p16 mRNA在乳腺癌中的表达及临床病理意义
作者：郭山春 廖松林 丁华野 柳剑英 陆哲明 张波
单位：100083 北京医科大学病理学系(郭山春、廖松林、柳剑英、陆哲明、张波)；北京军区总医院病理科(丁华野)
关键词：乳腺肿瘤；原位杂交；病理学，临床
中华医学杂志980622 【摘要】 目的 探讨p16 mRNA在原发性乳腺癌的表达情况及其临床病理意义。方法 体外转录法生物素标记RNA探针，用原位杂交技术检测p16 mRNA在120例乳腺癌标本中的表达。结果 p16 mRNA的阳性表达率70.8%(85/120)，与患者年龄、肿瘤大小及雌、孕激素受体状态无相关性；淋巴结转移组的阳性率54%(31/57)，未转移组86%(54/63)(P<0.01)；p16 mRNA表达阳性组的3年以上病死率为25%(21/85)，阴性组为57%(20/35)(P<0.01)。结论 p16 mRNA的异常表达在乳腺癌的发生发展中可能起重要作用。
, 百拇医药
In situ hybrid detection of p16 mRNA in primary breast carcinoma: its clinicopathologic significance Guo Shanchun, Liao Songlin, Ding Huaye, et al. Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】 Objective To investigate the expression of p16 mRNA in primary breast carcinoma and its clinicopathological significance.Methods In vitro transcriptional RNA probe labeled with biotin and in situ hybridization method were used in this study to detect p16 mRNA in the paraffin embedded tissue of human primary breast carcinoma from 120 cases. Results 85 breast carcinomas showed expression of p16 mRNA with a positive rate of 70.8%. The p16 mRNA expression was not obviously correlated with patient age, tumor size, estrogen and progesterone receptor status (P>0.05), but the positive rate of 54.4% for the lymph node metastasis group was significantly lower than 85.7% of the non-metastasis group (P<0.001). Moreover, the positive rate of 58.3% for the poor differentiate invasive duct carcinoma was also lower than that 89.7% for the well differentiated (P<0.05). The patients after operation were followed up. The mortality of 25% (21/85) in the p16 mRNA positive group was significantly lower than that of the negative group 57% (20/35) (P<0.01).Conclusion Abnormal expression of p16 mRNA may play an important role in the development of human breast carcinoma.
, http://www.100md.com
【Key words】 Breast neoplasms In situ hybridization Pathology, clinical
(Natl Med J China, 1998, 78：464-466)
多肿瘤抑制基因(MTS1/CDKN2/p16)是1994年初发现的一个新型抑癌基因，其与多种肿瘤的发生有密切关系[1]。目前，应用原位杂交技术对其在组织中原位表达的研究较少，为此，我们在应用免疫组织化学研究蛋白表达的基础上[2]，制备了生物素标记的RNA探针，应用原位杂交技术，对一组原发性乳腺癌标本进行了mRNA检测，旨在探讨p16基因在乳腺癌中的表达情况及临床病理意义。
对象与方法
一、对象
, http://www.100md.com 北京医科大学第三医院和北京军区总医院1980～1993年乳腺癌患者，共120例，均为女性，年龄26～75岁，平均47岁。术前未做过任何化疗或放疗。根据WHO分类标准进行病理分型，其中浸润性导管癌108例，浸润性小叶癌和粘液癌各5例，髓样癌2例。对浸润性导管癌，参考Scarff-Bloom-Richardson分级法，综合组织分化程度、核分裂数及核多形性三方面参数打分定量分级(Ⅰ～Ⅲ级)。对全部病例进行了3年以上的随访，41例因复发或转移死亡，死亡率34.2%。
二、方法
