PCR检测HBV感染患者血清HBV DNA的临床意义
作者：周 平 张木森 蔡 庆 陈友纯 李晓娟 于建国 关 键 刘春灵
单位：空军总医院传染科 北京市 100036
关键词：肝炎，乙型/病毒学；肝炎病毒，乙型/遗传学；DNA，病毒/分析
华人消化杂志980329 Detection of HBV DNA in serum of patients with HBV infection by polymerase chain reaction
ZHOU Ping, ZHANG Mu-Sen, CAI Qing, CHEN You-Chun, LI Xiao-Juan, YU Jian-Guo, GUAN Jian and LIU Chun-Ling
Department of Infectious Diseases, Chinese PLA Air Force General Hospital, Beijing 100036, China
, 百拇医药
Subject headings hepatitis B/virology; hepatitis B virus/genetics; DNA, viral/analysis
Abstract
AIM To study the clinical significance of HBV DNA detection in sera of patients with acute hepatitis B (AHB) and chronic hepatitis B (CHB) associated with liver cirrhosis (LC) and primary hepatocellular carcinoma (PHC).
METHODS HBV DNA in sera of 205 patients with HBV infection was detected by polymerase chain reaction (PCR).
, 百拇医药
RESULTS The positive rate of HBV DNA in the 205 cases of HBV infection was 69.3%. The positive rates of HBV DNA in patients with CHB (76.4%), LC (71.9%) and PHC (70.0%) were markedly higher than in patients with AHB (21.7%), (P<0.01); and were significantly higher in patients with positive HBeAg (93.6%) than in patients with negative HBeAg, positive or negative anti-HBe and negative HBsAg (45.6%, 25.0% and 12.5%), (P<0.01). There was no difference in the serum ALT levels between the patients with serum positive and negative HBV DNA (P>0.05).
, 百拇医药
CONCLUSION Chronicity of HBV infection might be correlated with the persitent existence of serum HBV DNA, but not significantly related to the liver damage of patients with HBV infection.
中国图书资料分类号 R 512.62
摘 要
目的 探讨急、慢性乙型肝炎 及与HBV感染相关的肝硬变和肝癌患者血清HBV DNA的临床意义.
方法 应用PCR技术检测不同HBV感染205例，患者血清HBV DNA，并与正常人20例作比较.
结果 HBV感染患者205例血清HBV DNA阳性率为69.3%，慢性乙肝、乙肝后肝硬变和肝癌患者的阳性率分别为76.4%，71.9%和70.0%，显著高于急性乙肝患者21.7%的阳性率(P<0.01)；HBeAg(+)患者血清HBV DNA阳性率为93.6%，显著高于HBeAg(-)抗-HBe(+)/(-)和HBsAg(-)患者的阳性率(45.6%，25.0%和12.5%， P<0.01)；血清HBV DNA阳性和阴性两组患者的血清ALT水平无明显差异(P>0.05).
, http://www.100md.com
结论 血清中HBV DNA持续存在可能与乙型肝炎的慢性化有关，而与HBV感染患者的肝损伤无明显关系.
0 引言
聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术是本世纪分子生物学重大进展之一，在体外可将特异DNA序列呈百万倍扩增，具有高灵敏度和高特异性. 随着该技术的不断改进和完善，其在HBV感染研究中的应用也越来越多，大大丰富和更新了人们对HBV感染的认识[1]. 作者应用PCR技术检测不同HBV感染患者血清中HBV DNA，旨在探讨急、慢性乙型肝炎及与HBV感染相关的肝硬变和肝癌患者血清HBV DNA的存在情况及其与HBV血清标志物(HBVM)在反映体内病毒复制方面存在的差异，以及肝炎活动时，肝脏损害与血清中HBV DNA的关系.
1 对象和方法
, 百拇医药
1.1 对象 病例为近几年来本院住院患者，急性乙肝23例，慢性乙肝140例，乙肝后肝硬变32例，原发性肝癌10例，总计205例. 诊断符合1995年5月北京第五次全国传染病寄生虫学术会议讨论修订的病毒性肝炎防治方案标准. 另选择20例正常健康人作为对照.
