阴道加德纳菌ITS-23S rRNA部分基因克隆及序列分析
作者：黄呈辉 陈汝光 朱美玲 谢春英
单位：黄呈辉 陈汝光 朱美玲(深圳市宝安区中心血站分子生物学实验室)；谢春英(深圳市宝安区人民医院检验科)
关键词：阴道加德纳菌；聚合酶链反应；23S rRNA；序列分析
中华微生物学和免疫学杂志000303 【 摘要 】 目的 分析深圳地区阴道加德纳菌(G.vag)ITS(internal transcribed spacer)-23S rRNA部分基因序列。 方法 设计特异性引物，建立检测G.vag的PCR方法，对临床病人阴道分泌物标本进行检测，并对分离出的4株PCR产物进行分子克隆和序列分析。 结果 分离出的4株G.vagITS-23S rRNA基因的核苷酸同源性在99.5%以上，与Belkum报道株同源性在98%以上。 结论 深圳地区G.vag与国外报道的菌株在ITS-23S rRNA基因区变异不大，可能属同一基因型。
, 百拇医药
Cloning and sequencing of partial genome of ITS-23S rRNA
from Gardnerella vaginalis
HUANG Chenghui, CHEN Ruguang, ZHU Meiling, et al. Shenzhen Baoan Blood Center, Shenzhen 518101, P.R.China
【 Abstract 】 Objective To analysis the sequence of ITS-23S rRNA genome of Gardnerella vaginalis from patients with bacterial vaginosis in Shenzhen city. Methods A pair of primers from ITS-23S rRNA genome were designed and used to detect G.vaginalis by polymerase chain reaction method. The partial G.vaginalis genome isolated from 4 patients with bacterial vaginosis were cloned to T-vector and sequenced by dideoxy chain-termination methods. Results The sequence analysis showed homogeneity of over 99.5% among 4 isolates from Shenzhen and over 98% between Shenzhen isolates and the isolates in Belkums' report. Conclusion There is no significant difference in ITS-23S rRNA genome of G.vaginalis between the isolates from Shenzhen and those from Belkums' report.
, 百拇医药
【 Subject words 】 Gardnerella vaginalis; 23S rRNA; Polymerase chain reaction; Sequence analysis
阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis, G.vag)是一种引起细菌性阴道炎的重要病原菌。由于G.vag在阴道炎病人和无阴道炎临床表现的妇女中均有较高阳性检出率〔1〕，因此引起了许多学者对其致病性的深入研究。近来研究发现，G.vag存在许多种生物型，细菌的致病性和生物型别有关，在有无阴道炎症病人中其生物型分布存在差异〔2〕。本研究通过在ITS-23S rRNA上对阴道加德纳菌进行基因序列分析，了解深圳地区G.vag感染的基因型分布，现将结果报道如下。
材料与方法
标本来源：所有标本均收集于1997年4月至12月深圳市宝安区人民医院门诊及住院部妇科病人，按正规操作方法，用无菌棉拭子取子宫颈分泌物；G.vag标准菌株购自中国医学科学院。
, 百拇医药
实验试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、IPTG、X-gal和T4 DNA连接酶、HhaⅠ和XbaⅠ购自美国Promega公司，pBluscript-T载体、XL1-Blue菌为美国Invitrogen公司产品。阴道加德纳菌选择培养基购自OXOID公司，细菌生化鉴定试剂购自法国梅里埃公司，淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)检测的PCR试剂盒购自华美公司。
G.vag模板的制备：用生理盐水洗涤棉拭子标本后，13000r/min离心5min，弃上清液，在沉淀中加入50μl裂解液，100℃煮沸15min，13000r/min离心5min，取5μl上清液作PCR模板。
