广州地区淋球菌血清学和营养分型研究
作者：郑和平 潘慧清 黄进梅 曾维英 吴兴中 刘仲秋
单位：510500广州，广东省皮肤病防治研究所
关键词：奈瑟氏球菌；淋病血清分型营养
中华皮肤科杂志000305
【摘要】目的确定广州地区淋球菌血清型和营养型流行特点。方法采用乳胶凝集法对131株淋球菌进行血清学分型和LaScolea法分析108株淋球菌营养型。结果血清学分型以WⅡ/WⅢ为主，占87.8%(115/131),WⅠ型仅为9.9%(13/131)；营养型则以Proto、Proˉ和ILeˉ3种营养型为主，分别占42.6%、21.3%和12.0%；另外WⅠ仅见于Proto和Proˉ营养型，WⅡ/WⅢ可见于所有营养型。结论血清型WⅡ/WⅢ的优势群和营养型中ILeˉ型明显高于其它省份是广州地区淋球菌流行的两大特点。
, 百拇医药
Study on Serotypes and Auxotypes of Neisseria Gonorrhoeae in Guangzhou
ZHENG Heping
(Guangdong Institute of Dermatology， Guangzhou 510500)
PAN Huiqing
(Guangdong Institute of Dermatology， Guangzhou 510500)
HUANG Jinmei
(Guangdong Institute of Dermatology， Guangzhou 510500)
, 百拇医药
【 Abstract】 Objective To investigate the serotype and auxotype distributions of Neisseria gonorrhoeae in Guangzhou.Method One hundred and thirty one strains of Neisseria gonorrhoeae were serotyped by co- agglutination test and 108 strains were auxotyped by La Scolea′ s method.Results Out of 131 strains of Neisseria gonorrhoeae, 87.8% (115/131) wereWⅡ /WⅢ , while 9.9% (13/131) were WI. The predominant auxotypes were Proto, Proˉ and ILeˉ , accounting for 42.6% (46/108), 21.3% (23/108) and 12.0% ,respectively. WⅡ /WⅢ was found in all auxotypes whereas WI only in Proto and Proˉ auxotypes.Conclusion The study illustrates the prevailing serotype of WⅡ /WⅢ , and the prevalence of ILeˉ in Guangzhou.
, 百拇医药
【 Key words】 Neisseria gonorrhoeae Serotyping Nutrition
淋病是我国常见的性传播疾病之一。近年来，随着产β-内酰胺酶(PPNG)和高度耐四环素(TRNG)等耐药菌株的逐渐增多，给淋病的防治带来困难[1]。为此，许多学者对淋球菌的抗生素敏感谱、质粒图谱、血清学分型和营养分型等分子流行病学指标进行了研究；我们收集了广州地区131株淋球菌，对其进行了血清学和营养分型，以分析本地区淋球菌的流行特点。
材料与方法
(一)菌株来源：1996年3月至1997年5月间从我所性病门诊分离得到131株淋球菌，所有菌株经革兰染色、氧化酶、糖发酵等试验鉴定后，液氮保存备用。
(二)标准菌株：5株标准菌株由中国医学科学院皮肤病研究所提供，包括CDC90(WⅠ、Met-)、CDC27(WⅡ、Proto)、CDC67(Arg-)、CDC89(Pro-)和CDC91(AHU-)。
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(三)血清学分型：
1.试剂：淋球菌单克隆抗体PhadebactMonoclonalGCTest试剂由瑞典PharmaciaDiagnosticsAB公司生产，批号10-6419-12。
2.分型方法：将18～24h淋球菌培养物制备成菌悬液，100℃水浴加热10min后，分别与WⅠ和WⅡ/WⅢ型试剂进行乳胶凝集试验，每批试验均以标准菌株作对照试验。
(四)营养分型：
1.分型培养基：按文献[2]介绍方法制备。完整淋球菌培养基GGM(gonococcalgeneticmedium)含有谷氨酸、精氨酸(Arg)、蛋氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、天冬氨酸、丝氨酸(Ser)、异亮氨酸(ILe)、胱氨酸和半胱氨酸8种氨基酸、次黄嘌呤(Hyx)和尿嘧啶(Ura)2种碱基，以及琼脂、可溶性淀粉、维生素和辅酶等。非完整GGM培养基(营养分型培养基)：完整GGM培养基缺少上述某一氨基酸或碱基。