1.2 方法 ①HBV DNA：取裂解液(0.45% NP-40，1.5%β-巯基乙醇)50 μl加血清30 μl，96℃加热30 min，12000 r/ min×10 min离心，取上清做PCR. PCR总反应体积为30 μl，其中10×buffer 3 μl四种dNTP 各200 μmol/ L，上下游引物分别为0.5 μmol/ L，Taq DNA聚合酶1.5 U，处理后标本10 μl. 循环参数为94℃ 50 s， 56℃，50 s， 72℃ 1 min， 共35次循环. 取PCR产物15 μl，经20 g/ L琼脂糖电泳，溴乙锭染色后，在紫外灯下观察结果. 出现一条270bp的DNA区带为阳性. ②HBVM的检测：HBsAg，抗-HBs，HBeAg，抗-HBe，抗-HBc和抗-HBc-IgM. 均采用ELISA检测，试剂盒由北京四环生物制品厂提供.
, 百拇医药
2 结果
血清HBV DNA阳性率为69.3%(142/205)，慢性乙肝，乙肝后肝硬变和肝癌的阳性率，均显著高于急性乙肝患者的阳性率(P<0.01). 20例正常健康人血清HBsAg和HBV DNA均阴性(表1). HBeAg(+)组患者血清HBV DNA阳性率为93.6%非常显著高于HBeAg(-)的其它三组(P<0.01，表2). 经统计学分析显示，血清HBV DNA阳性组与阴性组患者血清ALT水平比较无明显差异(P>0.05).
表1 肝病患者血清HBV DNA检测结果 临床类型
n
HBV DNA阳性数(%)
急性乙型肝炎
23
, 百拇医药
5(21.7)
慢性乙型肝炎
140
107(76.4)b
乙肝后肝硬变
32
23(71.9)b
原发性肝癌
10
7(70.0)b
总计
205
, 百拇医药
142(69.3)
bP<0.01，vs 急性乙肝.表2 HBV感染患者血清HBV DNA与HBeAg/抗-HBe的关系 临床类型
n
HBV DNA阳性数(%)
HBsAg(+) HBeAg(+)抗-HBc(+)
110
103(93.6)
HBsAg(+) 抗-HBe(+)抗-HBc(+)
79
36(45.6)b
, 百拇医药
HBsAg(+) 抗-HBe(-)抗-HBc(+)
8
2(25.0)b
HBsAg(-) 抗-HBe(+)/抗-HBc(+)
8
1(12.5)b
总计
205
142(69.3)
bP<0.01 vs HBeAg(+)组.
3 讨论
, 百拇医药
PCR是一种体外基因扩增技术，具有极高的灵敏性和特异性，为HBV感染基因水平的研究提供了一种十分可靠和重要的方法，使人类对HBV感染的研究得到了进一步的深入. 作者应用PCR技术检测了205例HBV感染患者血清HBV DNA阳性率为69.3%，其中慢性乙肝、 乙肝后肝硬变和原发性肝癌患者的阳性率分别为76.4%，71.9%和70%显著高于急性乙肝患者的阳性率21.7%. 与国内有关报道有一定的差异，尤其是急性乙肝的阳性率有明显较低[2，3]. 本组急性乙肝患者血清HBV DNA检出率明显低于其它HBV慢性感染患者与大多数急性乙肝的自限性病程，预后良好相吻合[4]. 我们认为急慢性HBV感染患者血清中HBV DNA检出率这种明显的差异提示：血清中HBV DNA持续存在可能与乙型肝炎的慢性化有关，血清中HBV DNA较早的消失可能是急性乙肝自限和预后良好的表现. 应用PCR技术检测血清HBV DNA有助于HBV感染患者预后的判断.
乙型肝炎的发病机理较为复杂，目前认为乙型肝炎患者肝脏受损，并不是HBV在肝细胞内繁殖的直接结果，而机体的免疫反应，如T淋巴细胞对肝细胞膜上HBcAg的免疫应答，抗肝细胞膜特异性脂蛋白(抗LSP)介导的抗体依赖性细胞的细胞毒(ADCC)反应，才是引起肝细胞损伤的主要原因[5]. 我们比较分析了血清HBV DNA阳性和阴性两组患者的血清ALT水平，未发现明显差异，说明血清HBV DNA阳性与否与肝损伤无明显关系. 进一步论证了以上学说. 通过检测HBV的血清标志物可以帮助我们判断HBV感染的不同阶段. HBV感染早期出现HBsAg，以后出现HBeAg和抗-HBc，血清HBeAg阳性通常认为病毒复制活跃，传染性强. 本文结果显示：HBeAg阳性患者血清中HBV DNA检出率为93.6%，抗-HBe阳性患者的阳性率为45.6%，与国内有关报告的结果相近[2，3，6]. 经统计学分析：HBeAg阳性患者血清HBV DNA检出率非常显著高于HBeAg阴性抗-HBe阳性或阴性患者. 支持以上观点. 同时也表明：HBeAg是一项反映HBV复制的良好指标. 一般认为当HBeAg阳性转换为抗-HBe阳性后，HBV复制明显减弱或停止，病情随之稳定或缓解. 本组79例抗-HBe阳性患者中，有45.6%的患者血清HBV DNA阳性，病情仍在活动，有些甚至加重，说明e系统血清转换后，HBV DNA并非完全消失，病情并未停止活动，只是含量减少. 因此，应用PCR技术检测HBV DNA有助于重新评价HBV感染的自然史和HBVM的临床意义.
