IgA肾病患者血清和肾组织内巨细胞病毒DNA的检测
作者：刘志红 黎磊石 周虹 沈克勤
单位：(南京金陵医院，210002)
关键词：聚合酶链反应；巨细胞病毒；肾小球肾炎，IgA；杂交
中华医学杂志920403
摘要 应用聚合酶链反应(PCR)技术对表现为肉眼血尿和非肉眼血尿的IgA肾病患者以及系膜增殖性肾炎和膜性肾病患者血清中巨细胞病毒DNA(CMV-DNA)进行检测，同时应用原位分子杂交技术对肾组织中CMV-DNA进行了观察。结果肉眼血尿型IgA肾病血清中CMV-DNA检出率明显高于非肉眼血尿型IgA肾病和其它原发性肾小球肾炎，肾组织中CMV-DNA的检出率明显低于血清中，提示CMV感染只是使IgA肾病病情加剧的一个触发因素，而并非致病因素。
IgA肾病，特别是其肉眼血尿的发作常常与上呼吸道感染有关。巨细胞病毒(CMV)不仅是鼻咽部常见的致病性微生物，而且可通过多种途径影响机体免疫功能[1]。文献中有关CMV感染与IgA肾病关系的报道，各家结果很不一致[2～6]。我们选用聚合酶链反应(PCR)技术对表现为肉眼血尿和非肉眼血尿的IgA肾病患者血清中CMV-DNA进行了检测，同时应用原位分子杂交技术对这些患者肾组织中的CMV-DNA进行观察，并以其它类型肾小球肾炎病例作为对照，希望能比较确切地了解CMV感染与IgA肾病发病机理上的联系。
, 百拇医药
对象和方法
一、病例选择
随机选择经临床和肾活检确诊的原发性IgA肾病20例作为观察对象，其中表现为反复发作性肉眼血尿者10例，非肉眼血尿型10例。另以非IgA系膜增殖性肾炎10例及特发性膜性肾病10例作为对照。
二、血清内CMV-DNA的检测
1、DNA提取：取病人血清200μl，加核酸提取液和蛋白酶K，74℃消化1小时，用饱和酚、氯仿-异戊醇反复抽提4次，乙醇沉淀、备用。
2、引物：参照Olive等[7]的方法合成CMV-DNA序列IE基因保守区段的两组引物，计算扩增片段为106bp，以上引物由中国科学院上海细胞生物研究所协助合成。
3、PCR扩增：在反应管中加入PCR缓冲液2.5μl；引物I35.7pmol；引物II35.7pmol；dNTP 10mmol；耐热DNA多聚酶1U；加待检样品6μl，依次加温94℃(变性)→54℃(退火)→72℃(引物延伸)，如此连续进行35个循环，完成PCR扩增(DNA扩增试剂盒购自复旦大学遗传研究所)。
, http://www.100md.com
4、PCR扩增产物的分析：PCR扩增产物5μl，经含0.5μg/ml溴乙啶的2%琼脂糖电泳20分钟后，在紫外灯下观察，以标准核酸分子量(PBR 322-HaeIII华美公司)作为参照物观察特定分子大小的荧光条带。用引物特异的CMV-DNA探针作斑点杂交，进一步鉴定其特异性。
5、阳性，阴性对照：将HCMV169株接种到长满单层人胚肺细胞的克氏瓶中，当细胞病变达100%时，刮下细胞，-70℃冻融3次，超声处理2分钟，提取DNA做为每次PCR扩增时的阳性对照。每批试验另设蒸馏水阴性对照。
三、肾组织CMV-DNA检测
地高辛标记的CMV-DNA探针(北京医科大学公共卫生学院)是CMV基因经HindIII消化的Y片段基因重组质粒，经酶切后探针长度为3.8Kb。取肾活检组织作冰冻切片(4μm)，4%多聚甲醛16小时，再经10μg/ml蛋白酶K，37℃消化15分钟；0.2%甘氨酸-PBS洗片，4%多聚甲醛后固定；取地高辛标记的CMV-DNA探针放沸水中变性10分钟后立即置冰水中冷却；加探针至标本上，加盖玻片，95℃孵育10分钟；42℃杂交过夜，用2×SSC(含NaCl，柠檬酸三钠的溶液)洗10分钟后，置入2×SSC/甲酰胺，37℃10分钟；2×SSC洗10分钟加抗地高辛碱磷酶37℃1小时；洗片、加四恶唑硝基兰-5溴4氯3磷酸吲哚显色2～16小时，0.1%核固红复染细胞核，观察结果。杂交中以HCMV AD 169株感染的人胚肺细胞片做阳性对照，同时设立阴性对照。
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结 果
