乙型肝炎病毒核心抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞作用的靶细胞的建立*
作者：隋礼丽 周福元 骆抗先
单位：第一军医大学南方医院感染内科，广州，510515
关键词：乙型肝炎病毒；B细胞；表达；靶细胞
第一军医大学学报990202 摘要：目的 建立HBcAg特异性CTL作用的靶细胞系统，为进一步研究HBV 基因变异对CTL细胞毒效应的影响奠定基础。方法 采用两种质粒pXT1和EBO-plpp构建HBV C基因真核细胞表达载体并转染永生化B细胞，DNA分析和流式细胞仪检测HBV C基因在宿主细胞中的复制、表达。 结果 在转染重组质粒pXT1-HBVc 和EBO-plpp-HBVc的B细胞中，均能检测到目的基因；分别有89.81%和88.51%的宿主细胞能检测到HBcAg；连续培养3周后，分别有88.30%和72.19%的宿主细胞表达HBcAg。结论 重组逆转录病毒表达载体pXT1-HBVc和EB病毒表达载体EBO-plpp-HBVc转染的永生化人外周血B细胞能有效地表达靶抗原(HBcAg)，可作为较为理想的HBV特异性CTL作用的靶细胞。
, 百拇医药
中图分类号：R512.6
Establishment of target cells of cytotoxic T-lymphocyte response with specifity of HBcAg
Sui Lili, Zhou Fuyuan, Luo Kangxian
Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Abstract: Objective To establish target cell system of CTL response with specificity of HBV for studying the effect of CTL cytotoxicity caused by HBV gene mutation. Methods Two recombinant plasmids pXT1-HBVc and EBO-plpp-HBVc were transferred into immortalized B cells, replication and expression of HBV C gene in the host cells were detected by DNA analysis and flow cytometry. Results DNA fragments of the same size with the goal gene can be detected in the host cells, and the expressed HBcAg was detected in 89.81% and 88.51% of the host cells with transfection of recombinant plasmid pXT1-HBVc and EBO-plpp-HBVc respectively; and in 88.30% and 72.19% after 3 weeks of culture. Conclusion The immortalized B cells transfected with the recombinant plasmid pXT1-HBVc and EBO-plpp-HBVc can expressed target antigen(HBcAg) effectively, which can serve as suitable target cells of CTL response with specifity of HBV.
, 百拇医药
Key words: hepatitis B virus; B lymphocyte; expression; target cell
乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)是HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的主要靶抗原，在乙型病毒性肝炎的发病机理中起着重要作用[1]。本研究通过两种真核细胞表达载体转染永生化B细胞,表达HBcAg，并比较它们的效果，试图建立较为理想的HBV特异性的CTL作用的靶细胞，为进一步体外研究HBV特异性CTL对靶细胞的作用以及HBV变异对CTL作用的影响奠定基础。
1 材料与方法
1.1真核细胞表达载体 一种为逆转录病毒表达载体pXT1[3]；另一种为EB病毒表达载体EBO-plpp[5]。
, http://www.100md.com
1.2重组质粒的构建 以质粒pcp10(含双拷贝HBV DNA ayw亚型)为模板，扩增位于HBV1890-2452和1890-2804的C基因区，分别克隆到质粒pXT1和EBO-plpp中。
1.3 重组质粒的转染 EB病毒永生化的人外周血B细胞(本室建立)在转染前2 h更换完全R-1640培养液，收集2×106~3×10 6的细胞用于转染，转染前用不含血清和抗生素的DMEM培养基(Gibco)洗两次，以0.8 ml同样的DMEM培养基重悬。pXT1-HBc重组质粒2 m l和10 m l脂质体(Gibco)在200 m l不含血清和抗生素的DMEM培养液中混匀作用30 min，缓慢加入到细胞中；5 h后，加4 ml完全1640培养液，24 h后更换新鲜培养液，继续培养48 h，1:10传代，以含400 g/L G418的完全R-1640筛选，每三天半换液。
1.4 目的基因DNA的检测 收集1×107 细胞，常规提取宿主细胞基因组DNA，以HBV C区基因引物PCR分别扩增位于HBV1890-2452和1890-2804的目的片段。
, http://www.100md.com
1.5 流式细胞仪检测 收集2×10 6筛选阳性的细胞，以PBS洗一次；200 m l重悬与兔抗HBcAg抗体室温下孵育45 min，洗三次；再以FITC标记的鹅抗兔IgG孵育45 min，流式细胞仪检测分析1×105个细胞。
