SDS-PAGE结合125I示踪法与ELISA法测定血中rh-bFGF的比较
作者：龙启才 刘长征 符志莉 梁昌盛
单位：中山医科大学临 床药理学教研室 广州 510080
关键词：重组人碱性成纤维细胞生 长因子(rh-bFGF)；大鼠；125I标记；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(DSD-PAGE)；ELIS A
中国现代应用药学000610 摘要 目的：比较和评价SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合 125I示踪法与ELISA法测定血浆中重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor,rh-bFGF)。方法：10只大鼠iv 125 I-rh-bFGF 1600ng/kg,用SDS-PAGE结合放射性计数测定血浆rh-bFGF 含量。9只大鼠iv rh-bFGF 1600ng/kg,用ELISA法测定血浆rh-bFGF含量。结果 ：两种方法的灵敏度、回收率和重现性好。ELISA法测定血浆rh-bFGF含量较SDS-P AGE结合125I示踪法低。结论：SDS-PAGE结合125I示踪法 与ELISA均可满足药动学研究的要求。
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The comparison of determination of rh-bGFG in plasma by DSD-PAGE combined with 125 I tracing and by ELISA
Long Qicai(Long QC),Liu Changzheng(Liu CZ),Fu Zhili(Fu ZL),et al
(Department of CLinical Pharmacology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080)
ABSTRACT OBJECTIVE： To compare and evaluate the determination of recombinant human basic fibroblast growth factor(rh-bFGF) in plasma by SDS-PAGE combined with 125 I tracing and by ELISA.METHOD:SDS-PAGE combined with radioactive count and ELISA were applied the determination of rh-bFGF concentration in plas ma after iv 125 I-rh-bFGF or rh-bFGF 1600ng/kg to 2 groups of rats,respectively.RESULTS:Sensitivity,recovery and reproducibility of two methods were good,but rh-bFGF concentration in rat plasma determined by ELISA was lower than that by SDS-PAGE combined with 125 I tra cing.CONCLUSION:These two methods were all suitable for pharmacokine tic study.
, 百拇医药
KEY WORDS recombinant human basic fibroblast growth fac tor(rh-bFGF),rats,125I tracer method,SDS-polyacrylamide gel electrophore sis(SDS-PAGE),ELISA
正确评价蛋白质多肽类在体内的吸收、分布、代 谢、转化和排泄，是近来普遍受关注的课题[1]。碱性成纤维细胞生长因子是分子 量为16.4KD的蛋白质多肽，有多种生物学活性和临床用途，其神经营养活性最引人注目 [2～5]。本实验旨在比较检测rh-bFGF的两种方法(SDS-PAGE结合125I标记示踪 法和ELISA法)的特点，为该药研究体内的药代动力学应用提供参考资料。
1 材料和方法
1.1 药物和试剂
, 百拇医药
rh-bFGF由珠海东大生物制药有限公司提供，纯度98%，批号9510902。Na 125I由北京原子能研究院出品。rh-bFGF试剂盒为美国R&D公司产品。阴离子交换树脂(A G-1×8)和噻唑蓝(MTT)为Sigma公司产品。Sephadex G-50、丙烯酰胺(Acr)、N，N′-亚 甲基双丙烯酰胺(Bis)由瑞典PHARMACIA公司生产。所有试剂均为分析纯。
1.2 动物
健康二级SD大鼠，体重200±20g，本校动物中心提供，动物 合格证号95A05。
1.3 SDS-PAGE结合125I标记示踪法