一、不同类型肾炎患者血清及肾组织中CMV-DNA检出率(附表)
附表 不同类型肾小球肾炎患者血清和肾组织中CMV-DNA检出结果 疾病种类
例数
CMV-DNA阳性
血清
肾组织
IgA肾病
10
7
1
肉眼血尿
, 百拇医药
非肉眼血尿
10
2*
1
系膜增殖性肾炎
10
1△…
膜性肾病
10
2*…
* P<0.05，△ P<0.01
肉眼血尿型IgA肾病的阳性率明显高于非肉眼血尿型者，也明显高于其它两种类型肾炎。非肉眼血尿型IgA肾病，系膜增殖性肾炎以及膜性肾病患者都只有少数个别患者阳性(图1，2)。
, 百拇医药
不论是肉眼血尿型和非肉眼血尿型病例均只有1例肾组织中CMN-DNA阳性，阳性部位主要在肾小管上皮细胞及间质中的细胞，肾小球内未见阳性细胞，肾组织内CMV-DNA阳性的病例，血清CMV-DNA也都是阳性(图3)。
讨 论
一、IgA肾病患者血清和肾组织内CMV的检出机率
IgA肾病是一类表现为以IgA为主的免疫球蛋白在系膜区沉积为特点的肾小球疾病，有关本病的发病机理及确切病因迄今仍不明了。许多作者曾研究各种可能有导致肾小球内IgA免疫复合物形成的抗原物质，包括食物抗原及病毒，其中有与上呼吸道感染密切相关的各种病毒，特别是CMV最引人注意。Nagy等[2]曾发现IgA肾病患者血清中CMV抗体的滴定度明显高于正常人、Gregory等[3]证明在IgA肾病患者肾小球内有CMV抗原物质存在，Bene等[6]认为即使应用PCR技术也不能证明肾小球内有CMV-DNA的存在。到底CMV感染在IgA肾病发病机理中有无作用，起什么作用，迄今尚不明确。
, 百拇医药
诊断CMV感染的方法不止一种。PCR技术是当代最先进的方法之一，具有快速、灵敏特异的优点。采用PCR技术作为检测血清CMV感染的手段，目的在于能够更精确地了解IgA肾病患者CMV的感染率。作者以往的工作已经证实原发性IgA肾病不是一个均一的疾病，可以分为各种类型，其中肉眼血尿型在临床及免疫病理上均有其特点，血尿的出现与上呼吸道感染之间的关系最为密切，从理论上推测其血清中CMV的阳性率可能与其它类型不同，本组的实验结果完全证实此假设，10例中有7例阳性。但10例非肉眼血尿型IgA肾病患者中，仅2例阳性，差异有非常显著意义，而其它类型原发性肾小球肾炎中阳性率则很低。
为了进一步阐明CMV感染与肾组织病变之间的联系，本组应用原位分子杂交技术对肾组织中的CMV-DNA进行了观察，结果证明不论是肉眼或非肉眼血尿型IgA肾病，只有少数病例呈阳性反应。
二、CMV感染与肉眼血尿型IgA肾病的关系
, 百拇医药 本组的研究结果提示：(1)肉眼血尿型IgA肾病患者CMV的感染率可以很高，与其它类型IgA肾病或其它种原发性肾小球肾炎截然不同。这一特点是与肉眼血尿型IgA肾病常伴有上呼吸道感染密切相关的。(2)尽管血清CMV-DNA阳性，但在多数病例中肾组织内没有检出CMV-DNA。血清与肾组织内检出结果的矛盾现象说明CMV感染不是IgA肾病肾脏病变的直接因素，而只是一种伴发现象。
扁桃体切除对治疗肉眼血尿型IgA肾病的血尿发作具有良好的疗效[9]。因扁桃体切除后咽痛发生率明显降低，使血尿不再发作。但长期随访重复肾活检，肾组织的病理改变并未消失，系膜区仍有IgA沉积。这就说明扁桃体炎的存在并不是本病的致病因素，而只是使病情发作的加剧因素启动，或是肾组织内免疫性炎症的一个触发因素。
CMV感染对肉眼血尿型IgA肾病发病机理的意义，我们认为很可能与扁桃体炎或上呼吸道感染密切相关。日前，尚无事实证明它是导致IgA肾病变的抗原性物质。而进一步观察肉眼血尿型IgA肾病扁桃体内CMV的检出率及肉眼血尿的发作与CMV感染活动度的关系将会有助于进一步明确CMV在IgA肾病发病机理中的作用。
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图1 PCR扩增产物(1、阳性对照，2～4、阳性标本，5、阴性对照)
图2 PCR扩增产物斑点杂交的结果(1、阳性对照，2、阴性对照，3、引物对照，4～6、阳性标本)