, http://www.100md.com
周平，男，1963-05-21生，湖南省武岗市人，汉族. 1982年湖南邵阳卫校医专毕业，1990年第三军医大学硕士研究生毕业，主治医师，医学硕士，主要从事肝脏疾病的临床和科研工作，发表论文20篇.
通讯作者：周平，100036，空军总医院传染科，北京市海淀区阜成路30号.
Correspondence to: ZHOU Ping, Department of Infectious Diseases, Chinese PLA Air Force General Hospital, 30 Fuchenglu, Haidian District, Beijing 100036, China
Tel. +86·10·68410099-8619
收稿日期： 1997-08-29 修回日期： 1997-10-25
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4 参考文献
1 周平. PCR技术在乙型肝炎病毒感染研究中的应用. 见：李景泰，主编. 临床医学分子生物学现状和未来. 第1版. 北京：中国科学技术出版社，1993：197-202
2 全硕，裴秀，王麟士，刘金星. 聚合酶链反应检测HBV DNA及其临床意义. 中华传染病杂志，1992；10(2)：110-112
3 迟宝荣，孟祥伟，李波. PCR检测582例HBV DNA对肝病诊断的临床意义. 临床肝胆病杂志，1994；10(1)：35-36
4 崔振宇，徐道振. 病毒性肝炎的临床表现，诊断及预后研究. 见：高寿征主编.病毒性肝炎防治研究. 北京：北京出版社，1993：154-160
5 Lau JYN, Wright TL. Molecular virology and pathogensis of hepatitis B. Lancet, 1993;342(8883):1335-1340
6 周永兴，姚志强，张文彬. 应用多聚酶链反应(PCR)检测HBV DNA. 临床肝胆病杂志，1992；8(4)：204-205, 百拇医药
单位：空军总医院传染科 北京市 100036
关键词：肝炎，乙型/病毒学；肝炎病毒，乙型/遗传学；DNA，病毒/分析
华人消化杂志980329 Detection of HBV DNA in serum of patients with HBV infection by polymerase chain reaction
ZHOU Ping, ZHANG Mu-Sen, CAI Qing, CHEN You-Chun, LI Xiao-Juan, YU Jian-Guo, GUAN Jian and LIU Chun-Ling
Department of Infectious Diseases, Chinese PLA Air Force General Hospital, Beijing 100036, China
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Subject headings hepatitis B/virology; hepatitis B virus/genetics; DNA, viral/analysis
Abstract
AIM To study the clinical significance of HBV DNA detection in sera of patients with acute hepatitis B (AHB) and chronic hepatitis B (CHB) associated with liver cirrhosis (LC) and primary hepatocellular carcinoma (PHC).
METHODS HBV DNA in sera of 205 patients with HBV infection was detected by polymerase chain reaction (PCR).
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RESULTS The positive rate of HBV DNA in the 205 cases of HBV infection was 69.3%. The positive rates of HBV DNA in patients with CHB (76.4%), LC (71.9%) and PHC (70.0%) were markedly higher than in patients with AHB (21.7%), (P<0.01); and were significantly higher in patients with positive HBeAg (93.6%) than in patients with negative HBeAg, positive or negative anti-HBe and negative HBsAg (45.6%, 25.0% and 12.5%), (P<0.01). There was no difference in the serum ALT levels between the patients with serum positive and negative HBV DNA (P>0.05).
, 百拇医药
CONCLUSION Chronicity of HBV infection might be correlated with the persitent existence of serum HBV DNA, but not significantly related to the liver damage of patients with HBV infection.
中国图书资料分类号 R 512.62
摘 要
目的 探讨急、慢性乙型肝炎 及与HBV感染相关的肝硬变和肝癌患者血清HBV DNA的临床意义.
方法 应用PCR技术检测不同HBV感染205例，患者血清HBV DNA，并与正常人20例作比较.
