正常人表皮细胞在增殖与终末分化中DNA的变化
作者：毛祖豪 梁应权 鲍永耀 罗深秋 王应斌 张胜方
单位：510282广州，第一军医大学珠江医院
关键词：表皮DNA
中华皮肤科杂志990410
【摘要】目的 探讨正常人表皮细胞在增殖与终末分化中DNA的变化。方法 通过粘附式细胞仪用吖啶橙染色10例正常人皮肤组织切片，测表皮各层细胞DNA综合荧光值、荧光密度、面积。结果 正常表皮细胞DNA综合荧光值、荧光密度、面积，棘层较其他各层均高(P<0.01),其余各层差异无显著性(P>0.05)；角质下层仍存在DNA荧光，角质上层DNA荧光极淡。结论 正常人表皮细胞DNA含量、浓度、分布范围以棘层最高，DNA合成最旺盛的部位在棘层，基底细胞DNA合成受到抑制，颗粒层细胞DNA不降解，可能仅发生了变性，而DNA降解的部位在角质层。
, 百拇医药
Changes of DNA Content of Normal Epidermal Cells During Proliferation
and Terminal Differentiation
MAO Zuhao, LIANG Yinquan, BAO Yongyao, et al
. Zhu-Jiang Hospital， First Military Medical University, Guangzhou 510282
【Abstract】 Objective To explore the changes of DNA content of normal epidermal cells during proliferation and terminal differentiation. Methods DNA content of human epidermal cells in each layer from normal human skin (10 cases) was determined with adherent cell analysis and sorting cytometer (ACAS570).The tissue sections with 10μ m thick were stained with acridine orange (AO), and evaluated by DNA integrated fluorescence value (IV), average fluorescence value (AV), and scanning area (A) of epidermal cells in each layer with ACAS570. Results The results showed that IV,AV, or A were higher in spinous cells than those in cells of other layers(P<0.01), but there was no difference in cells of the other layers (P> 0.05). DNA fluorescence was still present in the lower horny layers, and almost disappeared in the upper horny layers. Conclusion The results suggest that total level of DNA content, density or area of distribution are higher or larger in cells of the spinous layer than those of the other layers. These data demonstrate that the high-level DNA synthesis takes place in the spinous layer, inhibited in the basal cells, not degraded in the granular layer where DNA may be degenerated, and degraded in the horny layer.
, 百拇医药
【Key words】 Epidermis DNA
正常表皮从基底层至角质层，是细胞增殖、终末分化的连续过程，在形态学上主要表现为核的分裂、分化、退化至消失，呈现形态与分化状态不同的几个阶段。至今，对于表皮细胞在增殖、终末分化过程中DNA的量变规律认识不多。我们应用粘附式细胞仪(ACAS570)，对表皮各层细胞DNA含量、浓度、分布范围等作了初步的研究，试图揭示正常表皮细胞在增殖、终末分化各阶段中DNA的变化规律。
材料和方法
(一)临床资料：10份皮肤标本取自正常的健康人，均为男性，年龄16～52岁。取材部位：6例包皮，3例足背，1例足底。标本的组织学检查未见异常。
(二)方法：常规手术切取长棱形皮肤至皮下，0.5cm×1cm，厚约3～5mm。固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。病理切片：每个标本切取5μm、10μm切片各1张。HE染色：病理诊断为正常者再行吖啶橙(AO)染色。
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(三)AO标记细胞DNA：取10μm切片，二甲苯脱蜡2次，各10min，系列乙醇(无水乙醇2次，95%、96%、80%、70%乙醇各1次，每次1min)脱二甲苯，自来水浸洗5min，稍干，加AO染色A液(配方：1%tritonX100，0.08mol/LHCl,0.15mol/LNaCl)3～4滴于切片上，4℃冰箱30s，再加AOB液(配方：0.2mol/LNa2HPO463mL,0.1mol/L柠檬酸钠37mL，0.15mol/LNaCl,10-3mol/LEDTA,AO6μg/mL)8～10滴，4℃冰箱10min，弃去A、B液，自来水浸洗3次，每次3～5min，风干，于标本处加PBS(0.01mol/L,pH7.4)或蒸馏水1滴，加盖玻片，无色指甲油在盖玻片周围封固，-10℃冰箱保存备用，3d内使用，最好即染即测。
