高效液相色谱法同时检测人血清中全反式及13-顺式维甲酸浓度
作者：余自成 姚帅 郁人海
单位：余自成 郁人海(上海第二医科大学瑞金医院临床药理研究室 上海 200025)；姚帅(上海中医药大学1999届实习生)
关键词：全反式维甲酸；13-顺式维甲酸；血药浓度；高效液相色谱法
药物分析杂志000403 摘要 目的：建立高效液相色谱方法同时检测人血清中全反式及13-顺式维甲酸浓度。方法：色谱柱：μBondapak C18(3.9 mm×300 mm)，流动相：甲醇-醋酸铵缓冲液(85∶15)，流速：0.8 mL.min-1，紫外检测波长：340 nm，柱温：22 ℃，血清样品经乙醚2次提取，按内标法定量，内标物选用对二甲氨基苯甲醛。结果：全反式及13-顺式维甲酸的线性范围分别在0.8～1 120 μg.L-1和0.82～1 312 μg.L-1，最低检测浓度均为0.6 μg.L-1。全反式维甲酸测定的平均回收率为98.86%～105.2%，日内、日间精密度RSD为0.84%～5.5%，13-顺式维甲酸测定的平均回收率为101.6%～101.8%，日内、日间精密度RSD为1.4%～5.7%。结论：本方法灵敏、准确，样品处理简便易行，适用于全反式维甲酸的临床药动学研究。
, 百拇医药
Simultaneous Determination of All-trans-and 13-cis-Retinoic Acid in Human Serum by HPLC
Yu Zicheng Yao Shuai Yu Renhai
(Institute of Clinical Pharmacology,Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025)
Abstract Objective：To develop an isocratic HPLC for the simultaneous determination of all-trans-and 13-cis-retinoic acid(ATRA,13-cRA)in human serum.Methods:The serum sample(1 mL)was extracted with 5 mL of ether for twice.The extract was analyzed on an μBondapak C18(3.9 mm×300 mm)column with a mobile phase consisting of 85 Vols.of methanol and 15 Vols.of NH4Ac buffer(pH 6.0)at 22 ℃.The flow rate was 0.8 mL.min-1.The retinoids were detected at 340 nm and quantitated by internal standard method,DMAB was used as an internal standard.Results:The linearity of method was in the range of 0.8 to 1 120 μg.L-1 for ATRA and 0.82 to 1 312 μg.L-1 for 13-cRA.The limit of determination was 0.6 μg.L-1 in serum for both ATRA and 13-cRA.Average recoveries were 98.86%～105.2% for ATRA,101.6%～101.8% for 13-cRA.Within-day and between-day percision of determination were 0.84%～5.5% for ATRA and 1.4%～5.7% for 13-cRA.Conclusion:This method is sensitive,accurate and good enough to be utilized for the investigation of the clinical pharmacokinetics of ATRA.