图3 原位杂交示肾小管上皮细胞内巨细胞病毒DNA阳性 IP×1000
参考文献
1 Rook AH. Interaction of cytomegalovirus with human immune system. Rev Infect Dis 1988;3(Suppl 10):5460.
2 Nagy J, et al. Herpes virus antigens and antibodies in kidney biopsies and sera of IgA glomerulonephritic patients. Clin Nephrol 1984;21:259.
, http://www.100md.com
3 Gregory MC, et al. Renal deposion of cytomega-lovirus antigen in immunoglobulin-A nephropathy, Lancet 1988;I:11.
4 Waldo FB, et al. Non-specific mesangial staining with antibodies against cytomegalovirus in immuno-globulin-A nephropathy. Lancet 1989;1:129-131.
5 Muller GA, et al. Detection of human cytomegalo-virus-DNA in IgA nephropathy. Nephron 1991;57:383.
6 Bene MC, et al. Absence of cytomegalovirus DNA in kidneys in IgA nephropathy. Lancet 1990;335:868.
7 Olive DM, et al. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus. J Clin Microbiol 1989;27:1238.
8 Lain FM, et al, Cytomegalovirus antigens in IgA nephropathy: Factor or artefacts? Nephron 1990;55:87.
9 俞雨生等，扁桃体切除治疗以肉眼血尿为主的IgA肾病，中华医学杂志1991；71：226, 百拇医药
单位：(南京金陵医院，210002)
关键词：聚合酶链反应；巨细胞病毒；肾小球肾炎，IgA；杂交
中华医学杂志920403
摘要 应用聚合酶链反应(PCR)技术对表现为肉眼血尿和非肉眼血尿的IgA肾病患者以及系膜增殖性肾炎和膜性肾病患者血清中巨细胞病毒DNA(CMV-DNA)进行检测，同时应用原位分子杂交技术对肾组织中CMV-DNA进行了观察。结果肉眼血尿型IgA肾病血清中CMV-DNA检出率明显高于非肉眼血尿型IgA肾病和其它原发性肾小球肾炎，肾组织中CMV-DNA的检出率明显低于血清中，提示CMV感染只是使IgA肾病病情加剧的一个触发因素，而并非致病因素。
IgA肾病，特别是其肉眼血尿的发作常常与上呼吸道感染有关。巨细胞病毒(CMV)不仅是鼻咽部常见的致病性微生物，而且可通过多种途径影响机体免疫功能[1]。文献中有关CMV感染与IgA肾病关系的报道，各家结果很不一致[2～6]。我们选用聚合酶链反应(PCR)技术对表现为肉眼血尿和非肉眼血尿的IgA肾病患者血清中CMV-DNA进行了检测，同时应用原位分子杂交技术对这些患者肾组织中的CMV-DNA进行观察，并以其它类型肾小球肾炎病例作为对照，希望能比较确切地了解CMV感染与IgA肾病发病机理上的联系。
, 百拇医药
对象和方法
一、病例选择
随机选择经临床和肾活检确诊的原发性IgA肾病20例作为观察对象，其中表现为反复发作性肉眼血尿者10例，非肉眼血尿型10例。另以非IgA系膜增殖性肾炎10例及特发性膜性肾病10例作为对照。
二、血清内CMV-DNA的检测
1、DNA提取：取病人血清200μl，加核酸提取液和蛋白酶K，74℃消化1小时，用饱和酚、氯仿-异戊醇反复抽提4次，乙醇沉淀、备用。
2、引物：参照Olive等[7]的方法合成CMV-DNA序列IE基因保守区段的两组引物，计算扩增片段为106bp，以上引物由中国科学院上海细胞生物研究所协助合成。