2 结果
2.1 重组质粒的鉴定 重组质粒pXT1-HBVc和EBO-plpp-HBVc的PCR和双酶切鉴定均阳性(图1)。
图1 重组质粒pXT1-HBVc(A)和EBO-plpp-HBVc(B) PCR和酶切鉴定结果
Fig.1 PCR and enzyme digestion analysis of the recombi-nant plasmid pXT1-HBVc(A) and EBO-plpp-HBVc(B)
, 百拇医药
L1: negative control；M: λDNA HindIII/EcoRI；L2: positive control; L3: PCR product of the recombinant plasmid; L4: two enzyme digestion of the recombinant plasmid; L5、6: single enzyme digestion of the recombinant plasmid; L7: profile of the recombinant plasmid
2.2 重组质粒转染B细胞的筛选 利用脂质体介导重组质粒pXT1-HBVc和EBO-plpp分别转染永生化的B细胞。在G418或潮霉素选择培养6 d后，转染pXT1-HBVc的B细胞部分死亡，转染EBO-plpp-HBVc的B细胞大量死亡，未转染的对照B细胞全部死亡。抗性细胞在减半抗生素浓度中继续培养3周后可传代扩增，继续培养2周后可用于检测。
, http://www.100md.com 2.3 转染的B细胞目的DNA的检测 以宿主细胞基因组DNA为模板，以HBV C基因区引物PCR可扩增出与目的DNA相同大小的片段。
2.4 靶抗原表达检测结果 流式细胞检测以未转染的永生化的B细胞为阴性对照，转染重组质粒pXT1-HBVc的B细胞中，有89.81%的宿主细胞能检测到HBcAg，继续培养3周，仍有88.51%的宿主细胞检测到HBcAg。而转染重组质粒EBO-plpp-HBVc的B细胞中，有88.32%的宿主细胞检测到HBcAg，继续培养3周后，只有72.19%的宿主细胞能检测到HBcAg。
3 讨论
体外研究HBV特异性的CTL功能，须建立特异性的靶细胞系统，因受到HLA限制性的约束，靶细胞与CTL必须取自被研究的同一个体。最初HBV特异性的CTL功能分析研究者采用人自身的HBV感染的肝细胞作为靶细胞，但受到系列因素的限制：(1) 由肝活检所得到的肝细胞的数量极为有限；(2) 活检肝细胞感染HBV的百分比不清；(3)不同的活检标本感染肝细胞数量的差异；(4) 肝细胞较高的自发死亡率；(5) 实验的不可重复性[4]。因此，很有必要建立取材方便、稳定表达靶抗原、重复性良好、MHC相同的特异性CTL作用的靶细胞系统。
, http://www.100md.com
因为HBV在体外不能够感染其它方便取得的人自身的细胞，因此建立庞大的人的HLA背景下的靶细胞系统只能通过基因转染的方法进行[2]。本研究在本室已建立EBV永生化的B细胞系的基础上，通过基因转染的方法在B细胞膜上表达HBcAg，试图建立较为理想的HBV特异性CTL作用的靶细胞系统。选用的逆转录病毒载体pXT1是一个高效表达的真核细胞表达载体[3]，另一载体为EB病毒表达载体[5]。通过脂质体介导的方法均能有效地把两种重组质粒转染到B细胞中，但由于逆录病毒载体能整合于宿主细胞的染色体中，与EB病毒载体相比，其转染的效率较高，表达目的蛋白较稳定。故认为，作为系列研究特异性CTL对靶细胞的作用以及目的蛋白在宿主细胞中生物学特性，重组逆转录病毒表达载体转染的宿主细胞较为理想。EB病毒载体在染色体外复制和表达[5]，在宿主细胞中拷贝数也较恒定，对短暂研究HBV基因变异导致特异性CTL对靶细胞作用的影响较为合适。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Chisari FV. Perspectives series: host/pathogen interactions, cytotoxic T cells and viral hepatitis. J Clin Invest, 1997, 99(7): 1472
2 Guilhot S, Bernard M, Penna A et al. Hepatitis B virus-specific cytotoxic T-cell response in human: production of target cells by stable expression of HBV-encoded proteins in immortalized human B-cell lines. J Virol,1992, 66(5):2670
3 Boulter CA, Wagner EF, Fowler P et al. A universal retroviral vector for efficient constitutive expression of exogenous genes. Nucleic Acids Res,1987,15(17):7194
, 百拇医药
4 Bertoletti A, Costanzo A, Chisari FV et al. HLA class I-restricted human cytotoxic T cells recognize endogenously synthesized hepatitis B virus nucleocapid antigen. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:10445
5 Canfield V, Emanuel JR, Spickofsky N et al. Ouabain-resistants mutants of the rat Na,K-ATPase α2 isoform identified by using an episomal expression vector. Mol and Cell Biol, 1990, 10(4): 1367