1.3.1 125I-rh-bFGF的制备 125I经氯胺T法标记于 rh-bFGF，用阴离子交换树脂柱分离纯化标记物，并用纸层析和SDS-PAGE两种方法鉴定 125I-rh-bFGF放化纯。用改良MTT法鉴定标记物的生物学活性[6]。将BALB/c 3T3细胞按每孔100μl(含10% FBS的DMEM培养液)5000个细胞的浓度加到96孔板中，37℃、5 % CO2条件下培养24h，再用含0.4% FBS的DMEM培养液培养24h，之后换成100μl用培养液( 含0.4% FBS)系列梯度稀释的rh-bFGF标准品和标记样品，48h后每孔加入19μl MTT(10mg/m l),继续培养4h,弃去培养液，每孔加入100μl裂解液，室温放置15min,测定570nm处吸光值 。按公式计算：样品效价=标准品效价×(标准品半效稀释度/相当于标准品半效量时的稀释 度)。
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1.3.2 血浆rh-bFGF的检测方法 采用SDS-PAGE法分离rh-bFG F原型物。电泳条件：12%分离胶，5%浓缩胶,5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，2×SDS凝胶加样 缓冲液。样品在浓缩胶中的电压为120V，在分离胶中的电压为150V。分离胶总长度为5cm。 电泳到溴酚蓝距分离胶上缘2.5cm时，终止电泳。样品自浓缩胶开始，依次切成浓缩胶1片、 分离胶1cm 1片、0.5cm 8片共10小片胶，分别装入测量管中，用γ计数仪测量cpm,计算dpm 并转换成mBq。
用rh-bFGF将注射用的125I-rh-bFGF与空白血浆配成不同浓度， 电泳后切胶，测定各片胶cpm值，作出rh-bFGF片胶mBq值与浓度的电泳标准曲线，计算回收 率和变异系数。将血浆样品电泳后rh-bFGF片胶的mBq值代入电泳标准曲线得到rh-bFGF原 型物的浓度。测定天内、天间变异系数和回收率。
用rh-bFGF和生理盐水将125I- rh-bFGF配制成所需浓度供iv用。大鼠10只,♀♂各半。用乙醚麻醉并进行颈动脉插管，待 鼠清醒后给药和取血。经尾静脉iv125I-rh-bFGF 1600ng/kg(2.6ml/k g)。于0～15min内11个时间点自颈动脉插管各取血0.2ml。血样本置于肝素化和含5%氟化钠1 0μl的试管中，分离血浆测定浓度。
, 百拇医药
1.4 ELISA法测定血中rh-bFGF
用测定稀释剂RD1J 50μl/孔包被微孔板后，加入200μl被检样品或标准溶液。密封，室温 孵育2h。用含防腐剂的表面活性剂缓冲液洗板3次(400μl/孔)。加入酶标结合物200μl/孔 ，密封，室温孵育2h。重复上述缓冲液洗板3次(400μl/孔)，再加入底物200μl/孔，室温 孵育20min,最后加入终止剂50μl/孔终止反应。于酶标仪450nm处测定吸光值。
吸取校准 稀释液RS6J 500μl至各管，将原液(640pg/ml)稀释为不同浓度，测定OD450值后，作 出OD450值与浓度的标准曲线。测定天内、天间变异系数和回收率。
大鼠9只,♀♂ 兼有。iv rh-bFGF 1600ng/kg。于0～10min内9个时间点自颈动脉插管各取血0.2ml。血样 本置于肝素化的试管中，分离血浆待测。测定前把血浆样品稀释10倍，测OD值后代入标准曲 线，所得浓度乘10为血浆中rh-bFGF的浓度。
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1.5 数据处理
两组相 应时间点的血药浓度用t检验。
2 结 果
2.1 125I-rh-bFGF制备及电泳结果
125I-rh-bFGF放 射性浓度为2.5±0.9×109cpm/ml,放射性比活度为2.9±0.8×106mBq/μg,用纸层析和 电泳两种方法鉴定其放化纯，分别为98.3%±0.6%和97.4%±1.1%(P>0.05)。 经MTT法测定同批rh-bFGF标记前、后的ED50分别为1.22、1.75ng/ml(标准参照为2.0 ng/ml)。说明经125I标记后,rh-bFGF生物活性无差异(与标记前比较P >0.05)。电泳图谱见图1。
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图1 rh-bFGF电泳图
1-rh-bFGF;2-125I-rh-bFGF+rh-bFGF;3-Na 125I; 4-Na 125I+rh-bFGF;
5-rh-bFGF+大鼠血浆；6-125I-rh-bFG F+rh-bFGF+大鼠血浆；7-Na 125I+大鼠血浆
2.2 标准曲线
以mBq对浓度作图，用于大鼠iv 125 I-rh-bFGF的SDS-PAGE标准曲线的线性范围在0.19～12(0.19,0.38,0.75,1.5,3,6，1 2)ng/ml。回归方程为y=10695x+771,r=0.9998。低、中、高(0.38,0.75,6ng/m l)3个浓度的天内、天间变异系数分别为0%～1.9%和1.8%～3.3%。回收率为71%～75%。
