川芎嗪和(或)环孢素A对HL60/HT细胞耐药的逆转
作者：梁蓉 杨平地 陈协群
单位：710033 西安，第四军医大学西京医院血液内科
关键词：
中华内科杂志990416 多药耐药(MDR)是产生难治和复发性白血病的关键所在，逆转白血病MDR是当今亟待解决的问题。环孢素A(CsA)是一种免疫抑制剂，体外研究表明CsA可以通过增加MDR细胞内药物浓度而提高化疗药物的敏感性，国外已进入二期临床试验[1]，但由于副作用较大和价格昂贵等限制了临床应用。我们观察了一种低毒、价廉的中药钙通道阻滞剂川芎嗪(TMP)和(或)CsA对白血病MDR的逆转作用。
一、材料和方法
1.细胞株：HL60敏感细胞株为上海细胞生物所提供，HL60/HT耐药细胞株由北京师范大学生物系提供。每月在含三尖杉酯碱(HT)的RPMI 1640培养液中培养5天，实验用细胞处于对数生长期。
, 百拇医药
2.药物与试剂：TMP购自北京第四制药厂，CsA为瑞士SANDOZ公司产品，柔红霉素(DNR)为Pharmacia和Upjohn 产品，四唑氮蓝(MTT)为Sigma产品。
3.细胞毒性试验：对照组为未加药的空白对照，给药组分DNR组、TMP组、CsA组、TMP+DNR组、CsA+DNR组和TMP+CsA+DNR组。采用常规MTT法求半数细胞抑制剂量(IC50值)。计算逆转倍数和相对逆转效率，前者为逆转前IC50值/逆转后IC50值，后者为[(逆转前IC50值-逆转后IC50值)/(逆转前IC50值-亲本IC50值)]×100%。
4.测定细胞内DNR浓度[2]：调整HL60、HL60/HT细胞至1×106/ml，后者先经TMP和(或)CsA处理60分钟，然后两种细胞再同时加DNR至终浓度为(10 mg/L)，60分钟后加等体积预冷PBS以终止细胞代谢，冷PBS洗涤后，立即用EPICS XL-MCL流式细胞仪(Coulter公司)，测定细胞内DNR被激发的相对荧光强度(激发波长488 nm，发射波长575 nm)，以荧光任意单位的对数值表示DNR浓度。
, 百拇医药
5.统计学处理：采用t检验法。
二、结果
1.确定TMP和CsA的非细胞毒性的剂量：根据剂量效应曲线得出：当TMP或CsA终浓度≤100 mg/L或10 mg/L时，无明显的抑制作用,细胞存活率>95%；非细胞毒性剂量100 mg/L TMP与CsA联合并不影响CsA的剂量效应曲线。本组采用细胞非抑制剂量100 mg/L和3.2 mg/L分别作为TMP和CsA逆转剂量。
2.TMP和(或)CsA对HL60/HT细胞多药耐药的逆转：单用DNR时，HL60/HT细胞的IC50值(891 μg/L)明显大于HL60细胞的IC50值(50 μg/L)。如表1所示，采用100 mg/L TMP和(或)3.2 mg/L CsA均能降低HL60/HT细胞DNR的IC50，其下降程度依次为3.2 mg/L CsA +100 mg/L TMP>3.2 mg/L CsA或100 mg/L TMP。
, 百拇医药
表1 环孢素A和川芎嗪对HL60/HT细胞
DNR的逆转作用 组别
DNR IC50
(μg/L)
逆转
倍数
相对
逆转率(%)
逆转前组
891.3±183.3
川芎嗪组
281.8± 57.9*
, http://www.100md.com
3
72.5
环孢素A组
223.8± 45.9*
4
79.4
环孢素A+川芎嗪组
102.2± 25.8**
9
93.8
注：与单用DNR相比，*P<0.01；与单用DNR及单用环孢素A或川芎嗪相比，**P<0.01 DNR：柔红霉素
, 百拇医药
3.TMP和(或)CsA对HL60/HT细胞DNR蓄积的影响：HL60敏感细胞和HL60/HT耐药细胞内DNR浓度差别很大，其平均荧光强度和阳性细胞率分别为16.67、1.17(对数值)和99.8%、33.2%(P<0.01)。100 mg/L TMP组、3.2 mg/L CsA组、3.2 mg/L CsA+100 mg/L TMP组的阳性细胞率分别为63.9%、73.3%和82.7%，平均荧光强度(对数值)为(2.27±1.60)、(3.28±2.58)和(4.13±2.51)，三组均能增加HL60/HT细胞对DNR的蓄积(CsA+TMP组>CsA组>TMP组)(P<0.01)。
