125I标记碱性成纤维细胞生长因子豚鼠腹腔注入耳蜗放射免疫测定和放射自显影观察
作者：翟所强 陈泮藻 杨伟炎 姜泗长
单位：翟所强(北京 解放军总医院耳鼻咽喉科研究所 100853)；杨伟炎(北京 解放军总医院耳鼻咽喉科研究所 100853)；姜泗长(北京 解放军总医院耳鼻咽喉科研究所 100853)；陈泮藻(基础所生化室)
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000121 实验证实碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)对离体听神经元存活与轴突再生有直接营养作用[1]，耳蜗内灌注bFGF对爆震性听力损伤的修复有促进作用[2]。临床给药途径多为肌肉或静脉注射。我们用125I标记bFGF，探讨bFGF在豚鼠体内主要脏器分布，观察bFGF通过血迷路屏障的可能性，为临床合理用药提供理论参考。
, 百拇医药 一、材料和方法
1.试剂、仪器及标记方法：bFGF相对分子质量17000，含有154氨基酸，质量浓度为1 g/L，E.Coli表达；抗人bFGF兔血清(bFGF-Ab)购自美国Pepro Tech.EC 公司，经氯胺T氧化碘化标记法，125I Na标记bFGF，用抗人bFGF-Ab和琼脂糖双扩散自显影技术鉴定125I-bFGF标记品质量。
2.动物处理及样本采集和测定法：豚鼠22只分为3组：125I标记bFGF腹腔注入组(简称125I-bFGF组)10只；125I Na腹腔注入组(简称125I组)6只；生理盐水腹腔注入组(简称生理盐水组)6只。全部动物腹腔注入1%碘化钾0.5 ml，30 min后125I-bFGF组注入125I标记bFGF(100 μL原液加400 μL 生理盐水混合)0.5 ml；125I组腹腔注入125I Na 0.5 ml；生理盐水组注入生理盐水 0.5 ml，2 h后，1% 戊巴比妥钠40 mg/kg体重麻醉动物，心内抽血，取脑、甲状腺、肝、肾、心、双耳蜗去骨壳暴露部分膜迷路。样品在光电天平上称重后，在HH 6003型γ放射免疫分析仪中测定放射性强度，每个样品测1 min，得出样品的每分钟计数率。
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3 .耳蜗标本放射自显影：耳蜗标本测定放射性强度后，标本用1%甲酸脱钙，OCT包埋，30 μm厚中轴切片，空气凉干。切片平铺于X线乳胶片上，暗盒中自显影曝光1周，得放射自显影图谱。
二、结果
1.125I-bFGF标记品质量鉴定结果：经放射免疫测定结果为bFGF-Ab与125I-bFGF结合率达45%，获得符合要求(正常范围35%～55%)的125I-bFGF产品。125 I-bFGF与bFGF-Ab经琼脂糖双扩散和自显影可见在bFGF-Ab 1∶200的中央孔之间的沉淀线最明显(图1)。
图1 琼脂糖双扩散和自显影图谱，125I-bFGF加至梅花孔中央孔内，周边孔依次为不同浓度的bFGF-AB,可见孔之间沉淀线。1:200最明显(箭头)。 × 400
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2.125I-bFGF在体内各脏器分布：γ射线放射免疫分析仪测得125I-bFGF组在血液，左、右耳蜗和脑中125I-bFGF的每分钟计数率(
±s)分别是2 828±507，623±60，660±65，535±21；125I组分别是7 274±33，1 226±103，1 238±103，582±34；生理盐水组是368±7，381±10，348±6，366±4。本底为365±7。甲状腺、肝、肾、心在125I-bFGF组中每分钟计数率范围为(812±100)～(2743±490)；在125I组为(1 424±226)～(2748±519),均比耳蜗和脑内数值高。
3. 耳蜗切片放射自显影结果：125I组腹腔注入2 h后，耳蜗中轴切片可见蜗轴内有放射自显影颗粒(图2),而125I-bFGF组和生理盐水组未见显影颗粒。