, 百拇医药
2.分型方法：复活冻存菌株，于GC培养基传代后，取18～24h培养物制备成菌悬液，分别接种于完整GGM平板和各分型平板，5%CO2环境下37℃培养24h后，观察结果。根据菌株在不同培养基上的生长情况判读其营养型，在所有营养分型培养基上均生长者为Proto(原型),在某一分型培养基上不生长者记为Uraˉ(尿嘧啶)、Proˉ(脯氨酸)、AHUˉ(精氨酸、次黄嘌呤和尿嘧啶)等。每批试验均以CDC标准菌株进行质量控制。
结果
(一)血清学分型：131株淋球菌进行了单克隆抗体分型，其中13株(9.9%)属WⅠ型，115株(87.8%)属WⅡ/WⅢ型，3株(2.2%)与WⅠ和WⅡ/WⅢ均发生凝集反应。
(二)营养分型：共检测112株淋球菌，结果108株菌(96.4%)能在完整GGM培养基上生长，4株菌(3.6%)未能生长。所有生长菌株中，以Proto、Proˉ和ILeˉ3种营养型为主，分别占42.6%、21.3%和12.0%，其它型合计占24.1%。结果见表1。
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表1 108株淋球菌营养型分析结果
营养型 菌株数(%) WⅠ WⅡ/WⅢ Proto 46(42.6) 10 36 Pro- 23(21.3) 3 20 ILe- 13(12.0) - 13 Met-,Pro- 6(5.6) - 6 Pro-,ILe- 6(5.6) - 6 Ser-,Pro- 5(4.6) - 5 Arg-,Pro- 3(2.8) - 3 PAU- 2(1.9) - 2 Met- 2(1.9) - 2 Ser- 1(0.9) - 1 Arg-,ILe- 1(0.9) - 1 合 计 108 13 95 讨 论
血清学分型主要依据淋球菌外膜蛋白Ⅰ(PⅠ)，常用的有W分群和血清变异型(serovar)。前者利用乳胶凝集试验将淋球菌分成WⅠ、WⅡ和WⅢ群；后者使用6种抗PIA和6种抗PIB单抗将淋球菌分成不同的血清变异型。叶顺章等[3]1992年报道54株菌的W分型。本试验检测了广州地区1996～1997年131株淋球菌的W血清型分布情况，结果WⅠ占9.9%(13/131)，WⅡ/WⅢ占87.8%(115/131)，与南京地区的42.6%WⅠ和44.4%WⅡ/WⅢ有显著的区别，表明不同时间、不同地区淋球菌具有明显的流行特点。广州地区已形成WⅡ/WⅢ优势群，与香港Kam等报道基本一致[4]。Kam等[4]研究发现随着近年来喹诺酮耐药株的增加，由于选择淘汰作用，IA菌株大大减少，而IB菌株则不同程度的存活下来。值得注意的是该研究中42.3%(29/69)菌株可能为大陆南方省份感染株，且我们以前的报道[1]也证明广州地区存在高比率(17.5%)环丙沙星耐药株。由此可以推测WⅡ/WⅢ菌株的流行可能与喹诺酮类抗生素耐药性有关。
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不同的营养型与地区分布或特定的临床类型有关，如AHU型多引起播散性淋球菌感染(DGI)。据报道该型菌株占美国西雅图DGI菌株的89%，而在菲律宾和台湾地区尚未检出该型，以Protoˉ及Proˉ型占优势[5]。我们用LaScolea营养分型法测定发现广州地区以Proto和Proˉ型为主，与国内其它报告基本一致[6,7]，但ILeˉ型12.0%的流行率明显高于其它省份，且未检出AHUˉ型菌株。结果提示广州地区淋球菌流行的营养型有形成独特优势型的趋势，应引起重视。
双重分类法(A/S)将营养型和血清型结合，可克服两者的缺点，更有助于说明淋球菌的流行特点。Knapp等[8]对来自北、中、南美和欧、澳、非三洲的1400多株菌进行分析，得出107个A/S型，发现地区间存在差异，但不同地区的AHUˉ型菌株均属于AHUˉ/IA-1,2A/S型，研究指出这种分布可能系一个克隆扩散所至。我国尚未见A/S分型报告。我们依据WⅠ等于PIA型，WⅡ/WⅢ等于PIB型，将108株淋球菌双重分型，结果PIA仅见于Proto和Proˉ，而PIB可见于各营养型，其中以Proto/PIB和Proˉ/PIB为主(表1)，具有明显的流行特点。
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血清学分型是利用抗原抗体反应，具有较高的特异性。试验时应用纯培养物，并将菌悬液煮沸5min，一方面可以灭菌防治传染性，一方面可提高试验的敏感性。结果观察应在1min内完成，否则引起假阳性。关于营养分型方法有多种报道。LaScolea法较简单适用，选用8种氨基酸、2种碱基、维生素、无机盐和辅酶等成份，并认为可进一步简化。我们的结果显示单一谷氨酸和天冬氨酸为非必需氨基酸，故可将其省略。鉴于淋球菌在我国流行较为广泛，我们认为应根据我国流行淋球菌特点，尽快制定一套标准营养分型方法，分析、确定和比较不同地区淋球菌的流行模式，为制定流行病学控制措施提供可靠的依据。
广东省卫生厅资助课题
参 考 文 献
1，郑和平，刘仲秋，张木有,等.5种抗菌剂对淋病奈瑟氏菌的抑菌效果研究.中国抗生素杂志,1998，23:377-379.