, 百拇医药
Key words all-trans-retinoic acid,13-cis-retinoic acid,serum drug concentration,HPLC▲
全反式维甲酸(All-Trans-Retinoic Acid,ATRA)是维生素A的天然氧化代谢产物，在体内经可逆代谢而成13-顺式维甲酸(13-cRA)。ATRA是目前治疗急性早幼白血病(APL)最有效的药物，多数患者用药后病情获得缓解[1～3]，但在持续用药过程中很快出现耐药，复发几乎普遍发生，其原因可能是ATRA对参与其代谢的酶活性具有自身诱导作用，持续用药导致血药浓度逐步降低[4]。本文建立了一种灵敏、准确的HPLC法，可同时检测人血清中ATRA及13-cRA浓度，此方法可用于ATRA临床药动学及体内ATRA与13-cRA间的相互转化关系的研究。
1 仪器与试药
, http://www.100md.com Waters高效液相色谱仪，包括510型恒流泵，486型可调波长UV检测器，PCM，TCM，Millennium 2010色谱管理系统。XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)，800型离心沉淀器(上海手术器械十厂)。
ATRA及13-cRA对照品(上海第六制药厂提供，含量为99.68%)；对二甲氨基苯甲醛(DMAB，上海试剂三厂)；甲醇为色谱纯，乙醚、醋酸铵，冰醋酸均为分析纯。醋酸铵缓冲液配制：取醋酸铵33.3 g，加水100 mL溶解，加冰醋酸2.3 mL混合，摇匀，即得。
2 色谱条件
色谱柱：μBondapak C18(10 μm，3.9 mm×300 mm)；流动相：甲醇-醋酸铵缓冲液(85∶15)；流速：0.8 mL.min-1；紫外检测波长：340 nm；柱温：22 ℃；检测灵敏度：0.002 AUFS。
, http://www.100md.com
3 样品处理方法
取血清样品1 mL，加入内标DMAB 100 ng，用乙醚10 mL分2次提取，每次5 mL，旋涡振荡提取0.5 min，1 500 r.min-1离心5 min，合并乙醚提取液至尖底试管中，在40 ℃水浴中用纯N2吹干，用乙醚0.5 mL淋洗管壁，再用纯N2吹干，将残渣用甲醇40 μL溶解，取20 μL进样。
4 结果
4.1 色谱行为 在上述色谱条件下，ATRA与13-cRA、内标物及血清内源物质能够实现较好分离，色谱图见图1，ATRA、13-cRA及内标物保留时间分别为8.43，7.65，4.58 min。
, http://www.100md.com 图1 ATRA及13-cRA分离色谱图
A.空白血清 B.含药血清
1.ATRA 2.13-cRA 3.内标物
4.2 标准曲线 取空白血清1 mL，分别加入ATRA及(13-cRA)标准甲醇溶液适量精密配成浓度为0.8(0.82)，4(4.1)，16(16.4)，80(82)，160(164)，480(492)，800(820)，1 120(1 312) μg.L-1的含药标准血清，按样品处理方法操作，以ATRA，13-cRA与内标物峰面积比A为横坐标，ATRA，13-cRA浓度C为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。结果表明，ATRA浓度在0.8～1 120 μg.L-1范围内有良好线性关系，回归方程为：
C=18.851 6+205.913 8A r=0.997 7
, 百拇医药
13-cRA浓度在0.82～1 312 μg.L-1范围内有良好线性关系，回归方程为：
C=0.123 9+226.714 6A r=0.999 1
4.3 回收率 于空白血清中准确加入定量的ATRA及13-cRA标准甲醇溶液，配成低、中、高3种浓度的含药标准血清，按样品处理方法操作，用标准曲线方程测定浓度，以测得浓度与配制浓度的比值计算方法回收率。结果见表1。
表1 ATRA及13-cRA测定的方法回收率(n=3) 测定物
配制浓度/
μg.L-1
测得浓度±SD/
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μg.L-1
平均回收率±RSD/%
ATRA
43.20
45.47±2.0
105.2±4.5
540.0
554.32±23.5
102.6±4.2
972.0
964.87±31.5
, http://www.100md.com 98.96±3.3
13-cRA
35.20
35.78±1.5
101.6±4.1
440.0
448.05±13.0
101.8±2.9
880.0
894.66±16.8
101.7±1.9
4.4 精密度 配制ATRA及13-cRA浓度分别为38.4，128，576，960 μg.L-1的含药标准血清各4份，按样品处理方法操作，于同一日内测定，根据测定结果计算日内RSD，另配制ATRA及(13-cRA)浓度分别为43.2(35.2)，108.0(132.0)，540.0(440.0)及972(880)μg.L-1的含药标准血清各4份，按样品处理方法操作，于不同日间测定，根据测定结果计算日间RSD。结果日内精密度ATRA为0.84%～3.8%，13-cRA为1.4%～2.5%；日间精密度ATRA为2.3%～5.5%，13-cRA为1.4%～5.7%。
, 百拇医药
4.5 方法灵敏度 按色谱峰信噪比(S/N)≥3为标准，ATRA及13-cRA直接进样的最低检测量分别为0.20及0.204 8 ng；ATRA及13-cRA的最低检测浓度均为0.6 μg.L-1。
5 讨论
5.1 本文建立了一种灵敏、准确的高效液相色谱方法，可同时检测人血清中ATRA及13-cRA浓度。血清样品经乙醚2次提取，可达到较高检测灵敏度。本方法适用于APL病人ATRA血药浓度的常规监测，也适用于研究ATRA的临床药代动力学及ATRA与13-cRA在体内的相互转化关系。通过监测ATRA血药浓度，可以更好地了解在某些APL病人连续用药治疗中临床复发及耐药的原因。
5.2 在本实验中，选定甲醇-醋酸铵缓冲液(85∶15)为流动相，ATRA与13-cRA能获得较好分离，柱温及流速对分离有较大影响，在较低柱温及较小流速情况下ATRA与13-cRA分离较好。