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以OD值对浓度作图，用于大鼠iv rh-bFGF 1600ng/kg的ELISA标准曲线的线性范围在2.5～3 20(2.5,5,10,20,40,80,160，320)pg/ml。回归方程为y=0.0054x+0.1389,r=0. 9970。低、中、高(5,20，160pg/ml)3个浓度的天内、天间变异系数分别为1.2%～1.9%和2.1 %～4.2%。回收率为82%～88%。
2.3 大鼠血浆rh-bFGF浓度
两组大鼠分别iv 125I-rh-bFGF或rh-bFGF 1600ng/kg后的血药浓度 见表1。从表1可见用ELISA法所测到的血药浓度在相应的时间点比SDS-PAGE和125I示 踪法测定的低(P<0.01)，但血药浓度趋势基本相同。
表1 两组大鼠分别iv 125I-rh -bFGF或rh-bFGF 1600ng/kg,后血浆中rh-bFGF浓度/ng.ml-1,x±s 时间/min
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ELISA法/ n=9
SDS-PAGE及125I示踪法/n=10
0
0
0
0.25
9.15±0.24
0.5
6.07±0.23
7.43±0.16*
0.75
3.77±0.21
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6.23±0.16*
1
2.65±0.38
5.11±0.14*
1.5
3.91±0.13
2
0.94±0.22
2.90±0.08*
3
0.53±0.10
, http://www.100md.com 2.77±0.09*
5
0.39±0.07
2.36±0.04*
7
0.16±0.06
1.64±0.05*
10
0.07±0.07
1.14±0.03*
15
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0.87±0.02
注：与ELISA法比较，*P<0.01
3 讨 论
125I比放射性高，标记制备容易 ，半衰期合适，是一种常用的蛋白质多肽标记核素。标记后的放射性化学纯度、比放射性和 比生物活性是衡量标记是否成功的三个主要参数。比放射性过低将影响灵敏度，过高则可能 引起蛋白质三级结构的改变和变性，影响蛋白质的生物活性、体内代谢过程和免疫活性。本 实验的标记比放射性为2.3～3.8×106Bq/μg，标记rh-bFGF的放射性浓度在1.7～2.4×1 09cpm/ml之间，具有较高的可检测性。标记前后rh-bFGF的生物活性无差别。高纯度的标 记rh-bFGF是研究药代动力学可靠的前提。本实验对标记rh-bFGF采用阴离子交换树脂分离 纯化，可达到最佳分离。用纸层析和电泳两方法鉴定其纯度，可分离125I-rh-bFGF 和非标记rh-bFGF，是较为可靠的测定标记rh-bFGF纯度的方法。经以上两种方法检测, 125I-rh-bFGF的放射性化学纯度均在95%以上，从而保证了实验用125I-rh-b FGF的纯度。标记rh-bFGF在4℃下保存，一周内其放射性化学纯度仍可达95%以上。核素标 记药注射到体内如仅仅测体内的各种样品总放射性计数并不能代表原形物浓度，必须结合其 它分离分析蛋白质的方法才能较好地反映所测定样品中rh-bFGF原形物。
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SDS-PAGE法是 分离及定性分析蛋白质的常用方法，具有较高的分辨率。它可以根据蛋白质颗粒大小、形状 不同造成的在凝胶中移动速度不同而将rh-bFGF结合物、原形物、降解物进行较好地分离。 125I标记示踪与SDS-PAGE相结合既能较好地分离和测定动物血浆、组织匀浆中rh-b FGF原形物，又可大大提高检测灵敏度，且其线性关系和稳定性均可达到药动学研究的要求 。缺点是不能检测到小分子水溶性代谢物。多样品在同一电泳槽中泳动时，扩散效应可造成 高放射性样品对低放射性样品的污染，将放射性相近的样品放在一起可减少这种可能性。另 外每次电泳时每板均加一个标准品做参考，可有效防止操作带来的样品泳动距离偏差。
SD S-PAGE结合125I示踪法最大的缺点是不能用于人体实验。ELISA法是利用酶催化反应 的放大作用和抗原抗体免疫亲和反应相结合的一种分析技术，反映了血浆中药物的抗原性。 大鼠iv相同剂量rh-bFGF后的血浆样品经用以上两种方法测定后的结果表明，ELISA法测得 的所有时间点血药浓度均比DSD-PAGE结合125I示踪法测得的要低(P<0.01)，机理有待探讨。但二者血药浓度-时间曲线的变化趋势相似。
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ELISA法不能排 除蛋白质多肽类药物代谢物的干扰，可能是代谢物有抗原性。药物降解后也有可能使蛋白质 与抗体的相互作用发生变化，还可能受内源性物质的干扰。此法亦难以测定组织内的药物浓 度。实验中要注意样品须保存在2～8℃，测定前再取出。每次冲洗都要将洗液弃尽，以获得 最佳结果；测OD值要在30min内完成，以减少误差。