, 百拇医药 2，La Scolea CJ, Young FE. Development of a defined minimal medium for growth of Neisseria gonorrhoeae. Appl Microbiol, 1974,28:70- 76.
3，叶顺章，熊化保.54株淋球菌的血清学分型研究.中华皮肤科杂志,1992，25：235-236.
4，Kam KM, Abmm MB, Wong PW, et al. Quinolone resistant Neisseria gonorrhoeae in Hong Kong. Sex Transm Dis, 1996,23:103- 108.
5，Knapp JS, Holmes KK: Disseminated gonococcal infections caused by Neisseria gonorrhoeae with unique nutritional requirements. J Infect Dis, 1975,132:204- 208.
, http://www.100md.com
6，叶顺章，王千秋，张传福,等.淋球菌营养分型方法的建立和72株淋球菌的分型结果.中华皮肤科杂志,1983，26:139-141.
7，周丽萍，张丽芳，包其郁,等.58株淋病奈瑟菌的营养分型.中华流行病学杂志,1992,13(特刊2)：54-56.
8，Knapp JS, Tam MR, Nowinski RC et al: Serological classification of Neisseria gonorrhoeae with use of monoclonal antibodies to gonococcal outer membrane protein I. J Infect Dis, 1984,150:44- 48.
(收 稿 日 期 ： 1999- 01- 05), http://www.100md.com
单位：510500广州，广东省皮肤病防治研究所
关键词：奈瑟氏球菌；淋病血清分型营养
中华皮肤科杂志000305
【摘要】目的确定广州地区淋球菌血清型和营养型流行特点。方法采用乳胶凝集法对131株淋球菌进行血清学分型和LaScolea法分析108株淋球菌营养型。结果血清学分型以WⅡ/WⅢ为主，占87.8%(115/131),WⅠ型仅为9.9%(13/131)；营养型则以Proto、Proˉ和ILeˉ3种营养型为主，分别占42.6%、21.3%和12.0%；另外WⅠ仅见于Proto和Proˉ营养型，WⅡ/WⅢ可见于所有营养型。结论血清型WⅡ/WⅢ的优势群和营养型中ILeˉ型明显高于其它省份是广州地区淋球菌流行的两大特点。
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Study on Serotypes and Auxotypes of Neisseria Gonorrhoeae in Guangzhou
ZHENG Heping
(Guangdong Institute of Dermatology， Guangzhou 510500)
PAN Huiqing
(Guangdong Institute of Dermatology， Guangzhou 510500)
HUANG Jinmei
(Guangdong Institute of Dermatology， Guangzhou 510500)
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【 Abstract】 Objective To investigate the serotype and auxotype distributions of Neisseria gonorrhoeae in Guangzhou.Method One hundred and thirty one strains of Neisseria gonorrhoeae were serotyped by co- agglutination test and 108 strains were auxotyped by La Scolea′ s method.Results Out of 131 strains of Neisseria gonorrhoeae, 87.8% (115/131) wereWⅡ /WⅢ , while 9.9% (13/131) were WI. The predominant auxotypes were Proto, Proˉ and ILeˉ , accounting for 42.6% (46/108), 21.3% (23/108) and 12.0% ,respectively. WⅡ /WⅢ was found in all auxotypes whereas WI only in Proto and Proˉ auxotypes.Conclusion The study illustrates the prevailing serotype of WⅡ /WⅢ , and the prevalence of ILeˉ in Guangzhou.