, 百拇医药
5.3 ATRA及13-cRA对酸、热特别是光敏感，容易出现异构化或氧化降解，在样品测定过程中应特别注意严格控制操作条件，要求在严格避光条件下操作。■
参考文献
1.Huang M E,Ye Y C,Chen S R,et al.Use of all-trans retinoic acid in the treatment of acute promyelocytic leukemia.Blood,1988,72:567
2.Castaigne S,Chomienne C,Daniel MT,et al.All-trans retinoic acid as a differentiation therapy for acute promyelocytic leukemia.Ⅰ.Clinical results.Blood,1990,76:1704
, 百拇医药
3.Warrell Jr RP,Franlcel SR,Miller Jr WH,et al.Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin(All-trans retinoic acid).N Engl J Med,1991,324:1385
4.Muindi J,Franlcel SR,Miller Jr WH,et al.Continuous treatment with all-trans retinoic acid causes a progressive reduction in plasma drug concentrations:implications for relapse and retinoid “resistance” in patients with acute promyelocytic leukemia.Blood,1992,79:299
(本文于1999年7月15日收到), http://www.100md.com
单位：余自成 郁人海(上海第二医科大学瑞金医院临床药理研究室 上海 200025)；姚帅(上海中医药大学1999届实习生)
关键词：全反式维甲酸；13-顺式维甲酸；血药浓度；高效液相色谱法
药物分析杂志000403 摘要 目的：建立高效液相色谱方法同时检测人血清中全反式及13-顺式维甲酸浓度。方法：色谱柱：μBondapak C18(3.9 mm×300 mm)，流动相：甲醇-醋酸铵缓冲液(85∶15)，流速：0.8 mL.min-1，紫外检测波长：340 nm，柱温：22 ℃，血清样品经乙醚2次提取，按内标法定量，内标物选用对二甲氨基苯甲醛。结果：全反式及13-顺式维甲酸的线性范围分别在0.8～1 120 μg.L-1和0.82～1 312 μg.L-1，最低检测浓度均为0.6 μg.L-1。全反式维甲酸测定的平均回收率为98.86%～105.2%，日内、日间精密度RSD为0.84%～5.5%，13-顺式维甲酸测定的平均回收率为101.6%～101.8%，日内、日间精密度RSD为1.4%～5.7%。结论：本方法灵敏、准确，样品处理简便易行，适用于全反式维甲酸的临床药动学研究。
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Simultaneous Determination of All-trans-and 13-cis-Retinoic Acid in Human Serum by HPLC
Yu Zicheng Yao Shuai Yu Renhai
(Institute of Clinical Pharmacology,Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025)
Abstract Objective：To develop an isocratic HPLC for the simultaneous determination of all-trans-and 13-cis-retinoic acid(ATRA,13-cRA)in human serum.Methods:The serum sample(1 mL)was extracted with 5 mL of ether for twice.The extract was analyzed on an μBondapak C18(3.9 mm×300 mm)column with a mobile phase consisting of 85 Vols.of methanol and 15 Vols.of NH4Ac buffer(pH 6.0)at 22 ℃.The flow rate was 0.8 mL.min-1.The retinoids were detected at 340 nm and quantitated by internal standard method,DMAB was used as an internal standard.Results:The linearity of method was in the range of 0.8 to 1 120 μg.L-1 for ATRA and 0.82 to 1 312 μg.L-1 for 13-cRA.The limit of determination was 0.6 μg.L-1 in serum for both ATRA and 13-cRA.Average recoveries were 98.86%～105.2% for ATRA,101.6%～101.8% for 13-cRA.Within-day and between-day percision of determination were 0.84%～5.5% for ATRA and 1.4%～5.7% for 13-cRA.Conclusion:This method is sensitive,accurate and good enough to be utilized for the investigation of the clinical pharmacokinetics of ATRA.