G.vag的PCR检测：根据Belkum等〔3〕发表的G.vag ITS-23S rRNA基因序列，用GOLDKEY和OLIGO5.0软件辅助设计一对特异性引物，引物序列分别为：GvP1：5′TTATCAATTTCAACCGGCT3′，GvP2:5′CCGTCACAGGCTGAACAG 3′。引物由美国赛百盛公司合成。PCR扩增反应：10×PCR缓冲液3μl，dNTPs 200μmol/L，Taq酶1.5U，GvP1/GvP2各60ng，5μl模板，30μl反应体积，于PE9600型DNA扩增仪进行扩增。扩增参数为：93℃预变性120s，93℃ 30s，55℃ 30s。72℃ 45s 35个循环后，72℃ 5min。取10μl PCR扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶(含EB 0.5μg/ml)电泳，紫外灯下观察结果。
, http://www.100md.com
PCR产物的克隆和测序：PCR产物经低熔点胶回收纯化后，连接到pBluscript-T载体上，转化感受态菌XL1-Blue,经蓝白斑筛选，PCR方法及酶切鉴定后，提取阳性质粒进行测序。以双链质粒为模板，采用Sanger末端终止法，于ABI377型自动测序仪进行双链测序，结果用CLUSTWAL和GOLDKEY软件进行分析处理。
细菌培养：用无菌棉签涂少许分泌物在阴道加德纳菌兔血选择培养基平板上，于含7% CO2培养箱中，35℃培养48h,观察β溶血反应，并进行细菌生化鉴定。
结果
1.临床病人G.vag检测结果：共检测141例阴道炎病人和129例正常妇女的阴道分泌物标本，这270例标本检查滴虫、念珠菌、淋球菌、解脲脲原体和衣原体均为阴性，G.vag PCR和细菌培养检测结果见表1。所有细菌培养阳性标本，PCR检测均为阳性。
, 百拇医药
表1 阴道炎病人和正常妇女G.vag检测结果
Table 1. The results of detecting G.vag between vaginitis patients and normol women Groups
No.of sample
G.vag culture
positive(%)
PCR
positive(%)
Vaginitis patients
141
, 百拇医药
32(22.7)
36(25.5)
Normal women
129
5(3.9)
6(4.7)
2.G.vag ITS-23S rRNA部分基因的序列分析结果：4株分离自阴道炎病人标本G.vag检测阳性的PCR扩增产物进行克隆测，扩增产物片段约431bp，核苷酸序列分析结果见图1。序列分析发现，
图1 4株G.vag部分基因的序列分析结果
, 百拇医药 Fig 1. The results of partial genome sequencing from four strains of Gardnerella vaginalis
L08167: G.vag isolate from Belkum 1995; Ⅰ-Ⅳ:4 G.vag isolates from patients with vaginitis; *:nucleotide deletion
4株G.vag的ITS-23S rRNA部分基因核苷酸同源性在99.5%以上；与Belkum〔3〕报道的L08167株比较，ITS-23S rRNA部分基因变异较小，核苷酸同源性达98%以上。
讨论
阴道加德纳菌最早从阴道炎病人中分离得到，曾一度被认为是引起阴道炎的主要病原菌，后来在无阴道炎症状的妇女中也有较高的检出率，因而有人对该菌的致病性产生怀疑。近来研究发现，G.vag不仅引起尿道炎和阴道炎外，还可能导致多种并发症，如早产、低体重儿、绒毛膜炎、羊膜炎、羊水感染、子宫内膜炎、急性输卵管炎、手术后感染和子宫颈癌等〔4〕。对G.vag的进一步研究和认识有其重要性。在临床上，部分泌尿生殖系统感染病人，在抗菌正规治疗后，病情总是反复，不能痊愈，而且检测不出常见病原菌，应该考虑G.vag感染因素。我们采用G.vag特异性PCR方法和细菌培养方法检测了部分临床标本，结果发现在排除了常见阴道炎致病菌感染的有阴道炎症状组，G.vag感染率达25.5%，明显高于正常妇女对照组(4.7%，P<0.01)，提示G.vag是阴道炎致病菌之一。建议应对临床不明原因阴道炎病人进行G.vag的检查，以排除G.vag感染引起的阴道炎的可能。
, 百拇医药
有研究显示，G.vag的致病性与生物分型有关，且不同地区显示不同生物型的流行趋势〔2，5〕。Lehner〔6〕和Longhney〔7〕等研究发现，ITS多态性导致不同细菌内谷氨酰tRNA或异亮氨酰tRNA不同，影响到细菌蛋白质的合成和生物特性的表达，因此，ITS内某些多态性的基因位点与细菌的生物学特点关系密切，也是导致G.vag出现不同生物型且致病力不一致的原因之一。我们对从深圳地区病人中分离的4 株G.vag ITS-23S rRNA部分基因进行克隆测序，结果显示我们分离的4株菌之间的基因核苷酸序列同源性较高，体现了ITS-23S rRNA基因在同一地区的相对保守性。4株G.vag基因序列与L08167株比较，ITS-23S rRNA基因上存在一定的差异，变异主要在ITS基因上，有核苷酸的插入和缺失点突变，但所分析序列的核苷酸同源性仍在98%以上，表明深圳地区分离株和L08167株可能属同一基因型。深圳地区是否以此基因型的分布占优势正常妇女和阴道炎病人分离株差异如何由于试验的例数太少，还有待于进一步的研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Hill GB,Dukes CD,Buckshen K, et al.The microbiology of bacterial vaginosis. Am J Obstet Gynecol,1993,169:450-458.