参考文献
1，汤仲明，刘秀文，屠敏.蛋白质多肽类药物药代动力学研 究的方法和实验设计.中国药理学与毒理学杂志，1996，10(3)∶161.
2，刘建华，黎昭洪，杜韵璜，等.bFGF对大鼠脊髓前角运动 神经元的保护作用.暨南大学学报*自然科学与医学版，1998，19(4)∶1.
3，汪春风，黄连碧.bFGF对成年大鼠大脑皮质损伤神经元的 作用.广东解剖学通报，1995，17(2)∶124.
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4，唐孝明，裴福兴，谭健三.碱性成纤维细胞生长因子促神 经再生的实验研究.中华显 微外科杂志，1998，21(3)∶201.
5，Zawada WM,Zastrow DJ,Clarkson ED,et al.Growth factors improve immediate survival of embryonic dopamine neurons after transplantation into rats.Brain Res,1998,786(1～2)∶96.
6，Yang LY,Trujillo JM.Biological characterization o f multidrug resistant human colon carcinoma sublines induced by two methods>Canc er Res,1990,50∶5218.
收稿日期：1999-10-15, 百拇医药
单位：中山医科大学临 床药理学教研室 广州 510080
关键词：重组人碱性成纤维细胞生 长因子(rh-bFGF)；大鼠；125I标记；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(DSD-PAGE)；ELIS A
中国现代应用药学000610 摘要 目的：比较和评价SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合 125I示踪法与ELISA法测定血浆中重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor,rh-bFGF)。方法：10只大鼠iv 125 I-rh-bFGF 1600ng/kg,用SDS-PAGE结合放射性计数测定血浆rh-bFGF 含量。9只大鼠iv rh-bFGF 1600ng/kg,用ELISA法测定血浆rh-bFGF含量。结果 ：两种方法的灵敏度、回收率和重现性好。ELISA法测定血浆rh-bFGF含量较SDS-P AGE结合125I示踪法低。结论：SDS-PAGE结合125I示踪法 与ELISA均可满足药动学研究的要求。
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The comparison of determination of rh-bGFG in plasma by DSD-PAGE combined with 125 I tracing and by ELISA
Long Qicai(Long QC),Liu Changzheng(Liu CZ),Fu Zhili(Fu ZL),et al
(Department of CLinical Pharmacology,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510080)
ABSTRACT OBJECTIVE： To compare and evaluate the determination of recombinant human basic fibroblast growth factor(rh-bFGF) in plasma by SDS-PAGE combined with 125 I tracing and by ELISA.METHOD:SDS-PAGE combined with radioactive count and ELISA were applied the determination of rh-bFGF concentration in plas ma after iv 125 I-rh-bFGF or rh-bFGF 1600ng/kg to 2 groups of rats,respectively.RESULTS:Sensitivity,recovery and reproducibility of two methods were good,but rh-bFGF concentration in rat plasma determined by ELISA was lower than that by SDS-PAGE combined with 125 I tra cing.CONCLUSION:These two methods were all suitable for pharmacokine tic study.