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Key words all-trans-retinoic acid,13-cis-retinoic acid,serum drug concentration,HPLC▲
全反式维甲酸(All-Trans-Retinoic Acid,ATRA)是维生素A的天然氧化代谢产物，在体内经可逆代谢而成13-顺式维甲酸(13-cRA)。ATRA是目前治疗急性早幼白血病(APL)最有效的药物，多数患者用药后病情获得缓解[1～3]，但在持续用药过程中很快出现耐药，复发几乎普遍发生，其原因可能是ATRA对参与其代谢的酶活性具有自身诱导作用，持续用药导致血药浓度逐步降低[4]。本文建立了一种灵敏、准确的HPLC法，可同时检测人血清中ATRA及13-cRA浓度，此方法可用于ATRA临床药动学及体内ATRA与13-cRA间的相互转化关系的研究。
1 仪器与试药
, http://www.100md.com Waters高效液相色谱仪，包括510型恒流泵，486型可调波长UV检测器，PCM，TCM，Millennium 2010色谱管理系统。XW-80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)，800型离心沉淀器(上海手术器械十厂)。
ATRA及13-cRA对照品(上海第六制药厂提供，含量为99.68%)；对二甲氨基苯甲醛(DMAB，上海试剂三厂)；甲醇为色谱纯，乙醚、醋酸铵，冰醋酸均为分析纯。醋酸铵缓冲液配制：取醋酸铵33.3 g，加水100 mL溶解，加冰醋酸2.3 mL混合，摇匀，即得。
2 色谱条件
色谱柱：μBondapak C18(10 μm，3.9 mm×300 mm)；流动相：甲醇-醋酸铵缓冲液(85∶15)；流速：0.8 mL.min-1；紫外检测波长：340 nm；柱温：22 ℃；检测灵敏度：0.002 AUFS。
, http://www.100md.com
3 样品处理方法
取血清样品1 mL，加入内标DMAB 100 ng，用乙醚10 mL分2次提取，每次5 mL，旋涡振荡提取0.5 min，1 500 r.min-1离心5 min，合并乙醚提取液至尖底试管中，在40 ℃水浴中用纯N2吹干，用乙醚0.5 mL淋洗管壁，再用纯N2吹干，将残渣用甲醇40 μL溶解，取20 μL进样。
4 结果
4.1 色谱行为 在上述色谱条件下，ATRA与13-cRA、内标物及血清内源物质能够实现较好分离，色谱图见图1，ATRA、13-cRA及内标物保留时间分别为8.43，7.65，4.58 min。
, http://www.100md.com 图1 ATRA及13-cRA分离色谱图
A.空白血清 B.含药血清
1.ATRA 2.13-cRA 3.内标物
4.2 标准曲线 取空白血清1 mL，分别加入ATRA及(13-cRA)标准甲醇溶液适量精密配成浓度为0.8(0.82)，4(4.1)，16(16.4)，80(82)，160(164)，480(492)，800(820)，1 120(1 312) μg.L-1的含药标准血清，按样品处理方法操作，以ATRA，13-cRA与内标物峰面积比A为横坐标，ATRA，13-cRA浓度C为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。结果表明，ATRA浓度在0.8～1 120 μg.L-1范围内有良好线性关系，回归方程为：
C=18.851 6+205.913 8A r=0.997 7
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13-cRA浓度在0.82～1 312 μg.L-1范围内有良好线性关系，回归方程为：
C=0.123 9+226.714 6A r=0.999 1
4.3 回收率 于空白血清中准确加入定量的ATRA及13-cRA标准甲醇溶液，配成低、中、高3种浓度的含药标准血清，按样品处理方法操作，用标准曲线方程测定浓度，以测得浓度与配制浓度的比值计算方法回收率。结果见表1。
表1 ATRA及13-cRA测定的方法回收率(n=3) 测定物
配制浓度/
μg.L-1
测得浓度±SD/
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μg.L-1