2 Pedraza-Ariles AG.Gardnarella vaginalis biotype:modification of a proposed system.Revlatinoam Microbiol,1995,37(1):19-26.
3 Belkum AV,Koeken A,Vandamme P,et al.Development of a species-specific polymerase chain reaction assay for Gardnerella vaginalis. Molecular and Cel Probes,1995,9(3):167-174.
, 百拇医药
4 Hillier SL,Nugent RP,Eschenbach DA,et al.Association between bacterial vaginosis and preterm delivery of a law-birth-weight infant.N Eangl J Med,1995,333(26):1737-1742.
5 Ingianni A,Petruzzelli S,Morandotti G.Genotypic differentiation of Gardnerella vaginalis by amplified ribosomal DNA restriction analysis(ARDRA). TEMS Immunol Med Microbiol,1997,18(1):61-66.
6 Lehner AF,Harvey S,Hill CW,et al.Mapping and spacer identification of rRNA operons of Salmonella typhimurium. J Bacteriol,1984,160(2):682-686.
7 Loughney K,Lund E,Dahlber JE,et al.tRNA genes are found between the 16S and 23S rRNA genes in Bacillus Subtilis. Nucleic Acids Res,1992,10(5):1607-1624.
(收稿日期：1999-05-31), http://www.100md.com
单位：黄呈辉 陈汝光 朱美玲(深圳市宝安区中心血站分子生物学实验室)；谢春英(深圳市宝安区人民医院检验科)
关键词：阴道加德纳菌；聚合酶链反应；23S rRNA；序列分析
中华微生物学和免疫学杂志000303 【 摘要 】 目的 分析深圳地区阴道加德纳菌(G.vag)ITS(internal transcribed spacer)-23S rRNA部分基因序列。 方法 设计特异性引物，建立检测G.vag的PCR方法，对临床病人阴道分泌物标本进行检测，并对分离出的4株PCR产物进行分子克隆和序列分析。 结果 分离出的4株G.vagITS-23S rRNA基因的核苷酸同源性在99.5%以上，与Belkum报道株同源性在98%以上。 结论 深圳地区G.vag与国外报道的菌株在ITS-23S rRNA基因区变异不大，可能属同一基因型。
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Cloning and sequencing of partial genome of ITS-23S rRNA
from Gardnerella vaginalis
HUANG Chenghui, CHEN Ruguang, ZHU Meiling, et al. Shenzhen Baoan Blood Center, Shenzhen 518101, P.R.China
【 Abstract 】 Objective To analysis the sequence of ITS-23S rRNA genome of Gardnerella vaginalis from patients with bacterial vaginosis in Shenzhen city. Methods A pair of primers from ITS-23S rRNA genome were designed and used to detect G.vaginalis by polymerase chain reaction method. The partial G.vaginalis genome isolated from 4 patients with bacterial vaginosis were cloned to T-vector and sequenced by dideoxy chain-termination methods. Results The sequence analysis showed homogeneity of over 99.5% among 4 isolates from Shenzhen and over 98% between Shenzhen isolates and the isolates in Belkums' report. Conclusion There is no significant difference in ITS-23S rRNA genome of G.vaginalis between the isolates from Shenzhen and those from Belkums' report.