标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，切片。常规扩增p16质粒(美国冷泉港实验室Kamb博士惠赠)，p16 cDNA全长800 bp装于P Bluescript SK，用ECORⅠ，XhoⅠ酶切，经低溶点凝胶电泳后，回收目的DNA片段。用体外转录法进行p16 RNA探针生物素标记。原位杂交主要步骤：切片脱蜡、水化，0.1 mmol/L HCl室温15分钟，磷酸盐缓冲液(PBS)洗，蛋白酶K 100 μg/ml，37℃10分钟，PBS洗；4%多聚甲醛后固定10分钟，PBS洗；放入80%及100%冷乙醇脱水；含RNA探针的杂交液85℃，变性5分钟，40℃杂交16～24小时；标准枸橼酸盐水及PBS洗；链卵白素(1：1 000)60分钟；DAB显色；苏木素复染；脱水、透明、封固。
, 百拇医药
正常肠粘膜组织为阳性对照，1例高转移肺巨细胞瘤细胞系(PG)移植瘤(p16逆转录PCR证明无mRNA表达)和乳腺癌阳性片不加探针作为阴性对照。
阳性结果判断：胞浆中出现黄或棕黄色细密颗粒为阳性细胞。根据整个切片中阳性癌细胞占全部肿瘤细胞的比例定为：-：阳性细胞<10%；+：阳性细胞数10%～30%；++：阳性细胞数31%～70%；+++：阳性细胞数>70%。
统计学处理：采用χ2分析。
结果
一、p16 mRNA表达情况
120例原发性乳腺癌标本，85例(70.8%)癌细胞p16 mRNA阳性表达，其中14例(11.7%)为+，28例(23.3%)为++，43例(35.8%)为+++。阳性反应物质主要位于细胞浆中，呈细颗粒状。癌旁非肿瘤小叶和导管上皮亦有阳性表达，肿瘤间质纤维母细胞和浸润的淋巴细胞浆中亦可见强阳性(++～+++)表达。
, 百拇医药
二、p16 mRNA表达与临床病理特征的关系
由表1可见，p16 mRNA在乳腺癌组织中的表达与患者年龄、肿瘤大小及雌、孕激素受体状况无关系(P>0.05)，但与淋巴结转移有显著相关性(P<0.01)。
表1 p16 mRNA表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系 项目
例数
p16 mRNA表达
P值
例数
阳性率(%)
年龄(岁)
≤50
, http://www.100md.com
52
35
67
>0.05
>50
68
50
74
肿瘤大小(cm)
≤2.5
48
38
79
, 百拇医药
>0.05
>2.5
72
47
65
淋巴结转移
阳性
57
31
54
<0.01
阴性
63
, 百拇医药
54
86
雌激素受体
阳性
78
57
73
>0.05
阴性
42
28
67
孕激素受体
, 百拇医药 阳性
69
52
75
>0.05
阴性
51
33
65
三、p16 mRNA表达与病理形态的关系
由表2可见，浸润性导管癌分级与p16 mRNA表达阳性率呈正相关，其中Ⅰ、Ⅲ级比较差异有显著意义(P<0.05)。
四、p16 mRNA表达与患者病死率的关系
, 百拇医药
p16 mRNA表达阳性组85例患者，有21例因癌转移或复发死亡，病死率为25%，阴性组病死率为57%(20/35)，两组比较差异有显著意义(P<0.01)。
表2 p16 mRNA表达与乳腺癌分型、分级的关系(例数)
组别
例数
p16 mRNA表达
-
+
++
+++
阳性率
(%)
, 百拇医药
浸润性导管癌
(108)
30
(27.8)
13
(12.0)
24
(22.2)
41
(37.9)
72.2
Ⅰ级
29
, 百拇医药
3
(10.3)
3
(10.3)
6
(20.7)
17
(58.6)
89.7*
Ⅱ级
43
11
(25.6)
, http://www.100md.com
5
(11.6)
8
(18.6)
19
(44.2)
74.4
Ⅲ级
36
15
(41.7)
5
(13.9)
, http://www.100md.com
10
(25.6)
5
(13.9)
58.3
浸润性小叶癌
5
1
0
2
2
4/5
粘液癌
, http://www.100md.com 5
2
1
2
0
3/5
髓样癌
2
2
0
0
0
0
合计
, 百拇医药
120
35
(29.2)
14
(11.7)
28
(23.3)
43
(35.8)
70.8
注：与Ⅲ级比较，* P<0.05；括号内为百分比
讨论
, 百拇医药
Kamb等[1]报道60%的乳腺癌细胞系有p16基因纯合缺失，Lin等[3]应用PCR-SSCP技术发现5种乳腺癌细胞系中，2种纯合缺失，但在37例原发性乳腺癌中未发现p16基因改变。Brenner等[4]应用多个微卫星探针研究了24例原发性乳腺癌9P21，22区的杂合性缺失(LOH)，发现58%的病例存在LOH，仅1例存在p16基因点突变，因此，他们认为p16基因在乳腺癌病变中可能不起重要作用。但应用免疫组织化学技术检测P16蛋白的表达，却有一半以上的病例完全或部分不表达P16蛋白[5]。我们分析上述矛盾可能由于绝大多数原发性乳腺癌一般间质较丰富，间质中的纤维母细胞和浸润的炎细胞中也至少含有单拷贝的p16基因，由于正常细胞的混杂，PCR技术低估了p16基因纯合缺失的机率；另外一方面P16蛋白或mRNA失表达的部分原因并非由于p16基因的纯合缺失，可能是由于p16基因高度甲基化[6]。
, 百拇医药 应用原位杂交技术检测组织中的p16 mRNA可克服PCR技术的弱点。在同一张切片上可观察到癌、间质和癌旁组织p16基因mRNA表达情况，后二者可作为很好的阳性内参照。
我们发现p16 mRNA在乳腺癌组织表达的阳性率为70.8%，意味着近1/3的病例mRNA低表达，阳性病例中也有不同程度的低表达。我们进一步观察到p16 mRNA的表达情况虽然与雌孕激素受体状态无相关性，但与乳腺癌的分级及转移有较明确的关系，p16 mRNA未表达更多见于分化差或有淋巴结转移的乳腺癌中。结果提示，p16 mRNA的表达异常对乳腺癌的演进及最终使癌细胞获得转移的潜能产生重要作用，也说明p16基因的异常在乳腺癌的发生发展中可能是一个较晚的分子事件。证明应用mRNA探针的原位杂交技术检测mRNA表达情况可能成为乳腺癌患者的一个新的预后指标。