平均回收率±RSD/%
ATRA
43.20
45.47±2.0
105.2±4.5
540.0
554.32±23.5
102.6±4.2
972.0
964.87±31.5
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13-cRA
35.20
35.78±1.5
101.6±4.1
440.0
448.05±13.0
101.8±2.9
880.0
894.66±16.8
101.7±1.9
4.4 精密度 配制ATRA及13-cRA浓度分别为38.4，128，576，960 μg.L-1的含药标准血清各4份，按样品处理方法操作，于同一日内测定，根据测定结果计算日内RSD，另配制ATRA及(13-cRA)浓度分别为43.2(35.2)，108.0(132.0)，540.0(440.0)及972(880)μg.L-1的含药标准血清各4份，按样品处理方法操作，于不同日间测定，根据测定结果计算日间RSD。结果日内精密度ATRA为0.84%～3.8%，13-cRA为1.4%～2.5%；日间精密度ATRA为2.3%～5.5%，13-cRA为1.4%～5.7%。
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4.5 方法灵敏度 按色谱峰信噪比(S/N)≥3为标准，ATRA及13-cRA直接进样的最低检测量分别为0.20及0.204 8 ng；ATRA及13-cRA的最低检测浓度均为0.6 μg.L-1。
5 讨论
5.1 本文建立了一种灵敏、准确的高效液相色谱方法，可同时检测人血清中ATRA及13-cRA浓度。血清样品经乙醚2次提取，可达到较高检测灵敏度。本方法适用于APL病人ATRA血药浓度的常规监测，也适用于研究ATRA的临床药代动力学及ATRA与13-cRA在体内的相互转化关系。通过监测ATRA血药浓度，可以更好地了解在某些APL病人连续用药治疗中临床复发及耐药的原因。
5.2 在本实验中，选定甲醇-醋酸铵缓冲液(85∶15)为流动相，ATRA与13-cRA能获得较好分离，柱温及流速对分离有较大影响，在较低柱温及较小流速情况下ATRA与13-cRA分离较好。
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5.3 ATRA及13-cRA对酸、热特别是光敏感，容易出现异构化或氧化降解，在样品测定过程中应特别注意严格控制操作条件，要求在严格避光条件下操作。■
参考文献
1.Huang M E,Ye Y C,Chen S R,et al.Use of all-trans retinoic acid in the treatment of acute promyelocytic leukemia.Blood,1988,72:567
2.Castaigne S,Chomienne C,Daniel MT,et al.All-trans retinoic acid as a differentiation therapy for acute promyelocytic leukemia.Ⅰ.Clinical results.Blood,1990,76:1704
, 百拇医药
3.Warrell Jr RP,Franlcel SR,Miller Jr WH,et al.Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin(All-trans retinoic acid).N Engl J Med,1991,324:1385
4.Muindi J,Franlcel SR,Miller Jr WH,et al.Continuous treatment with all-trans retinoic acid causes a progressive reduction in plasma drug concentrations:implications for relapse and retinoid “resistance” in patients with acute promyelocytic leukemia.Blood,1992,79:299
(本文于1999年7月15日收到), http://www.100md.com