(收稿日期：1998-10-02), http://www.100md.com
单位：第一军医大学南方医院感染内科，广州，510515
关键词：乙型肝炎病毒；B细胞；表达；靶细胞
第一军医大学学报990202 摘要：目的 建立HBcAg特异性CTL作用的靶细胞系统，为进一步研究HBV 基因变异对CTL细胞毒效应的影响奠定基础。方法 采用两种质粒pXT1和EBO-plpp构建HBV C基因真核细胞表达载体并转染永生化B细胞，DNA分析和流式细胞仪检测HBV C基因在宿主细胞中的复制、表达。 结果 在转染重组质粒pXT1-HBVc 和EBO-plpp-HBVc的B细胞中，均能检测到目的基因；分别有89.81%和88.51%的宿主细胞能检测到HBcAg；连续培养3周后，分别有88.30%和72.19%的宿主细胞表达HBcAg。结论 重组逆转录病毒表达载体pXT1-HBVc和EB病毒表达载体EBO-plpp-HBVc转染的永生化人外周血B细胞能有效地表达靶抗原(HBcAg)，可作为较为理想的HBV特异性CTL作用的靶细胞。
, 百拇医药
中图分类号：R512.6
Establishment of target cells of cytotoxic T-lymphocyte response with specifity of HBcAg
Sui Lili, Zhou Fuyuan, Luo Kangxian
Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou, 510515
Abstract: Objective To establish target cell system of CTL response with specificity of HBV for studying the effect of CTL cytotoxicity caused by HBV gene mutation. Methods Two recombinant plasmids pXT1-HBVc and EBO-plpp-HBVc were transferred into immortalized B cells, replication and expression of HBV C gene in the host cells were detected by DNA analysis and flow cytometry. Results DNA fragments of the same size with the goal gene can be detected in the host cells, and the expressed HBcAg was detected in 89.81% and 88.51% of the host cells with transfection of recombinant plasmid pXT1-HBVc and EBO-plpp-HBVc respectively; and in 88.30% and 72.19% after 3 weeks of culture. Conclusion The immortalized B cells transfected with the recombinant plasmid pXT1-HBVc and EBO-plpp-HBVc can expressed target antigen(HBcAg) effectively, which can serve as suitable target cells of CTL response with specifity of HBV.
, 百拇医药
Key words: hepatitis B virus; B lymphocyte; expression; target cell
乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)是HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的主要靶抗原，在乙型病毒性肝炎的发病机理中起着重要作用[1]。本研究通过两种真核细胞表达载体转染永生化B细胞,表达HBcAg，并比较它们的效果，试图建立较为理想的HBV特异性的CTL作用的靶细胞，为进一步体外研究HBV特异性CTL对靶细胞的作用以及HBV变异对CTL作用的影响奠定基础。
1 材料与方法
1.1真核细胞表达载体 一种为逆转录病毒表达载体pXT1[3]；另一种为EB病毒表达载体EBO-plpp[5]。
, http://www.100md.com
1.2重组质粒的构建 以质粒pcp10(含双拷贝HBV DNA ayw亚型)为模板，扩增位于HBV1890-2452和1890-2804的C基因区，分别克隆到质粒pXT1和EBO-plpp中。
1.3 重组质粒的转染 EB病毒永生化的人外周血B细胞(本室建立)在转染前2 h更换完全R-1640培养液，收集2×106~3×10 6的细胞用于转染，转染前用不含血清和抗生素的DMEM培养基(Gibco)洗两次，以0.8 ml同样的DMEM培养基重悬。pXT1-HBc重组质粒2 m l和10 m l脂质体(Gibco)在200 m l不含血清和抗生素的DMEM培养液中混匀作用30 min，缓慢加入到细胞中；5 h后，加4 ml完全1640培养液，24 h后更换新鲜培养液，继续培养48 h，1:10传代，以含400 g/L G418的完全R-1640筛选，每三天半换液。
1.4 目的基因DNA的检测 收集1×107 细胞，常规提取宿主细胞基因组DNA，以HBV C区基因引物PCR分别扩增位于HBV1890-2452和1890-2804的目的片段。
, http://www.100md.com
1.5 流式细胞仪检测 收集2×10 6筛选阳性的细胞，以PBS洗一次；200 m l重悬与兔抗HBcAg抗体室温下孵育45 min，洗三次；再以FITC标记的鹅抗兔IgG孵育45 min，流式细胞仪检测分析1×105个细胞。
2 结果