参考文献
1 Kamb A, Gruis N A, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science, 1994,246：436-440.
, http://www.100md.com
2 郭山春，廖松林，丁华野，等.原发性乳腺癌P16蛋白表达与PCNA指数的相关性研究.中华医学杂志，1997，77：529-530.
3 Lin X, Sgroi D, Sterner C J, et al. Mutational analysis of CDKN2(MTS1/p16) in human breast carcinomas. Cancer Res, 1994,54：5256-5264.
4 Brenner A J, Aldas C M. Chromosome 9p allelic loss and p16/CDKN2 in breast cancer and evidence of p16 inactivation in immortal breast epithelial cells. Cancer Res, 1995,55：2892-2895.
5 Geradts J, Wilson PA. High frequence of aberrant p16INK4A expression in human breast cancer. Am J Pathol, 1996, 149：15-20.
6 Mero A, Herman J G, Mao L, et al. 5′CPG island methylation is associated with transcriptional silencing of the tumor suppressor p16/CDKN2/MTS1 in human cancer. Nat Med, 1995,1：686-692.
(收稿：1997-05-21 修回：1997-12-30), http://www.100md.com
单位：100083 北京医科大学病理学系(郭山春、廖松林、柳剑英、陆哲明、张波)；北京军区总医院病理科(丁华野)
关键词：乳腺肿瘤；原位杂交；病理学，临床
中华医学杂志980622 【摘要】 目的 探讨p16 mRNA在原发性乳腺癌的表达情况及其临床病理意义。方法 体外转录法生物素标记RNA探针，用原位杂交技术检测p16 mRNA在120例乳腺癌标本中的表达。结果 p16 mRNA的阳性表达率70.8%(85/120)，与患者年龄、肿瘤大小及雌、孕激素受体状态无相关性；淋巴结转移组的阳性率54%(31/57)，未转移组86%(54/63)(P<0.01)；p16 mRNA表达阳性组的3年以上病死率为25%(21/85)，阴性组为57%(20/35)(P<0.01)。结论 p16 mRNA的异常表达在乳腺癌的发生发展中可能起重要作用。
, 百拇医药
In situ hybrid detection of p16 mRNA in primary breast carcinoma: its clinicopathologic significance Guo Shanchun, Liao Songlin, Ding Huaye, et al. Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】 Objective To investigate the expression of p16 mRNA in primary breast carcinoma and its clinicopathological significance.Methods In vitro transcriptional RNA probe labeled with biotin and in situ hybridization method were used in this study to detect p16 mRNA in the paraffin embedded tissue of human primary breast carcinoma from 120 cases. Results 85 breast carcinomas showed expression of p16 mRNA with a positive rate of 70.8%. The p16 mRNA expression was not obviously correlated with patient age, tumor size, estrogen and progesterone receptor status (P>0.05), but the positive rate of 54.4% for the lymph node metastasis group was significantly lower than 85.7% of the non-metastasis group (P<0.001). Moreover, the positive rate of 58.3% for the poor differentiate invasive duct carcinoma was also lower than that 89.7% for the well differentiated (P<0.05). The patients after operation were followed up. The mortality of 25% (21/85) in the p16 mRNA positive group was significantly lower than that of the negative group 57% (20/35) (P<0.01).Conclusion Abnormal expression of p16 mRNA may play an important role in the development of human breast carcinoma.