讨论 国内外CsA及其衍生物逆转MDR已进入Ⅱ期临床，但因其具有一定的毒副作用，病人难于接受。从临床考虑MDR逆转的新策略是联合应用逆转剂。川芎嗪为中药川芎的有效成分之一，属酰胺类生物碱，化学结构为四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)，已证实其具有钙通道阻滞活性[3]，主要用于心脑血管疾病等，毒副作用少。近来有人发现它可部分纠正阿霉素对小鼠艾氏腹水癌的抗药性等[4]。本组通过MTT法和流式细胞仪检测细胞内DNR的浓度的方法进一步证实了TMP对HL60/HT白血病细胞MDR的逆转。由于HL60/HT耐药细胞过度表达mdr-1基因和P170蛋白，而TMP同异博定一样具有钙通道阻滞活性，也能增加耐药细胞内的DNR浓度，故推理TMP可能也和VP一样影响mdr-1的表达和P170的功能[5]。本研究还显示TMP和CsA具有逆转协同作用，即体外TMP可以增强CsA对HL60/HT细胞MDR的逆转效应，相对逆转效率由单用CsA的79.4%增至93.8%，因此，TMP和CsA联合既可以达到提高MDR逆转效应的目的，又可以避免为了达到高逆转效果而单独提高CsA浓度所至的明显副作用。
, 百拇医药
本课题受陕西省自然科学计划项目资助(No.97SM53)
参考文献
1 Ling V. Multidrug resistance:molecular mechanisms and clinical relevance. Cancer Chemother Pharmacol,1997,40(Suppl):S3-8.
2 Marks DS, Su GM, Davey RA, et al.Extanded multifrug resistance in haemopoietic cells. Br J Haematol, 1996,95:587-591.
3 王玉良，巴彦坤.川芎嗪对心血管组织的药理和电生理作用——一种新的“钙拮抗剂”?中西医结合杂志，1985,5:291-293.
4 胡艳平，刘健，王庆端，等.川芎嗪和维拉帕米纠正阿霉素对小鼠腹水癌的抗药性.药学学报，1993,28:75-78.
5 Toffoli G, Simone F, Corona G, et al. Structure-activity relationship of verapamil analogs and reversal of multidrug resistance. Biochem Pharmacol, 1995,50:1245-1255.
(收稿：1998-03-11 修回：1998-06-26), 百拇医药
单位：710033 西安，第四军医大学西京医院血液内科
关键词：
中华内科杂志990416 多药耐药(MDR)是产生难治和复发性白血病的关键所在，逆转白血病MDR是当今亟待解决的问题。环孢素A(CsA)是一种免疫抑制剂，体外研究表明CsA可以通过增加MDR细胞内药物浓度而提高化疗药物的敏感性，国外已进入二期临床试验[1]，但由于副作用较大和价格昂贵等限制了临床应用。我们观察了一种低毒、价廉的中药钙通道阻滞剂川芎嗪(TMP)和(或)CsA对白血病MDR的逆转作用。
一、材料和方法
1.细胞株：HL60敏感细胞株为上海细胞生物所提供，HL60/HT耐药细胞株由北京师范大学生物系提供。每月在含三尖杉酯碱(HT)的RPMI 1640培养液中培养5天，实验用细胞处于对数生长期。
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2.药物与试剂：TMP购自北京第四制药厂，CsA为瑞士SANDOZ公司产品，柔红霉素(DNR)为Pharmacia和Upjohn 产品，四唑氮蓝(MTT)为Sigma产品。
3.细胞毒性试验：对照组为未加药的空白对照，给药组分DNR组、TMP组、CsA组、TMP+DNR组、CsA+DNR组和TMP+CsA+DNR组。采用常规MTT法求半数细胞抑制剂量(IC50值)。计算逆转倍数和相对逆转效率，前者为逆转前IC50值/逆转后IC50值，后者为[(逆转前IC50值-逆转后IC50值)/(逆转前IC50值-亲本IC50值)]×100%。
4.测定细胞内DNR浓度[2]：调整HL60、HL60/HT细胞至1×106/ml，后者先经TMP和(或)CsA处理60分钟，然后两种细胞再同时加DNR至终浓度为(10 mg/L)，60分钟后加等体积预冷PBS以终止细胞代谢，冷PBS洗涤后，立即用EPICS XL-MCL流式细胞仪(Coulter公司)，测定细胞内DNR被激发的相对荧光强度(激发波长488 nm，发射波长575 nm)，以荧光任意单位的对数值表示DNR浓度。
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5.统计学处理：采用t检验法。
二、结果
1.确定TMP和CsA的非细胞毒性的剂量：根据剂量效应曲线得出：当TMP或CsA终浓度≤100 mg/L或10 mg/L时，无明显的抑制作用,细胞存活率>95%；非细胞毒性剂量100 mg/L TMP与CsA联合并不影响CsA的剂量效应曲线。本组采用细胞非抑制剂量100 mg/L和3.2 mg/L分别作为TMP和CsA逆转剂量。