(四)应用粘附式细胞仪分析细胞DNA：AO染色标本置载物台，调光轴焦距，细胞清晰显示于荧光屏，用492nm可见光激发AO，PMT1接收并显示530nm荧光，其强度与细胞内DNA含量成正相关[1]，计算机自动显示荧光图像，调节扫描参数，获最大信号和最低漂白。扫描参数：检测器1灵敏度37%，检测器2灵敏度60%，扫描步径0.5μm，扫描强度10%，载物台移动速度6mm/s，激光功率100mW，每点采样次数16，小孔孔径225μm，Y轴扫描点360，Z轴扫描点360。对所存视野逐个扫描，储存图像，用Analysis菜单中Histogram程序对所存图像逐个分析，储存。具体操作：去背景1000，面积定为20～1000μm2，采用筛选系统Mark或Circle或Cut程序，对所有图像进行逐层分析，由基底层、棘层、颗粒层至角质层，分层统计并储存，求得DNA综合荧光值、荧光密度、面积。选择较好图像显微照相记录。每个样品测试参数相同，每层及总数细胞的各项参数累加，求出平均值±标准差(x±s)，记录与储存，并作方差分析。
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结果
1.正常表皮各层细胞DNA荧光扫描图观察：见图1，显示表皮真皮层次清楚，真皮细胞稀疏，表皮呈典型复层，与HE染色组织学层次一致。①基底层：核规则排列呈栅状，长椭圆形，长轴与表面垂直，中央最强；②棘层：在基底层上，核圆或椭圆形，中间强，至上层呈环状，似圆饼，中间淡，周边强；③颗粒层：在角质层下1～2层，核大部分无中央明亮区，呈环状，部分呈带状；④角质层：呈片状，无成形核，下层较淡，上层极淡，去背景大部分消失。
图1 正常表皮各层细胞DNA荧光扫描图
2.正常表皮组织学各层细胞DNA荧光定量分析：结果见表1。
表1 正常人表皮各层细胞DNA荧光定量比较(
±s)
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表皮各层细胞
细胞数(个)
综合荧光值(任意单位)
荧光密度(任意单位/μm2)
面积(μm2)
基底层
448
142219±86766.0
2081.38±706.78
66±28.90
棘层
504
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268053±153104
2550.48±729.54
104.14±53.81
颗粒层
270
162342±95919.1
2122.14±600.34
76.33±40.73
角质层
66
143697±115188
2010.41±965.07
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68.28±35.02
合计
1288
195753±133368
2269.85±745.05
83.21±46.12
经统计学处理，综合荧光值、荧光密度、面积3个指标表皮各层间两两比较，仅棘层分别与基底层、颗粒层、角质层两两间差异有显著性(P>0.05)，即正常人棘层细胞DNA综合荧光值、荧光密度、面积较其余各层均高，其余各层无统计学差异。综合荧光值均数：棘层是基底层的188%，颗粒层的165%，角质层的187%；荧光密度均数：棘层是基底层的123%，颗粒层的120%，角质层的127%；面积均数：棘层是基底层的158%，颗粒层的136%，角质层的153%。
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讨论
正常人表皮细胞在向表面移行时逐渐丧失增殖能力并分化，产生终末分化的角质细胞。我们的定性与定量结果均证实：在此过程中细胞DNA含量发生了相应的变化。从定性的资料看，表皮真皮及表皮各层均表现各自特点，易区分，这是分层分析的基础。在照片上，由基底层向表面移行，DNA荧光渐减；至颗粒层，中心淡周边强，为DNA边集所致；至角质下层，则更淡，呈片状，是核膜破裂，DNA弥散分布的结果；而角质上层荧光极淡，几乎测不到，提示正常表皮DNA降解的部位在角质层。
从定量比较的结果看，棘层细胞DNA含量、浓度(或密度)、DNA分布范围均最高，其余各层无差异。只有增殖时细胞DNA含量、浓度、体积才会增加，因此，结果提示棘层是表皮细胞DNA合成、增殖最旺盛的部位；而基底层反而增殖不明显，DNA合成不显著。尽管在体外培养时基底细胞增殖最强，但在原位状态下增殖受到了明显的抑制(如接触抑制、表皮抑素等)，往往根据表面脱落状态与表皮厚度来调节其增殖速度。Csorgo等[2]证实正常表皮基底细胞95.5%处于静止期，仅4.5%处于细胞周期中，而基底上层增殖细胞核抗原(PCNA)均阳性，均处于细胞周期中，短时高度增殖。这些结果支持我们的结论，但是定性资料并不支持，可能是定性资料更粗糙。然而，颗粒层细胞DNA含量、浓度及分布范围与基底层处于相同水平，DNA并不降解，可能仅仅发生了变性，定性的资料证实了这一点[3]。定量结果表明，角质层DNA荧光变化与基底层、颗粒层无差异。由于所测结果为角质下层，而角质上层DNA荧光往往测不出，因而结果可揭示DNA降解部位在角质下层与上层之间。该结论与McCall等[4]研究结果不一致，有待进一步证实。
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参考文献