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KEY WORDS recombinant human basic fibroblast growth fac tor(rh-bFGF),rats,125I tracer method,SDS-polyacrylamide gel electrophore sis(SDS-PAGE),ELISA
正确评价蛋白质多肽类在体内的吸收、分布、代 谢、转化和排泄，是近来普遍受关注的课题[1]。碱性成纤维细胞生长因子是分子 量为16.4KD的蛋白质多肽，有多种生物学活性和临床用途，其神经营养活性最引人注目 [2～5]。本实验旨在比较检测rh-bFGF的两种方法(SDS-PAGE结合125I标记示踪 法和ELISA法)的特点，为该药研究体内的药代动力学应用提供参考资料。
1 材料和方法
1.1 药物和试剂
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rh-bFGF由珠海东大生物制药有限公司提供，纯度98%，批号9510902。Na 125I由北京原子能研究院出品。rh-bFGF试剂盒为美国R&D公司产品。阴离子交换树脂(A G-1×8)和噻唑蓝(MTT)为Sigma公司产品。Sephadex G-50、丙烯酰胺(Acr)、N，N′-亚 甲基双丙烯酰胺(Bis)由瑞典PHARMACIA公司生产。所有试剂均为分析纯。
1.2 动物
健康二级SD大鼠，体重200±20g，本校动物中心提供，动物 合格证号95A05。
1.3 SDS-PAGE结合125I标记示踪法
1.3.1 125I-rh-bFGF的制备 125I经氯胺T法标记于 rh-bFGF，用阴离子交换树脂柱分离纯化标记物，并用纸层析和SDS-PAGE两种方法鉴定 125I-rh-bFGF放化纯。用改良MTT法鉴定标记物的生物学活性[6]。将BALB/c 3T3细胞按每孔100μl(含10% FBS的DMEM培养液)5000个细胞的浓度加到96孔板中，37℃、5 % CO2条件下培养24h，再用含0.4% FBS的DMEM培养液培养24h，之后换成100μl用培养液( 含0.4% FBS)系列梯度稀释的rh-bFGF标准品和标记样品，48h后每孔加入19μl MTT(10mg/m l),继续培养4h,弃去培养液，每孔加入100μl裂解液，室温放置15min,测定570nm处吸光值 。按公式计算：样品效价=标准品效价×(标准品半效稀释度/相当于标准品半效量时的稀释 度)。
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1.3.2 血浆rh-bFGF的检测方法 采用SDS-PAGE法分离rh-bFG F原型物。电泳条件：12%分离胶，5%浓缩胶,5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，2×SDS凝胶加样 缓冲液。样品在浓缩胶中的电压为120V，在分离胶中的电压为150V。分离胶总长度为5cm。 电泳到溴酚蓝距分离胶上缘2.5cm时，终止电泳。样品自浓缩胶开始，依次切成浓缩胶1片、 分离胶1cm 1片、0.5cm 8片共10小片胶，分别装入测量管中，用γ计数仪测量cpm,计算dpm 并转换成mBq。
用rh-bFGF将注射用的125I-rh-bFGF与空白血浆配成不同浓度， 电泳后切胶，测定各片胶cpm值，作出rh-bFGF片胶mBq值与浓度的电泳标准曲线，计算回收 率和变异系数。将血浆样品电泳后rh-bFGF片胶的mBq值代入电泳标准曲线得到rh-bFGF原 型物的浓度。测定天内、天间变异系数和回收率。
用rh-bFGF和生理盐水将125I- rh-bFGF配制成所需浓度供iv用。大鼠10只,♀♂各半。用乙醚麻醉并进行颈动脉插管，待 鼠清醒后给药和取血。经尾静脉iv125I-rh-bFGF 1600ng/kg(2.6ml/k g)。于0～15min内11个时间点自颈动脉插管各取血0.2ml。血样本置于肝素化和含5%氟化钠1 0μl的试管中，分离血浆测定浓度。