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【 Key words】 Neisseria gonorrhoeae Serotyping Nutrition
淋病是我国常见的性传播疾病之一。近年来，随着产β-内酰胺酶(PPNG)和高度耐四环素(TRNG)等耐药菌株的逐渐增多，给淋病的防治带来困难[1]。为此，许多学者对淋球菌的抗生素敏感谱、质粒图谱、血清学分型和营养分型等分子流行病学指标进行了研究；我们收集了广州地区131株淋球菌，对其进行了血清学和营养分型，以分析本地区淋球菌的流行特点。
材料与方法
(一)菌株来源：1996年3月至1997年5月间从我所性病门诊分离得到131株淋球菌，所有菌株经革兰染色、氧化酶、糖发酵等试验鉴定后，液氮保存备用。
(二)标准菌株：5株标准菌株由中国医学科学院皮肤病研究所提供，包括CDC90(WⅠ、Met-)、CDC27(WⅡ、Proto)、CDC67(Arg-)、CDC89(Pro-)和CDC91(AHU-)。
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(三)血清学分型：
1.试剂：淋球菌单克隆抗体PhadebactMonoclonalGCTest试剂由瑞典PharmaciaDiagnosticsAB公司生产，批号10-6419-12。
2.分型方法：将18～24h淋球菌培养物制备成菌悬液，100℃水浴加热10min后，分别与WⅠ和WⅡ/WⅢ型试剂进行乳胶凝集试验，每批试验均以标准菌株作对照试验。
(四)营养分型：
1.分型培养基：按文献[2]介绍方法制备。完整淋球菌培养基GGM(gonococcalgeneticmedium)含有谷氨酸、精氨酸(Arg)、蛋氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、天冬氨酸、丝氨酸(Ser)、异亮氨酸(ILe)、胱氨酸和半胱氨酸8种氨基酸、次黄嘌呤(Hyx)和尿嘧啶(Ura)2种碱基，以及琼脂、可溶性淀粉、维生素和辅酶等。非完整GGM培养基(营养分型培养基)：完整GGM培养基缺少上述某一氨基酸或碱基。
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2.分型方法：复活冻存菌株，于GC培养基传代后，取18～24h培养物制备成菌悬液，分别接种于完整GGM平板和各分型平板，5%CO2环境下37℃培养24h后，观察结果。根据菌株在不同培养基上的生长情况判读其营养型，在所有营养分型培养基上均生长者为Proto(原型),在某一分型培养基上不生长者记为Uraˉ(尿嘧啶)、Proˉ(脯氨酸)、AHUˉ(精氨酸、次黄嘌呤和尿嘧啶)等。每批试验均以CDC标准菌株进行质量控制。
结果
(一)血清学分型：131株淋球菌进行了单克隆抗体分型，其中13株(9.9%)属WⅠ型，115株(87.8%)属WⅡ/WⅢ型，3株(2.2%)与WⅠ和WⅡ/WⅢ均发生凝集反应。
(二)营养分型：共检测112株淋球菌，结果108株菌(96.4%)能在完整GGM培养基上生长，4株菌(3.6%)未能生长。所有生长菌株中，以Proto、Proˉ和ILeˉ3种营养型为主，分别占42.6%、21.3%和12.0%，其它型合计占24.1%。结果见表1。
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表1 108株淋球菌营养型分析结果
营养型 菌株数(%) WⅠ WⅡ/WⅢ Proto 46(42.6) 10 36 Pro- 23(21.3) 3 20 ILe- 13(12.0) - 13 Met-,Pro- 6(5.6) - 6 Pro-,ILe- 6(5.6) - 6 Ser-,Pro- 5(4.6) - 5 Arg-,Pro- 3(2.8) - 3 PAU- 2(1.9) - 2 Met- 2(1.9) - 2 Ser- 1(0.9) - 1 Arg-,ILe- 1(0.9) - 1 合 计 108 13 95 讨 论
血清学分型主要依据淋球菌外膜蛋白Ⅰ(PⅠ)，常用的有W分群和血清变异型(serovar)。前者利用乳胶凝集试验将淋球菌分成WⅠ、WⅡ和WⅢ群；后者使用6种抗PIA和6种抗PIB单抗将淋球菌分成不同的血清变异型。叶顺章等[3]1992年报道54株菌的W分型。本试验检测了广州地区1996～1997年131株淋球菌的W血清型分布情况，结果WⅠ占9.9%(13/131)，WⅡ/WⅢ占87.8%(115/131)，与南京地区的42.6%WⅠ和44.4%WⅡ/WⅢ有显著的区别，表明不同时间、不同地区淋球菌具有明显的流行特点。广州地区已形成WⅡ/WⅢ优势群，与香港Kam等报道基本一致[4]。Kam等[4]研究发现随着近年来喹诺酮耐药株的增加，由于选择淘汰作用，IA菌株大大减少，而IB菌株则不同程度的存活下来。值得注意的是该研究中42.3%(29/69)菌株可能为大陆南方省份感染株，且我们以前的报道[1]也证明广州地区存在高比率(17.5%)环丙沙星耐药株。由此可以推测WⅡ/WⅢ菌株的流行可能与喹诺酮类抗生素耐药性有关。