1宋平根，李素文.流式细胞术的原理和应用.第1版.北京：北京师范大学出版社，1992，60：121-126.
2 Csorgo BZ, Hammerberg C, Voorhee JJ, et al. Flow cytometric identification of proliferative subpopulations within normal human epidermis and the localization of the primary hyperproliferative population in psoriasis. J Exp Med, 1993,178:1271- 1281.
3 Kurose K, Sakihama H, Mori O, et al. Microfluorometric study of nuclear DNA in normal human epidermis. Acta Histochem, 1996,98:39- 46.
4 McCall CA, Cohen JJ. Programmed cell death in terminally differentiating keratinocytes: role of endogenous endonuclease. J Invest Dermatol, 1991,97:111- 114.
收稿：1998-06-15修回：1998-09-04, http://www.100md.com
单位：510282广州，第一军医大学珠江医院
关键词：表皮DNA
中华皮肤科杂志990410
【摘要】目的 探讨正常人表皮细胞在增殖与终末分化中DNA的变化。方法 通过粘附式细胞仪用吖啶橙染色10例正常人皮肤组织切片，测表皮各层细胞DNA综合荧光值、荧光密度、面积。结果 正常表皮细胞DNA综合荧光值、荧光密度、面积，棘层较其他各层均高(P<0.01),其余各层差异无显著性(P>0.05)；角质下层仍存在DNA荧光，角质上层DNA荧光极淡。结论 正常人表皮细胞DNA含量、浓度、分布范围以棘层最高，DNA合成最旺盛的部位在棘层，基底细胞DNA合成受到抑制，颗粒层细胞DNA不降解，可能仅发生了变性，而DNA降解的部位在角质层。
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Changes of DNA Content of Normal Epidermal Cells During Proliferation
and Terminal Differentiation
MAO Zuhao, LIANG Yinquan, BAO Yongyao, et al
. Zhu-Jiang Hospital， First Military Medical University, Guangzhou 510282
【Abstract】 Objective To explore the changes of DNA content of normal epidermal cells during proliferation and terminal differentiation. Methods DNA content of human epidermal cells in each layer from normal human skin (10 cases) was determined with adherent cell analysis and sorting cytometer (ACAS570).The tissue sections with 10μ m thick were stained with acridine orange (AO), and evaluated by DNA integrated fluorescence value (IV), average fluorescence value (AV), and scanning area (A) of epidermal cells in each layer with ACAS570. Results The results showed that IV,AV, or A were higher in spinous cells than those in cells of other layers(P<0.01), but there was no difference in cells of the other layers (P> 0.05). DNA fluorescence was still present in the lower horny layers, and almost disappeared in the upper horny layers. Conclusion The results suggest that total level of DNA content, density or area of distribution are higher or larger in cells of the spinous layer than those of the other layers. These data demonstrate that the high-level DNA synthesis takes place in the spinous layer, inhibited in the basal cells, not degraded in the granular layer where DNA may be degenerated, and degraded in the horny layer.