结果 HBV感染患者205例血清HBV DNA阳性率为69.3%，慢性乙肝、乙肝后肝硬变和肝癌患者的阳性率分别为76.4%，71.9%和70.0%，显著高于急性乙肝患者21.7%的阳性率(P<0.01)；HBeAg(+)患者血清HBV DNA阳性率为93.6%，显著高于HBeAg(-)抗-HBe(+)/(-)和HBsAg(-)患者的阳性率(45.6%，25.0%和12.5%， P<0.01)；血清HBV DNA阳性和阴性两组患者的血清ALT水平无明显差异(P>0.05).
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结论 血清中HBV DNA持续存在可能与乙型肝炎的慢性化有关，而与HBV感染患者的肝损伤无明显关系.
0 引言
聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术是本世纪分子生物学重大进展之一，在体外可将特异DNA序列呈百万倍扩增，具有高灵敏度和高特异性. 随着该技术的不断改进和完善，其在HBV感染研究中的应用也越来越多，大大丰富和更新了人们对HBV感染的认识[1]. 作者应用PCR技术检测不同HBV感染患者血清中HBV DNA，旨在探讨急、慢性乙型肝炎及与HBV感染相关的肝硬变和肝癌患者血清HBV DNA的存在情况及其与HBV血清标志物(HBVM)在反映体内病毒复制方面存在的差异，以及肝炎活动时，肝脏损害与血清中HBV DNA的关系.
1 对象和方法
, 百拇医药
1.1 对象 病例为近几年来本院住院患者，急性乙肝23例，慢性乙肝140例，乙肝后肝硬变32例，原发性肝癌10例，总计205例. 诊断符合1995年5月北京第五次全国传染病寄生虫学术会议讨论修订的病毒性肝炎防治方案标准. 另选择20例正常健康人作为对照.
1.2 方法 ①HBV DNA：取裂解液(0.45% NP-40，1.5%β-巯基乙醇)50 μl加血清30 μl，96℃加热30 min，12000 r/ min×10 min离心，取上清做PCR. PCR总反应体积为30 μl，其中10×buffer 3 μl四种dNTP 各200 μmol/ L，上下游引物分别为0.5 μmol/ L，Taq DNA聚合酶1.5 U，处理后标本10 μl. 循环参数为94℃ 50 s， 56℃，50 s， 72℃ 1 min， 共35次循环. 取PCR产物15 μl，经20 g/ L琼脂糖电泳，溴乙锭染色后，在紫外灯下观察结果. 出现一条270bp的DNA区带为阳性. ②HBVM的检测：HBsAg，抗-HBs，HBeAg，抗-HBe，抗-HBc和抗-HBc-IgM. 均采用ELISA检测，试剂盒由北京四环生物制品厂提供.
, 百拇医药
2 结果
血清HBV DNA阳性率为69.3%(142/205)，慢性乙肝，乙肝后肝硬变和肝癌的阳性率，均显著高于急性乙肝患者的阳性率(P<0.01). 20例正常健康人血清HBsAg和HBV DNA均阴性(表1). HBeAg(+)组患者血清HBV DNA阳性率为93.6%非常显著高于HBeAg(-)的其它三组(P<0.01，表2). 经统计学分析显示，血清HBV DNA阳性组与阴性组患者血清ALT水平比较无明显差异(P>0.05).
表1 肝病患者血清HBV DNA检测结果 临床类型
n
HBV DNA阳性数(%)
急性乙型肝炎
23
, 百拇医药
5(21.7)
慢性乙型肝炎
140
107(76.4)b
乙肝后肝硬变
32
23(71.9)b
原发性肝癌
10
7(70.0)b
总计
205
, 百拇医药
142(69.3)
bP<0.01，vs 急性乙肝.表2 HBV感染患者血清HBV DNA与HBeAg/抗-HBe的关系 临床类型
n
HBV DNA阳性数(%)
HBsAg(+) HBeAg(+)抗-HBc(+)
110
103(93.6)
HBsAg(+) 抗-HBe(+)抗-HBc(+)
79
36(45.6)b
, 百拇医药
HBsAg(+) 抗-HBe(-)抗-HBc(+)
8
2(25.0)b
HBsAg(-) 抗-HBe(+)/抗-HBc(+)
8
1(12.5)b
总计
205
142(69.3)
bP<0.01 vs HBeAg(+)组.