2.TMP和(或)CsA对HL60/HT细胞多药耐药的逆转：单用DNR时，HL60/HT细胞的IC50值(891 μg/L)明显大于HL60细胞的IC50值(50 μg/L)。如表1所示，采用100 mg/L TMP和(或)3.2 mg/L CsA均能降低HL60/HT细胞DNR的IC50，其下降程度依次为3.2 mg/L CsA +100 mg/L TMP>3.2 mg/L CsA或100 mg/L TMP。
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表1 环孢素A和川芎嗪对HL60/HT细胞
DNR的逆转作用 组别
DNR IC50
(μg/L)
逆转
倍数
相对
逆转率(%)
逆转前组
891.3±183.3
川芎嗪组
281.8± 57.9*
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3
72.5
环孢素A组
223.8± 45.9*
4
79.4
环孢素A+川芎嗪组
102.2± 25.8**
9
93.8
注：与单用DNR相比，*P<0.01；与单用DNR及单用环孢素A或川芎嗪相比，**P<0.01 DNR：柔红霉素
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3.TMP和(或)CsA对HL60/HT细胞DNR蓄积的影响：HL60敏感细胞和HL60/HT耐药细胞内DNR浓度差别很大，其平均荧光强度和阳性细胞率分别为16.67、1.17(对数值)和99.8%、33.2%(P<0.01)。100 mg/L TMP组、3.2 mg/L CsA组、3.2 mg/L CsA+100 mg/L TMP组的阳性细胞率分别为63.9%、73.3%和82.7%，平均荧光强度(对数值)为(2.27±1.60)、(3.28±2.58)和(4.13±2.51)，三组均能增加HL60/HT细胞对DNR的蓄积(CsA+TMP组>CsA组>TMP组)(P<0.01)。
讨论 国内外CsA及其衍生物逆转MDR已进入Ⅱ期临床，但因其具有一定的毒副作用，病人难于接受。从临床考虑MDR逆转的新策略是联合应用逆转剂。川芎嗪为中药川芎的有效成分之一，属酰胺类生物碱，化学结构为四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)，已证实其具有钙通道阻滞活性[3]，主要用于心脑血管疾病等，毒副作用少。近来有人发现它可部分纠正阿霉素对小鼠艾氏腹水癌的抗药性等[4]。本组通过MTT法和流式细胞仪检测细胞内DNR的浓度的方法进一步证实了TMP对HL60/HT白血病细胞MDR的逆转。由于HL60/HT耐药细胞过度表达mdr-1基因和P170蛋白，而TMP同异博定一样具有钙通道阻滞活性，也能增加耐药细胞内的DNR浓度，故推理TMP可能也和VP一样影响mdr-1的表达和P170的功能[5]。本研究还显示TMP和CsA具有逆转协同作用，即体外TMP可以增强CsA对HL60/HT细胞MDR的逆转效应，相对逆转效率由单用CsA的79.4%增至93.8%，因此，TMP和CsA联合既可以达到提高MDR逆转效应的目的，又可以避免为了达到高逆转效果而单独提高CsA浓度所至的明显副作用。
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本课题受陕西省自然科学计划项目资助(No.97SM53)
参考文献
1 Ling V. Multidrug resistance:molecular mechanisms and clinical relevance. Cancer Chemother Pharmacol,1997,40(Suppl):S3-8.
2 Marks DS, Su GM, Davey RA, et al.Extanded multifrug resistance in haemopoietic cells. Br J Haematol, 1996,95:587-591.
3 王玉良，巴彦坤.川芎嗪对心血管组织的药理和电生理作用——一种新的“钙拮抗剂”?中西医结合杂志，1985,5:291-293.
4 胡艳平，刘健，王庆端，等.川芎嗪和维拉帕米纠正阿霉素对小鼠腹水癌的抗药性.药学学报，1993,28:75-78.
5 Toffoli G, Simone F, Corona G, et al. Structure-activity relationship of verapamil analogs and reversal of multidrug resistance. Biochem Pharmacol, 1995,50:1245-1255.
(收稿：1998-03-11 修回：1998-06-26), 百拇医药