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【Key words】 Epidermis DNA
正常表皮从基底层至角质层，是细胞增殖、终末分化的连续过程，在形态学上主要表现为核的分裂、分化、退化至消失，呈现形态与分化状态不同的几个阶段。至今，对于表皮细胞在增殖、终末分化过程中DNA的量变规律认识不多。我们应用粘附式细胞仪(ACAS570)，对表皮各层细胞DNA含量、浓度、分布范围等作了初步的研究，试图揭示正常表皮细胞在增殖、终末分化各阶段中DNA的变化规律。
材料和方法
(一)临床资料：10份皮肤标本取自正常的健康人，均为男性，年龄16～52岁。取材部位：6例包皮，3例足背，1例足底。标本的组织学检查未见异常。
(二)方法：常规手术切取长棱形皮肤至皮下，0.5cm×1cm，厚约3～5mm。固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。病理切片：每个标本切取5μm、10μm切片各1张。HE染色：病理诊断为正常者再行吖啶橙(AO)染色。
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(三)AO标记细胞DNA：取10μm切片，二甲苯脱蜡2次，各10min，系列乙醇(无水乙醇2次，95%、96%、80%、70%乙醇各1次，每次1min)脱二甲苯，自来水浸洗5min，稍干，加AO染色A液(配方：1%tritonX100，0.08mol/LHCl,0.15mol/LNaCl)3～4滴于切片上，4℃冰箱30s，再加AOB液(配方：0.2mol/LNa2HPO463mL,0.1mol/L柠檬酸钠37mL，0.15mol/LNaCl,10-3mol/LEDTA,AO6μg/mL)8～10滴，4℃冰箱10min，弃去A、B液，自来水浸洗3次，每次3～5min，风干，于标本处加PBS(0.01mol/L,pH7.4)或蒸馏水1滴，加盖玻片，无色指甲油在盖玻片周围封固，-10℃冰箱保存备用，3d内使用，最好即染即测。
(四)应用粘附式细胞仪分析细胞DNA：AO染色标本置载物台，调光轴焦距，细胞清晰显示于荧光屏，用492nm可见光激发AO，PMT1接收并显示530nm荧光，其强度与细胞内DNA含量成正相关[1]，计算机自动显示荧光图像，调节扫描参数，获最大信号和最低漂白。扫描参数：检测器1灵敏度37%，检测器2灵敏度60%，扫描步径0.5μm，扫描强度10%，载物台移动速度6mm/s，激光功率100mW，每点采样次数16，小孔孔径225μm，Y轴扫描点360，Z轴扫描点360。对所存视野逐个扫描，储存图像，用Analysis菜单中Histogram程序对所存图像逐个分析，储存。具体操作：去背景1000，面积定为20～1000μm2，采用筛选系统Mark或Circle或Cut程序，对所有图像进行逐层分析，由基底层、棘层、颗粒层至角质层，分层统计并储存，求得DNA综合荧光值、荧光密度、面积。选择较好图像显微照相记录。每个样品测试参数相同，每层及总数细胞的各项参数累加，求出平均值±标准差(x±s)，记录与储存，并作方差分析。
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结果
1.正常表皮各层细胞DNA荧光扫描图观察：见图1，显示表皮真皮层次清楚，真皮细胞稀疏，表皮呈典型复层，与HE染色组织学层次一致。①基底层：核规则排列呈栅状，长椭圆形，长轴与表面垂直，中央最强；②棘层：在基底层上，核圆或椭圆形，中间强，至上层呈环状，似圆饼，中间淡，周边强；③颗粒层：在角质层下1～2层，核大部分无中央明亮区，呈环状，部分呈带状；④角质层：呈片状，无成形核，下层较淡，上层极淡，去背景大部分消失。
图1 正常表皮各层细胞DNA荧光扫描图
2.正常表皮组织学各层细胞DNA荧光定量分析：结果见表1。
表1 正常人表皮各层细胞DNA荧光定量比较(
±s), 百拇医药
表皮各层细胞
细胞数(个)
综合荧光值(任意单位)
荧光密度(任意单位/μm2)
面积(μm2)
基底层
448
142219±86766.0
2081.38±706.78
66±28.90
棘层
504
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268053±153104
2550.48±729.54
104.14±53.81