3 讨论
, 百拇医药
PCR是一种体外基因扩增技术，具有极高的灵敏性和特异性，为HBV感染基因水平的研究提供了一种十分可靠和重要的方法，使人类对HBV感染的研究得到了进一步的深入. 作者应用PCR技术检测了205例HBV感染患者血清HBV DNA阳性率为69.3%，其中慢性乙肝、 乙肝后肝硬变和原发性肝癌患者的阳性率分别为76.4%，71.9%和70%显著高于急性乙肝患者的阳性率21.7%. 与国内有关报道有一定的差异，尤其是急性乙肝的阳性率有明显较低[2，3]. 本组急性乙肝患者血清HBV DNA检出率明显低于其它HBV慢性感染患者与大多数急性乙肝的自限性病程，预后良好相吻合[4]. 我们认为急慢性HBV感染患者血清中HBV DNA检出率这种明显的差异提示：血清中HBV DNA持续存在可能与乙型肝炎的慢性化有关，血清中HBV DNA较早的消失可能是急性乙肝自限和预后良好的表现. 应用PCR技术检测血清HBV DNA有助于HBV感染患者预后的判断.
乙型肝炎的发病机理较为复杂，目前认为乙型肝炎患者肝脏受损，并不是HBV在肝细胞内繁殖的直接结果，而机体的免疫反应，如T淋巴细胞对肝细胞膜上HBcAg的免疫应答，抗肝细胞膜特异性脂蛋白(抗LSP)介导的抗体依赖性细胞的细胞毒(ADCC)反应，才是引起肝细胞损伤的主要原因[5]. 我们比较分析了血清HBV DNA阳性和阴性两组患者的血清ALT水平，未发现明显差异，说明血清HBV DNA阳性与否与肝损伤无明显关系. 进一步论证了以上学说. 通过检测HBV的血清标志物可以帮助我们判断HBV感染的不同阶段. HBV感染早期出现HBsAg，以后出现HBeAg和抗-HBc，血清HBeAg阳性通常认为病毒复制活跃，传染性强. 本文结果显示：HBeAg阳性患者血清中HBV DNA检出率为93.6%，抗-HBe阳性患者的阳性率为45.6%，与国内有关报告的结果相近[2，3，6]. 经统计学分析：HBeAg阳性患者血清HBV DNA检出率非常显著高于HBeAg阴性抗-HBe阳性或阴性患者. 支持以上观点. 同时也表明：HBeAg是一项反映HBV复制的良好指标. 一般认为当HBeAg阳性转换为抗-HBe阳性后，HBV复制明显减弱或停止，病情随之稳定或缓解. 本组79例抗-HBe阳性患者中，有45.6%的患者血清HBV DNA阳性，病情仍在活动，有些甚至加重，说明e系统血清转换后，HBV DNA并非完全消失，病情并未停止活动，只是含量减少. 因此，应用PCR技术检测HBV DNA有助于重新评价HBV感染的自然史和HBVM的临床意义.
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周平，男，1963-05-21生，湖南省武岗市人，汉族. 1982年湖南邵阳卫校医专毕业，1990年第三军医大学硕士研究生毕业，主治医师，医学硕士，主要从事肝脏疾病的临床和科研工作，发表论文20篇.
通讯作者：周平，100036，空军总医院传染科，北京市海淀区阜成路30号.
Correspondence to: ZHOU Ping, Department of Infectious Diseases, Chinese PLA Air Force General Hospital, 30 Fuchenglu, Haidian District, Beijing 100036, China
Tel. +86·10·68410099-8619
收稿日期： 1997-08-29 修回日期： 1997-10-25
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4 参考文献
1 周平. PCR技术在乙型肝炎病毒感染研究中的应用. 见：李景泰，主编. 临床医学分子生物学现状和未来. 第1版. 北京：中国科学技术出版社，1993：197-202
2 全硕，裴秀，王麟士，刘金星. 聚合酶链反应检测HBV DNA及其临床意义. 中华传染病杂志，1992；10(2)：110-112
3 迟宝荣，孟祥伟，李波. PCR检测582例HBV DNA对肝病诊断的临床意义. 临床肝胆病杂志，1994；10(1)：35-36
4 崔振宇，徐道振. 病毒性肝炎的临床表现，诊断及预后研究. 见：高寿征主编.病毒性肝炎防治研究. 北京：北京出版社，1993：154-160
5 Lau JYN, Wright TL. Molecular virology and pathogensis of hepatitis B. Lancet, 1993;342(8883):1335-1340
6 周永兴，姚志强，张文彬. 应用多聚酶链反应(PCR)检测HBV DNA. 临床肝胆病杂志，1992；8(4)：204-205, 百拇医药