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图2 125I 腹腔注入动物耳蜗中轴切片可见有放射自显影颗粒(箭头)。 × 200
三、讨论
本研究用氯胺T氧化碘化标记法制备了125I-bFGF，经放射免疫分析法测定其bFGF-Ab与125I-bFGF结合率达45%，实验结果表明bFGF经碘标记后，获得符合要求的125I-bFGF产品。为更有说服力，采用琼脂糖双扩散法和自显影技术，观察到125I-bFGF中央孔与周边不同浓度的bFGF-Ab孔之间有明显沉淀线存在，又以bFGF-Ab为1∶200最明显，表明抗人bFGF-Ab与125I-bFGF有明显的交叉反应，说明标记方法可靠，标记结果准确。
本组结果表明125I组在所检测的各脏器中，放射性强度都高于125I-bFGF组，同时耳蜗放射自显影切片可见颗粒显现，表明125I均可以通过机体各脏器。125I-bFGF组放射性强度以血液最高，耳蜗及脑内含量较低。虽然左、右耳蜗每分钟放射性计数率分别是623和620，比本底放射性计数率高250个平均数值，统计学比较差异有显著性，提示可能有微量125I-bFGF在耳蜗中蓄积，但是放射自显影切片上，耳蜗未见放射性颗粒显现，提示125I-bFGF进入耳蜗不明显。本实验结果表明，125I-bFGF 腹腔注入后2 h，透过血迷路屏障进入内耳可能有一定困难。采用bFGF肌肉注射对动物噪声所致阈移的恢复有作用，这种作用究竟是对耳蜗或是间接作用还难以肯定。就本实验结果来看bFGF透过血迷路屏障困难，那末对阈移恢复的作用推测可能是间接的，可能是通过体内的神经免疫网络而对耳蜗起作用。
基金项目：国家教委留学回国人员科研启动基金资助项目(1997，436号)
参考文献：
[1]孙建军，汪吉宝，李桂荣.生长因子对离体听神经元存活与轴突再生的影响.中华耳鼻咽喉科杂志，1996，5：274-276.
[2]翟所强，成晋川，王嘉陵，等.成纤维细胞生长因子耳蜗内灌注防治爆震性耳聋的实验研究.中华耳鼻咽喉科杂志，1997，6：354-356.
收稿日期：1999-06-08, 百拇医药
单位：翟所强(北京 解放军总医院耳鼻咽喉科研究所 100853)；杨伟炎(北京 解放军总医院耳鼻咽喉科研究所 100853)；姜泗长(北京 解放军总医院耳鼻咽喉科研究所 100853)；陈泮藻(基础所生化室)
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000121 实验证实碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)对离体听神经元存活与轴突再生有直接营养作用[1]，耳蜗内灌注bFGF对爆震性听力损伤的修复有促进作用[2]。临床给药途径多为肌肉或静脉注射。我们用125I标记bFGF，探讨bFGF在豚鼠体内主要脏器分布，观察bFGF通过血迷路屏障的可能性，为临床合理用药提供理论参考。
, 百拇医药 一、材料和方法
1.试剂、仪器及标记方法：bFGF相对分子质量17000，含有154氨基酸，质量浓度为1 g/L，E.Coli表达；抗人bFGF兔血清(bFGF-Ab)购自美国Pepro Tech.EC 公司，经氯胺T氧化碘化标记法，125I Na标记bFGF，用抗人bFGF-Ab和琼脂糖双扩散自显影技术鉴定125I-bFGF标记品质量。
2.动物处理及样本采集和测定法：豚鼠22只分为3组：125I标记bFGF腹腔注入组(简称125I-bFGF组)10只；125I Na腹腔注入组(简称125I组)6只；生理盐水腹腔注入组(简称生理盐水组)6只。全部动物腹腔注入1%碘化钾0.5 ml，30 min后125I-bFGF组注入125I标记bFGF(100 μL原液加400 μL 生理盐水混合)0.5 ml；125I组腹腔注入125I Na 0.5 ml；生理盐水组注入生理盐水 0.5 ml，2 h后，1% 戊巴比妥钠40 mg/kg体重麻醉动物，心内抽血，取脑、甲状腺、肝、肾、心、双耳蜗去骨壳暴露部分膜迷路。样品在光电天平上称重后，在HH 6003型γ放射免疫分析仪中测定放射性强度，每个样品测1 min，得出样品的每分钟计数率。