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【 Subject words 】 Gardnerella vaginalis; 23S rRNA; Polymerase chain reaction; Sequence analysis
阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis, G.vag)是一种引起细菌性阴道炎的重要病原菌。由于G.vag在阴道炎病人和无阴道炎临床表现的妇女中均有较高阳性检出率〔1〕，因此引起了许多学者对其致病性的深入研究。近来研究发现，G.vag存在许多种生物型，细菌的致病性和生物型别有关，在有无阴道炎症病人中其生物型分布存在差异〔2〕。本研究通过在ITS-23S rRNA上对阴道加德纳菌进行基因序列分析，了解深圳地区G.vag感染的基因型分布，现将结果报道如下。
材料与方法
标本来源：所有标本均收集于1997年4月至12月深圳市宝安区人民医院门诊及住院部妇科病人，按正规操作方法，用无菌棉拭子取子宫颈分泌物；G.vag标准菌株购自中国医学科学院。
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实验试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、IPTG、X-gal和T4 DNA连接酶、HhaⅠ和XbaⅠ购自美国Promega公司，pBluscript-T载体、XL1-Blue菌为美国Invitrogen公司产品。阴道加德纳菌选择培养基购自OXOID公司，细菌生化鉴定试剂购自法国梅里埃公司，淋病奈瑟菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)检测的PCR试剂盒购自华美公司。
G.vag模板的制备：用生理盐水洗涤棉拭子标本后，13000r/min离心5min，弃上清液，在沉淀中加入50μl裂解液，100℃煮沸15min，13000r/min离心5min，取5μl上清液作PCR模板。
G.vag的PCR检测：根据Belkum等〔3〕发表的G.vag ITS-23S rRNA基因序列，用GOLDKEY和OLIGO5.0软件辅助设计一对特异性引物，引物序列分别为：GvP1：5′TTATCAATTTCAACCGGCT3′，GvP2:5′CCGTCACAGGCTGAACAG 3′。引物由美国赛百盛公司合成。PCR扩增反应：10×PCR缓冲液3μl，dNTPs 200μmol/L，Taq酶1.5U，GvP1/GvP2各60ng，5μl模板，30μl反应体积，于PE9600型DNA扩增仪进行扩增。扩增参数为：93℃预变性120s，93℃ 30s，55℃ 30s。72℃ 45s 35个循环后，72℃ 5min。取10μl PCR扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶(含EB 0.5μg/ml)电泳，紫外灯下观察结果。
, http://www.100md.com
PCR产物的克隆和测序：PCR产物经低熔点胶回收纯化后，连接到pBluscript-T载体上，转化感受态菌XL1-Blue,经蓝白斑筛选，PCR方法及酶切鉴定后，提取阳性质粒进行测序。以双链质粒为模板，采用Sanger末端终止法，于ABI377型自动测序仪进行双链测序，结果用CLUSTWAL和GOLDKEY软件进行分析处理。
细菌培养：用无菌棉签涂少许分泌物在阴道加德纳菌兔血选择培养基平板上，于含7% CO2培养箱中，35℃培养48h,观察β溶血反应，并进行细菌生化鉴定。
结果
1.临床病人G.vag检测结果：共检测141例阴道炎病人和129例正常妇女的阴道分泌物标本，这270例标本检查滴虫、念珠菌、淋球菌、解脲脲原体和衣原体均为阴性，G.vag PCR和细菌培养检测结果见表1。所有细菌培养阳性标本，PCR检测均为阳性。
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表1 阴道炎病人和正常妇女G.vag检测结果
Table 1. The results of detecting G.vag between vaginitis patients and normol women Groups
No.of sample
G.vag culture
positive(%)
PCR
positive(%)
Vaginitis patients
141
, 百拇医药
32(22.7)
36(25.5)
Normal women
129
5(3.9)
6(4.7)
2.G.vag ITS-23S rRNA部分基因的序列分析结果：4株分离自阴道炎病人标本G.vag检测阳性的PCR扩增产物进行克隆测，扩增产物片段约431bp，核苷酸序列分析结果见图1。序列分析发现，
图1 4株G.vag部分基因的序列分析结果
, 百拇医药 Fig 1. The results of partial genome sequencing from four strains of Gardnerella vaginalis