, http://www.100md.com
【Key words】 Breast neoplasms In situ hybridization Pathology, clinical
(Natl Med J China, 1998, 78：464-466)
多肿瘤抑制基因(MTS1/CDKN2/p16)是1994年初发现的一个新型抑癌基因，其与多种肿瘤的发生有密切关系[1]。目前，应用原位杂交技术对其在组织中原位表达的研究较少，为此，我们在应用免疫组织化学研究蛋白表达的基础上[2]，制备了生物素标记的RNA探针，应用原位杂交技术，对一组原发性乳腺癌标本进行了mRNA检测，旨在探讨p16基因在乳腺癌中的表达情况及临床病理意义。
对象与方法
一、对象
, http://www.100md.com 北京医科大学第三医院和北京军区总医院1980～1993年乳腺癌患者，共120例，均为女性，年龄26～75岁，平均47岁。术前未做过任何化疗或放疗。根据WHO分类标准进行病理分型，其中浸润性导管癌108例，浸润性小叶癌和粘液癌各5例，髓样癌2例。对浸润性导管癌，参考Scarff-Bloom-Richardson分级法，综合组织分化程度、核分裂数及核多形性三方面参数打分定量分级(Ⅰ～Ⅲ级)。对全部病例进行了3年以上的随访，41例因复发或转移死亡，死亡率34.2%。
二、方法
标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，切片。常规扩增p16质粒(美国冷泉港实验室Kamb博士惠赠)，p16 cDNA全长800 bp装于P Bluescript SK，用ECORⅠ，XhoⅠ酶切，经低溶点凝胶电泳后，回收目的DNA片段。用体外转录法进行p16 RNA探针生物素标记。原位杂交主要步骤：切片脱蜡、水化，0.1 mmol/L HCl室温15分钟，磷酸盐缓冲液(PBS)洗，蛋白酶K 100 μg/ml，37℃10分钟，PBS洗；4%多聚甲醛后固定10分钟，PBS洗；放入80%及100%冷乙醇脱水；含RNA探针的杂交液85℃，变性5分钟，40℃杂交16～24小时；标准枸橼酸盐水及PBS洗；链卵白素(1：1 000)60分钟；DAB显色；苏木素复染；脱水、透明、封固。
, 百拇医药
正常肠粘膜组织为阳性对照，1例高转移肺巨细胞瘤细胞系(PG)移植瘤(p16逆转录PCR证明无mRNA表达)和乳腺癌阳性片不加探针作为阴性对照。
阳性结果判断：胞浆中出现黄或棕黄色细密颗粒为阳性细胞。根据整个切片中阳性癌细胞占全部肿瘤细胞的比例定为：-：阳性细胞<10%；+：阳性细胞数10%～30%；++：阳性细胞数31%～70%；+++：阳性细胞数>70%。
统计学处理：采用χ2分析。
结果
一、p16 mRNA表达情况
120例原发性乳腺癌标本，85例(70.8%)癌细胞p16 mRNA阳性表达，其中14例(11.7%)为+，28例(23.3%)为++，43例(35.8%)为+++。阳性反应物质主要位于细胞浆中，呈细颗粒状。癌旁非肿瘤小叶和导管上皮亦有阳性表达，肿瘤间质纤维母细胞和浸润的淋巴细胞浆中亦可见强阳性(++～+++)表达。
, 百拇医药
二、p16 mRNA表达与临床病理特征的关系
由表1可见，p16 mRNA在乳腺癌组织中的表达与患者年龄、肿瘤大小及雌、孕激素受体状况无关系(P>0.05)，但与淋巴结转移有显著相关性(P<0.01)。
表1 p16 mRNA表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系 项目
例数
p16 mRNA表达
P值
例数
阳性率(%)
年龄(岁)
≤50
, http://www.100md.com
52
35
67
>0.05
>50
68
50
74
肿瘤大小(cm)
≤2.5
48
38
79
, 百拇医药
>0.05
>2.5
72
47
65
淋巴结转移
阳性
57
31
54
<0.01
阴性
63
, 百拇医药
54
86
雌激素受体
阳性
78
57
73
>0.05
阴性
42
28
67
孕激素受体
, 百拇医药 阳性
69
52
75
>0.05
阴性
51
33
65
三、p16 mRNA表达与病理形态的关系
由表2可见，浸润性导管癌分级与p16 mRNA表达阳性率呈正相关，其中Ⅰ、Ⅲ级比较差异有显著意义(P<0.05)。
四、p16 mRNA表达与患者病死率的关系
, 百拇医药
p16 mRNA表达阳性组85例患者，有21例因癌转移或复发死亡，病死率为25%，阴性组病死率为57%(20/35)，两组比较差异有显著意义(P<0.01)。
表2 p16 mRNA表达与乳腺癌分型、分级的关系(例数)
组别
例数
p16 mRNA表达
-
+
++
+++
阳性率
(%)
, 百拇医药
浸润性导管癌
(108)
30