2.1 重组质粒的鉴定 重组质粒pXT1-HBVc和EBO-plpp-HBVc的PCR和双酶切鉴定均阳性(图1)。
图1 重组质粒pXT1-HBVc(A)和EBO-plpp-HBVc(B) PCR和酶切鉴定结果
Fig.1 PCR and enzyme digestion analysis of the recombi-nant plasmid pXT1-HBVc(A) and EBO-plpp-HBVc(B)
, 百拇医药
L1: negative control；M: λDNA HindIII/EcoRI；L2: positive control; L3: PCR product of the recombinant plasmid; L4: two enzyme digestion of the recombinant plasmid; L5、6: single enzyme digestion of the recombinant plasmid; L7: profile of the recombinant plasmid
2.2 重组质粒转染B细胞的筛选 利用脂质体介导重组质粒pXT1-HBVc和EBO-plpp分别转染永生化的B细胞。在G418或潮霉素选择培养6 d后，转染pXT1-HBVc的B细胞部分死亡，转染EBO-plpp-HBVc的B细胞大量死亡，未转染的对照B细胞全部死亡。抗性细胞在减半抗生素浓度中继续培养3周后可传代扩增，继续培养2周后可用于检测。
, http://www.100md.com 2.3 转染的B细胞目的DNA的检测 以宿主细胞基因组DNA为模板，以HBV C基因区引物PCR可扩增出与目的DNA相同大小的片段。
2.4 靶抗原表达检测结果 流式细胞检测以未转染的永生化的B细胞为阴性对照，转染重组质粒pXT1-HBVc的B细胞中，有89.81%的宿主细胞能检测到HBcAg，继续培养3周，仍有88.51%的宿主细胞检测到HBcAg。而转染重组质粒EBO-plpp-HBVc的B细胞中，有88.32%的宿主细胞检测到HBcAg，继续培养3周后，只有72.19%的宿主细胞能检测到HBcAg。
3 讨论
体外研究HBV特异性的CTL功能，须建立特异性的靶细胞系统，因受到HLA限制性的约束，靶细胞与CTL必须取自被研究的同一个体。最初HBV特异性的CTL功能分析研究者采用人自身的HBV感染的肝细胞作为靶细胞，但受到系列因素的限制：(1) 由肝活检所得到的肝细胞的数量极为有限；(2) 活检肝细胞感染HBV的百分比不清；(3)不同的活检标本感染肝细胞数量的差异；(4) 肝细胞较高的自发死亡率；(5) 实验的不可重复性[4]。因此，很有必要建立取材方便、稳定表达靶抗原、重复性良好、MHC相同的特异性CTL作用的靶细胞系统。
, http://www.100md.com
因为HBV在体外不能够感染其它方便取得的人自身的细胞，因此建立庞大的人的HLA背景下的靶细胞系统只能通过基因转染的方法进行[2]。本研究在本室已建立EBV永生化的B细胞系的基础上，通过基因转染的方法在B细胞膜上表达HBcAg，试图建立较为理想的HBV特异性CTL作用的靶细胞系统。选用的逆转录病毒载体pXT1是一个高效表达的真核细胞表达载体[3]，另一载体为EB病毒表达载体[5]。通过脂质体介导的方法均能有效地把两种重组质粒转染到B细胞中，但由于逆录病毒载体能整合于宿主细胞的染色体中，与EB病毒载体相比，其转染的效率较高，表达目的蛋白较稳定。故认为，作为系列研究特异性CTL对靶细胞的作用以及目的蛋白在宿主细胞中生物学特性，重组逆转录病毒表达载体转染的宿主细胞较为理想。EB病毒载体在染色体外复制和表达[5]，在宿主细胞中拷贝数也较恒定，对短暂研究HBV基因变异导致特异性CTL对靶细胞作用的影响较为合适。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Chisari FV. Perspectives series: host/pathogen interactions, cytotoxic T cells and viral hepatitis. J Clin Invest, 1997, 99(7): 1472
2 Guilhot S, Bernard M, Penna A et al. Hepatitis B virus-specific cytotoxic T-cell response in human: production of target cells by stable expression of HBV-encoded proteins in immortalized human B-cell lines. J Virol,1992, 66(5):2670
3 Boulter CA, Wagner EF, Fowler P et al. A universal retroviral vector for efficient constitutive expression of exogenous genes. Nucleic Acids Res,1987,15(17):7194
, 百拇医药
4 Bertoletti A, Costanzo A, Chisari FV et al. HLA class I-restricted human cytotoxic T cells recognize endogenously synthesized hepatitis B virus nucleocapid antigen. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:10445
5 Canfield V, Emanuel JR, Spickofsky N et al. Ouabain-resistants mutants of the rat Na,K-ATPase α2 isoform identified by using an episomal expression vector. Mol and Cell Biol, 1990, 10(4): 1367
(收稿日期：1998-10-02), http://www.100md.com