L08167: G.vag isolate from Belkum 1995; Ⅰ-Ⅳ:4 G.vag isolates from patients with vaginitis; *:nucleotide deletion
4株G.vag的ITS-23S rRNA部分基因核苷酸同源性在99.5%以上；与Belkum〔3〕报道的L08167株比较，ITS-23S rRNA部分基因变异较小，核苷酸同源性达98%以上。
讨论
阴道加德纳菌最早从阴道炎病人中分离得到，曾一度被认为是引起阴道炎的主要病原菌，后来在无阴道炎症状的妇女中也有较高的检出率，因而有人对该菌的致病性产生怀疑。近来研究发现，G.vag不仅引起尿道炎和阴道炎外，还可能导致多种并发症，如早产、低体重儿、绒毛膜炎、羊膜炎、羊水感染、子宫内膜炎、急性输卵管炎、手术后感染和子宫颈癌等〔4〕。对G.vag的进一步研究和认识有其重要性。在临床上，部分泌尿生殖系统感染病人，在抗菌正规治疗后，病情总是反复，不能痊愈，而且检测不出常见病原菌，应该考虑G.vag感染因素。我们采用G.vag特异性PCR方法和细菌培养方法检测了部分临床标本，结果发现在排除了常见阴道炎致病菌感染的有阴道炎症状组，G.vag感染率达25.5%，明显高于正常妇女对照组(4.7%，P<0.01)，提示G.vag是阴道炎致病菌之一。建议应对临床不明原因阴道炎病人进行G.vag的检查，以排除G.vag感染引起的阴道炎的可能。
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有研究显示，G.vag的致病性与生物分型有关，且不同地区显示不同生物型的流行趋势〔2，5〕。Lehner〔6〕和Longhney〔7〕等研究发现，ITS多态性导致不同细菌内谷氨酰tRNA或异亮氨酰tRNA不同，影响到细菌蛋白质的合成和生物特性的表达，因此，ITS内某些多态性的基因位点与细菌的生物学特点关系密切，也是导致G.vag出现不同生物型且致病力不一致的原因之一。我们对从深圳地区病人中分离的4 株G.vag ITS-23S rRNA部分基因进行克隆测序，结果显示我们分离的4株菌之间的基因核苷酸序列同源性较高，体现了ITS-23S rRNA基因在同一地区的相对保守性。4株G.vag基因序列与L08167株比较，ITS-23S rRNA基因上存在一定的差异，变异主要在ITS基因上，有核苷酸的插入和缺失点突变，但所分析序列的核苷酸同源性仍在98%以上，表明深圳地区分离株和L08167株可能属同一基因型。深圳地区是否以此基因型的分布占优势正常妇女和阴道炎病人分离株差异如何由于试验的例数太少，还有待于进一步的研究。
, 百拇医药
参考文献
1 Hill GB,Dukes CD,Buckshen K, et al.The microbiology of bacterial vaginosis. Am J Obstet Gynecol,1993,169:450-458.
2 Pedraza-Ariles AG.Gardnarella vaginalis biotype:modification of a proposed system.Revlatinoam Microbiol,1995,37(1):19-26.
3 Belkum AV,Koeken A,Vandamme P,et al.Development of a species-specific polymerase chain reaction assay for Gardnerella vaginalis. Molecular and Cel Probes,1995,9(3):167-174.
, 百拇医药
4 Hillier SL,Nugent RP,Eschenbach DA,et al.Association between bacterial vaginosis and preterm delivery of a law-birth-weight infant.N Eangl J Med,1995,333(26):1737-1742.
5 Ingianni A,Petruzzelli S,Morandotti G.Genotypic differentiation of Gardnerella vaginalis by amplified ribosomal DNA restriction analysis(ARDRA). TEMS Immunol Med Microbiol,1997,18(1):61-66.
6 Lehner AF,Harvey S,Hill CW,et al.Mapping and spacer identification of rRNA operons of Salmonella typhimurium. J Bacteriol,1984,160(2):682-686.
7 Loughney K,Lund E,Dahlber JE,et al.tRNA genes are found between the 16S and 23S rRNA genes in Bacillus Subtilis. Nucleic Acids Res,1992,10(5):1607-1624.
(收稿日期：1999-05-31), http://www.100md.com