3、PCR扩增：在反应管中加入PCR缓冲液2.5μl；引物I35.7pmol；引物II35.7pmol；dNTP 10mmol；耐热DNA多聚酶1U；加待检样品6μl，依次加温94℃(变性)→54℃(退火)→72℃(引物延伸)，如此连续进行35个循环，完成PCR扩增(DNA扩增试剂盒购自复旦大学遗传研究所)。
, http://www.100md.com
4、PCR扩增产物的分析：PCR扩增产物5μl，经含0.5μg/ml溴乙啶的2%琼脂糖电泳20分钟后，在紫外灯下观察，以标准核酸分子量(PBR 322-HaeIII华美公司)作为参照物观察特定分子大小的荧光条带。用引物特异的CMV-DNA探针作斑点杂交，进一步鉴定其特异性。
5、阳性，阴性对照：将HCMV169株接种到长满单层人胚肺细胞的克氏瓶中，当细胞病变达100%时，刮下细胞，-70℃冻融3次，超声处理2分钟，提取DNA做为每次PCR扩增时的阳性对照。每批试验另设蒸馏水阴性对照。
三、肾组织CMV-DNA检测
地高辛标记的CMV-DNA探针(北京医科大学公共卫生学院)是CMV基因经HindIII消化的Y片段基因重组质粒，经酶切后探针长度为3.8Kb。取肾活检组织作冰冻切片(4μm)，4%多聚甲醛16小时，再经10μg/ml蛋白酶K，37℃消化15分钟；0.2%甘氨酸-PBS洗片，4%多聚甲醛后固定；取地高辛标记的CMV-DNA探针放沸水中变性10分钟后立即置冰水中冷却；加探针至标本上，加盖玻片，95℃孵育10分钟；42℃杂交过夜，用2×SSC(含NaCl，柠檬酸三钠的溶液)洗10分钟后，置入2×SSC/甲酰胺，37℃10分钟；2×SSC洗10分钟加抗地高辛碱磷酶37℃1小时；洗片、加四恶唑硝基兰-5溴4氯3磷酸吲哚显色2～16小时，0.1%核固红复染细胞核，观察结果。杂交中以HCMV AD 169株感染的人胚肺细胞片做阳性对照，同时设立阴性对照。
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结 果
一、不同类型肾炎患者血清及肾组织中CMV-DNA检出率(附表)
附表 不同类型肾小球肾炎患者血清和肾组织中CMV-DNA检出结果 疾病种类
例数
CMV-DNA阳性
血清
肾组织
IgA肾病
10
7
1
肉眼血尿
, 百拇医药
非肉眼血尿
10
2*
1
系膜增殖性肾炎
10
1△…
膜性肾病
10
2*…
* P<0.05，△ P<0.01
肉眼血尿型IgA肾病的阳性率明显高于非肉眼血尿型者，也明显高于其它两种类型肾炎。非肉眼血尿型IgA肾病，系膜增殖性肾炎以及膜性肾病患者都只有少数个别患者阳性(图1，2)。
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不论是肉眼血尿型和非肉眼血尿型病例均只有1例肾组织中CMN-DNA阳性，阳性部位主要在肾小管上皮细胞及间质中的细胞，肾小球内未见阳性细胞，肾组织内CMV-DNA阳性的病例，血清CMV-DNA也都是阳性(图3)。
讨 论
一、IgA肾病患者血清和肾组织内CMV的检出机率
IgA肾病是一类表现为以IgA为主的免疫球蛋白在系膜区沉积为特点的肾小球疾病，有关本病的发病机理及确切病因迄今仍不明了。许多作者曾研究各种可能有导致肾小球内IgA免疫复合物形成的抗原物质，包括食物抗原及病毒，其中有与上呼吸道感染密切相关的各种病毒，特别是CMV最引人注意。Nagy等[2]曾发现IgA肾病患者血清中CMV抗体的滴定度明显高于正常人、Gregory等[3]证明在IgA肾病患者肾小球内有CMV抗原物质存在，Bene等[6]认为即使应用PCR技术也不能证明肾小球内有CMV-DNA的存在。到底CMV感染在IgA肾病发病机理中有无作用，起什么作用，迄今尚不明确。
, 百拇医药
诊断CMV感染的方法不止一种。PCR技术是当代最先进的方法之一，具有快速、灵敏特异的优点。采用PCR技术作为检测血清CMV感染的手段，目的在于能够更精确地了解IgA肾病患者CMV的感染率。作者以往的工作已经证实原发性IgA肾病不是一个均一的疾病，可以分为各种类型，其中肉眼血尿型在临床及免疫病理上均有其特点，血尿的出现与上呼吸道感染之间的关系最为密切，从理论上推测其血清中CMV的阳性率可能与其它类型不同，本组的实验结果完全证实此假设，10例中有7例阳性。但10例非肉眼血尿型IgA肾病患者中，仅2例阳性，差异有非常显著意义，而其它类型原发性肾小球肾炎中阳性率则很低。