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不同的营养型与地区分布或特定的临床类型有关，如AHU型多引起播散性淋球菌感染(DGI)。据报道该型菌株占美国西雅图DGI菌株的89%，而在菲律宾和台湾地区尚未检出该型，以Protoˉ及Proˉ型占优势[5]。我们用LaScolea营养分型法测定发现广州地区以Proto和Proˉ型为主，与国内其它报告基本一致[6,7]，但ILeˉ型12.0%的流行率明显高于其它省份，且未检出AHUˉ型菌株。结果提示广州地区淋球菌流行的营养型有形成独特优势型的趋势，应引起重视。
双重分类法(A/S)将营养型和血清型结合，可克服两者的缺点，更有助于说明淋球菌的流行特点。Knapp等[8]对来自北、中、南美和欧、澳、非三洲的1400多株菌进行分析，得出107个A/S型，发现地区间存在差异，但不同地区的AHUˉ型菌株均属于AHUˉ/IA-1,2A/S型，研究指出这种分布可能系一个克隆扩散所至。我国尚未见A/S分型报告。我们依据WⅠ等于PIA型，WⅡ/WⅢ等于PIB型，将108株淋球菌双重分型，结果PIA仅见于Proto和Proˉ，而PIB可见于各营养型，其中以Proto/PIB和Proˉ/PIB为主(表1)，具有明显的流行特点。
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血清学分型是利用抗原抗体反应，具有较高的特异性。试验时应用纯培养物，并将菌悬液煮沸5min，一方面可以灭菌防治传染性，一方面可提高试验的敏感性。结果观察应在1min内完成，否则引起假阳性。关于营养分型方法有多种报道。LaScolea法较简单适用，选用8种氨基酸、2种碱基、维生素、无机盐和辅酶等成份，并认为可进一步简化。我们的结果显示单一谷氨酸和天冬氨酸为非必需氨基酸，故可将其省略。鉴于淋球菌在我国流行较为广泛，我们认为应根据我国流行淋球菌特点，尽快制定一套标准营养分型方法，分析、确定和比较不同地区淋球菌的流行模式，为制定流行病学控制措施提供可靠的依据。
广东省卫生厅资助课题
参 考 文 献
1，郑和平，刘仲秋，张木有,等.5种抗菌剂对淋病奈瑟氏菌的抑菌效果研究.中国抗生素杂志,1998，23:377-379.
, 百拇医药 2，La Scolea CJ, Young FE. Development of a defined minimal medium for growth of Neisseria gonorrhoeae. Appl Microbiol, 1974,28:70- 76.
3，叶顺章，熊化保.54株淋球菌的血清学分型研究.中华皮肤科杂志,1992，25：235-236.
4，Kam KM, Abmm MB, Wong PW, et al. Quinolone resistant Neisseria gonorrhoeae in Hong Kong. Sex Transm Dis, 1996,23:103- 108.
5，Knapp JS, Holmes KK: Disseminated gonococcal infections caused by Neisseria gonorrhoeae with unique nutritional requirements. J Infect Dis, 1975,132:204- 208.
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6，叶顺章，王千秋，张传福,等.淋球菌营养分型方法的建立和72株淋球菌的分型结果.中华皮肤科杂志,1983，26:139-141.
7，周丽萍，张丽芳，包其郁,等.58株淋病奈瑟菌的营养分型.中华流行病学杂志,1992,13(特刊2)：54-56.
8，Knapp JS, Tam MR, Nowinski RC et al: Serological classification of Neisseria gonorrhoeae with use of monoclonal antibodies to gonococcal outer membrane protein I. J Infect Dis, 1984,150:44- 48.
(收 稿 日 期 ： 1999- 01- 05), http://www.100md.com