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3 .耳蜗标本放射自显影：耳蜗标本测定放射性强度后，标本用1%甲酸脱钙，OCT包埋，30 μm厚中轴切片，空气凉干。切片平铺于X线乳胶片上，暗盒中自显影曝光1周，得放射自显影图谱。
二、结果
1.125I-bFGF标记品质量鉴定结果：经放射免疫测定结果为bFGF-Ab与125I-bFGF结合率达45%，获得符合要求(正常范围35%～55%)的125I-bFGF产品。125 I-bFGF与bFGF-Ab经琼脂糖双扩散和自显影可见在bFGF-Ab 1∶200的中央孔之间的沉淀线最明显(图1)。
图1 琼脂糖双扩散和自显影图谱，125I-bFGF加至梅花孔中央孔内，周边孔依次为不同浓度的bFGF-AB,可见孔之间沉淀线。1:200最明显(箭头)。 × 400
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2.125I-bFGF在体内各脏器分布：γ射线放射免疫分析仪测得125I-bFGF组在血液，左、右耳蜗和脑中125I-bFGF的每分钟计数率(
±s)分别是2 828±507，623±60，660±65，535±21；125I组分别是7 274±33，1 226±103，1 238±103，582±34；生理盐水组是368±7，381±10，348±6，366±4。本底为365±7。甲状腺、肝、肾、心在125I-bFGF组中每分钟计数率范围为(812±100)～(2743±490)；在125I组为(1 424±226)～(2748±519),均比耳蜗和脑内数值高。3. 耳蜗切片放射自显影结果：125I组腹腔注入2 h后，耳蜗中轴切片可见蜗轴内有放射自显影颗粒(图2),而125I-bFGF组和生理盐水组未见显影颗粒。
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图2 125I 腹腔注入动物耳蜗中轴切片可见有放射自显影颗粒(箭头)。 × 200
三、讨论
本研究用氯胺T氧化碘化标记法制备了125I-bFGF，经放射免疫分析法测定其bFGF-Ab与125I-bFGF结合率达45%，实验结果表明bFGF经碘标记后，获得符合要求的125I-bFGF产品。为更有说服力，采用琼脂糖双扩散法和自显影技术，观察到125I-bFGF中央孔与周边不同浓度的bFGF-Ab孔之间有明显沉淀线存在，又以bFGF-Ab为1∶200最明显，表明抗人bFGF-Ab与125I-bFGF有明显的交叉反应，说明标记方法可靠，标记结果准确。
本组结果表明125I组在所检测的各脏器中，放射性强度都高于125I-bFGF组，同时耳蜗放射自显影切片可见颗粒显现，表明125I均可以通过机体各脏器。125I-bFGF组放射性强度以血液最高，耳蜗及脑内含量较低。虽然左、右耳蜗每分钟放射性计数率分别是623和620，比本底放射性计数率高250个平均数值，统计学比较差异有显著性，提示可能有微量125I-bFGF在耳蜗中蓄积，但是放射自显影切片上，耳蜗未见放射性颗粒显现，提示125I-bFGF进入耳蜗不明显。本实验结果表明，125I-bFGF 腹腔注入后2 h，透过血迷路屏障进入内耳可能有一定困难。采用bFGF肌肉注射对动物噪声所致阈移的恢复有作用，这种作用究竟是对耳蜗或是间接作用还难以肯定。就本实验结果来看bFGF透过血迷路屏障困难，那末对阈移恢复的作用推测可能是间接的，可能是通过体内的神经免疫网络而对耳蜗起作用。
基金项目：国家教委留学回国人员科研启动基金资助项目(1997，436号)
参考文献：
[1]孙建军，汪吉宝，李桂荣.生长因子对离体听神经元存活与轴突再生的影响.中华耳鼻咽喉科杂志，1996，5：274-276.
[2]翟所强，成晋川，王嘉陵，等.成纤维细胞生长因子耳蜗内灌注防治爆震性耳聋的实验研究.中华耳鼻咽喉科杂志，1997，6：354-356.
收稿日期：1999-06-08, 百拇医药