为了进一步阐明CMV感染与肾组织病变之间的联系，本组应用原位分子杂交技术对肾组织中的CMV-DNA进行了观察，结果证明不论是肉眼或非肉眼血尿型IgA肾病，只有少数病例呈阳性反应。
二、CMV感染与肉眼血尿型IgA肾病的关系
, 百拇医药 本组的研究结果提示：(1)肉眼血尿型IgA肾病患者CMV的感染率可以很高，与其它类型IgA肾病或其它种原发性肾小球肾炎截然不同。这一特点是与肉眼血尿型IgA肾病常伴有上呼吸道感染密切相关的。(2)尽管血清CMV-DNA阳性，但在多数病例中肾组织内没有检出CMV-DNA。血清与肾组织内检出结果的矛盾现象说明CMV感染不是IgA肾病肾脏病变的直接因素，而只是一种伴发现象。
扁桃体切除对治疗肉眼血尿型IgA肾病的血尿发作具有良好的疗效[9]。因扁桃体切除后咽痛发生率明显降低，使血尿不再发作。但长期随访重复肾活检，肾组织的病理改变并未消失，系膜区仍有IgA沉积。这就说明扁桃体炎的存在并不是本病的致病因素，而只是使病情发作的加剧因素启动，或是肾组织内免疫性炎症的一个触发因素。
CMV感染对肉眼血尿型IgA肾病发病机理的意义，我们认为很可能与扁桃体炎或上呼吸道感染密切相关。日前，尚无事实证明它是导致IgA肾病变的抗原性物质。而进一步观察肉眼血尿型IgA肾病扁桃体内CMV的检出率及肉眼血尿的发作与CMV感染活动度的关系将会有助于进一步明确CMV在IgA肾病发病机理中的作用。
, http://www.100md.com
图1 PCR扩增产物(1、阳性对照，2～4、阳性标本，5、阴性对照)
图2 PCR扩增产物斑点杂交的结果(1、阳性对照，2、阴性对照，3、引物对照，4～6、阳性标本)
图3 原位杂交示肾小管上皮细胞内巨细胞病毒DNA阳性 IP×1000
参考文献
1 Rook AH. Interaction of cytomegalovirus with human immune system. Rev Infect Dis 1988;3(Suppl 10):5460.
2 Nagy J, et al. Herpes virus antigens and antibodies in kidney biopsies and sera of IgA glomerulonephritic patients. Clin Nephrol 1984;21:259.
, http://www.100md.com
3 Gregory MC, et al. Renal deposion of cytomega-lovirus antigen in immunoglobulin-A nephropathy, Lancet 1988;I:11.
4 Waldo FB, et al. Non-specific mesangial staining with antibodies against cytomegalovirus in immuno-globulin-A nephropathy. Lancet 1989;1:129-131.
5 Muller GA, et al. Detection of human cytomegalo-virus-DNA in IgA nephropathy. Nephron 1991;57:383.
6 Bene MC, et al. Absence of cytomegalovirus DNA in kidneys in IgA nephropathy. Lancet 1990;335:868.
7 Olive DM, et al. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus. J Clin Microbiol 1989;27:1238.
8 Lain FM, et al, Cytomegalovirus antigens in IgA nephropathy: Factor or artefacts? Nephron 1990;55:87.
9 俞雨生等，扁桃体切除治疗以肉眼血尿为主的IgA肾病，中华医学杂志1991；71：226, 百拇医药