颗粒层
270
162342±95919.1
2122.14±600.34
76.33±40.73
角质层
66
143697±115188
2010.41±965.07
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68.28±35.02
合计
1288
195753±133368
2269.85±745.05
83.21±46.12
经统计学处理，综合荧光值、荧光密度、面积3个指标表皮各层间两两比较，仅棘层分别与基底层、颗粒层、角质层两两间差异有显著性(P>0.05)，即正常人棘层细胞DNA综合荧光值、荧光密度、面积较其余各层均高，其余各层无统计学差异。综合荧光值均数：棘层是基底层的188%，颗粒层的165%，角质层的187%；荧光密度均数：棘层是基底层的123%，颗粒层的120%，角质层的127%；面积均数：棘层是基底层的158%，颗粒层的136%，角质层的153%。
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讨论
正常人表皮细胞在向表面移行时逐渐丧失增殖能力并分化，产生终末分化的角质细胞。我们的定性与定量结果均证实：在此过程中细胞DNA含量发生了相应的变化。从定性的资料看，表皮真皮及表皮各层均表现各自特点，易区分，这是分层分析的基础。在照片上，由基底层向表面移行，DNA荧光渐减；至颗粒层，中心淡周边强，为DNA边集所致；至角质下层，则更淡，呈片状，是核膜破裂，DNA弥散分布的结果；而角质上层荧光极淡，几乎测不到，提示正常表皮DNA降解的部位在角质层。
从定量比较的结果看，棘层细胞DNA含量、浓度(或密度)、DNA分布范围均最高，其余各层无差异。只有增殖时细胞DNA含量、浓度、体积才会增加，因此，结果提示棘层是表皮细胞DNA合成、增殖最旺盛的部位；而基底层反而增殖不明显，DNA合成不显著。尽管在体外培养时基底细胞增殖最强，但在原位状态下增殖受到了明显的抑制(如接触抑制、表皮抑素等)，往往根据表面脱落状态与表皮厚度来调节其增殖速度。Csorgo等[2]证实正常表皮基底细胞95.5%处于静止期，仅4.5%处于细胞周期中，而基底上层增殖细胞核抗原(PCNA)均阳性，均处于细胞周期中，短时高度增殖。这些结果支持我们的结论，但是定性资料并不支持，可能是定性资料更粗糙。然而，颗粒层细胞DNA含量、浓度及分布范围与基底层处于相同水平，DNA并不降解，可能仅仅发生了变性，定性的资料证实了这一点[3]。定量结果表明，角质层DNA荧光变化与基底层、颗粒层无差异。由于所测结果为角质下层，而角质上层DNA荧光往往测不出，因而结果可揭示DNA降解部位在角质下层与上层之间。该结论与McCall等[4]研究结果不一致，有待进一步证实。
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参考文献
1宋平根，李素文.流式细胞术的原理和应用.第1版.北京：北京师范大学出版社，1992，60：121-126.
2 Csorgo BZ, Hammerberg C, Voorhee JJ, et al. Flow cytometric identification of proliferative subpopulations within normal human epidermis and the localization of the primary hyperproliferative population in psoriasis. J Exp Med, 1993,178:1271- 1281.
3 Kurose K, Sakihama H, Mori O, et al. Microfluorometric study of nuclear DNA in normal human epidermis. Acta Histochem, 1996,98:39- 46.
4 McCall CA, Cohen JJ. Programmed cell death in terminally differentiating keratinocytes: role of endogenous endonuclease. J Invest Dermatol, 1991,97:111- 114.
收稿：1998-06-15修回：1998-09-04, http://www.100md.com