害的早期逆转，延缓高血压病的进展，其抑制内膜细胞增生， 减少动脉粥样斑块的形成，从而利于减轻血管的病理性狭窄，改善心肌缺血， 有益于冠心病的防治。总之， 茶色素在临床上应用于心血管疾病有一定的治疗价值，值得进一步研究。
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REFERENCES
1 尹小川,刘建康,周序珑,等.三七总皂甙对培养的猪主动脉内皮细胞释放一氧化氮的影响 中国动脉硬化杂志 1996;4(1),21-23
2 鄂征主编. 组织培养技术 第二版.北京:人民卫生出版社
3 盛民立主编. 血管内皮细胞与疾病 第一版.上海:上海医科大学出版社 1993；37-38,163-165
4 Lin PJ, Pearson PJ,Cartier R, Schaff HV. Superoxide anion mediates the endothelium dependent contractions to secrete by regenerated endothelium J Thorac Cardiovasc Surg 1991；102(3):378-385
, 百拇医药
5 Steinbrecher UP, Zhang HF,lougheed M. Role of oxidatively modified LDL in atherosclerosis Free Radic Biol Med 1990；9(2):155-168
6 Palmer RMJ, Terrige AG, Moncada S. Nitric Oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor Nature 1987；327:524-526
7 Rees DD, Palmer RMJ, Schulz R, et al. Characterization of three inhibitors of endothelial nitric oxide synthase in vitro and in vivo Br J Pharmacol 1990；101:746
, 百拇医药
8 Boger RH, Boda-Boger SM, Gerecke U, et al. Long term administration of L-arginine, L-NAME and the exogenous No doner molsidomine modulates urinary nitrate and cGMP excretion in rats Cardivovasc Res 1994；28:494
9 Tamirisa P, Frishman WH, Kumar A. Endothelin and endothelin antagonism: Roles in Cardiovascular health and disease Am Heart J 1995；130(3,Pt I):601-610
10 Cooke JP, et al. Antiatherogenic affects of Larginine in the hypercholesterolemic rabbit J Clin Invest 1992;90: 1168
, http://www.100md.com
11 Warren JB, Pons F, Brady AJB. Nitric oxide biology: Implications for cardiovascular therapeuties. Cardiovasc Res, 1994;28:25-30
12 Candipan RC Wang BY, Buitrago R, et al. Regression or progression dependency on vascular nitric oxide Atheroscler Thromb Vasc Biol 1996;16:44-50
13 杨贤强，等. 茶多酚生物学活性的研究 茶叶科学 1993;13:51
14 Goto Y. Lipid peroxides as a carse of vascular disease IN: Yagi K ed. Lipid peroxides in biology and medicine. New York: Academic Press, 1982:285-303
15 Yagi Y. Assay for serum lipid peroxide level and its dinical significance In: Yagi K ed.Lipid peroxides in biology and medicine, New York: Academic Press 1982:223-242
16 陈瑗，等. 自由基医学 北京：人民军医出版社，1991:223-258
收稿日期：1998-09-03, 百拇医药