(27.8)
13
(12.0)
24
(22.2)
41
(37.9)
72.2
Ⅰ级
29
, 百拇医药
3
(10.3)
3
(10.3)
6
(20.7)
17
(58.6)
89.7*
Ⅱ级
43
11
(25.6)
, http://www.100md.com
5
(11.6)
8
(18.6)
19
(44.2)
74.4
Ⅲ级
36
15
(41.7)
5
(13.9)
, http://www.100md.com
10
(25.6)
5
(13.9)
58.3
浸润性小叶癌
5
1
0
2
2
4/5
粘液癌
, http://www.100md.com 5
2
1
2
0
3/5
髓样癌
2
2
0
0
0
0
合计
, 百拇医药
120
35
(29.2)
14
(11.7)
28
(23.3)
43
(35.8)
70.8
注：与Ⅲ级比较，* P<0.05；括号内为百分比
讨论
, 百拇医药
Kamb等[1]报道60%的乳腺癌细胞系有p16基因纯合缺失，Lin等[3]应用PCR-SSCP技术发现5种乳腺癌细胞系中，2种纯合缺失，但在37例原发性乳腺癌中未发现p16基因改变。Brenner等[4]应用多个微卫星探针研究了24例原发性乳腺癌9P21，22区的杂合性缺失(LOH)，发现58%的病例存在LOH，仅1例存在p16基因点突变，因此，他们认为p16基因在乳腺癌病变中可能不起重要作用。但应用免疫组织化学技术检测P16蛋白的表达，却有一半以上的病例完全或部分不表达P16蛋白[5]。我们分析上述矛盾可能由于绝大多数原发性乳腺癌一般间质较丰富，间质中的纤维母细胞和浸润的炎细胞中也至少含有单拷贝的p16基因，由于正常细胞的混杂，PCR技术低估了p16基因纯合缺失的机率；另外一方面P16蛋白或mRNA失表达的部分原因并非由于p16基因的纯合缺失，可能是由于p16基因高度甲基化[6]。
, 百拇医药 应用原位杂交技术检测组织中的p16 mRNA可克服PCR技术的弱点。在同一张切片上可观察到癌、间质和癌旁组织p16基因mRNA表达情况，后二者可作为很好的阳性内参照。
我们发现p16 mRNA在乳腺癌组织表达的阳性率为70.8%，意味着近1/3的病例mRNA低表达，阳性病例中也有不同程度的低表达。我们进一步观察到p16 mRNA的表达情况虽然与雌孕激素受体状态无相关性，但与乳腺癌的分级及转移有较明确的关系，p16 mRNA未表达更多见于分化差或有淋巴结转移的乳腺癌中。结果提示，p16 mRNA的表达异常对乳腺癌的演进及最终使癌细胞获得转移的潜能产生重要作用，也说明p16基因的异常在乳腺癌的发生发展中可能是一个较晚的分子事件。证明应用mRNA探针的原位杂交技术检测mRNA表达情况可能成为乳腺癌患者的一个新的预后指标。
参考文献
1 Kamb A, Gruis N A, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science, 1994,246：436-440.
, http://www.100md.com
2 郭山春，廖松林，丁华野，等.原发性乳腺癌P16蛋白表达与PCNA指数的相关性研究.中华医学杂志，1997，77：529-530.
3 Lin X, Sgroi D, Sterner C J, et al. Mutational analysis of CDKN2(MTS1/p16) in human breast carcinomas. Cancer Res, 1994,54：5256-5264.
4 Brenner A J, Aldas C M. Chromosome 9p allelic loss and p16/CDKN2 in breast cancer and evidence of p16 inactivation in immortal breast epithelial cells. Cancer Res, 1995,55：2892-2895.
5 Geradts J, Wilson PA. High frequence of aberrant p16INK4A expression in human breast cancer. Am J Pathol, 1996, 149：15-20.
6 Mero A, Herman J G, Mao L, et al. 5′CPG island methylation is associated with transcriptional silencing of the tumor suppressor p16/CDKN2/MTS1 in human cancer. Nat Med, 1995,1：686-692.
(收稿：1997-05-21 修回：1997-12-30), http://www.100md.com