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1.4 ELISA法测定血中rh-bFGF
用测定稀释剂RD1J 50μl/孔包被微孔板后，加入200μl被检样品或标准溶液。密封，室温 孵育2h。用含防腐剂的表面活性剂缓冲液洗板3次(400μl/孔)。加入酶标结合物200μl/孔 ，密封，室温孵育2h。重复上述缓冲液洗板3次(400μl/孔)，再加入底物200μl/孔，室温 孵育20min,最后加入终止剂50μl/孔终止反应。于酶标仪450nm处测定吸光值。
吸取校准 稀释液RS6J 500μl至各管，将原液(640pg/ml)稀释为不同浓度，测定OD450值后，作 出OD450值与浓度的标准曲线。测定天内、天间变异系数和回收率。
大鼠9只,♀♂ 兼有。iv rh-bFGF 1600ng/kg。于0～10min内9个时间点自颈动脉插管各取血0.2ml。血样 本置于肝素化的试管中，分离血浆待测。测定前把血浆样品稀释10倍，测OD值后代入标准曲 线，所得浓度乘10为血浆中rh-bFGF的浓度。
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1.5 数据处理
两组相 应时间点的血药浓度用t检验。
2 结 果
2.1 125I-rh-bFGF制备及电泳结果
125I-rh-bFGF放 射性浓度为2.5±0.9×109cpm/ml,放射性比活度为2.9±0.8×106mBq/μg,用纸层析和 电泳两种方法鉴定其放化纯，分别为98.3%±0.6%和97.4%±1.1%(P>0.05)。 经MTT法测定同批rh-bFGF标记前、后的ED50分别为1.22、1.75ng/ml(标准参照为2.0 ng/ml)。说明经125I标记后,rh-bFGF生物活性无差异(与标记前比较P >0.05)。电泳图谱见图1。
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图1 rh-bFGF电泳图
1-rh-bFGF;2-125I-rh-bFGF+rh-bFGF;3-Na 125I; 4-Na 125I+rh-bFGF;
5-rh-bFGF+大鼠血浆；6-125I-rh-bFG F+rh-bFGF+大鼠血浆；7-Na 125I+大鼠血浆
2.2 标准曲线
以mBq对浓度作图，用于大鼠iv 125 I-rh-bFGF的SDS-PAGE标准曲线的线性范围在0.19～12(0.19,0.38,0.75,1.5,3,6，1 2)ng/ml。回归方程为y=10695x+771,r=0.9998。低、中、高(0.38,0.75,6ng/m l)3个浓度的天内、天间变异系数分别为0%～1.9%和1.8%～3.3%。回收率为71%～75%。
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以OD值对浓度作图，用于大鼠iv rh-bFGF 1600ng/kg的ELISA标准曲线的线性范围在2.5～3 20(2.5,5,10,20,40,80,160，320)pg/ml。回归方程为y=0.0054x+0.1389,r=0. 9970。低、中、高(5,20，160pg/ml)3个浓度的天内、天间变异系数分别为1.2%～1.9%和2.1 %～4.2%。回收率为82%～88%。
2.3 大鼠血浆rh-bFGF浓度
两组大鼠分别iv 125I-rh-bFGF或rh-bFGF 1600ng/kg后的血药浓度 见表1。从表1可见用ELISA法所测到的血药浓度在相应的时间点比SDS-PAGE和125I示 踪法测定的低(P<0.01)，但血药浓度趋势基本相同。
表1 两组大鼠分别iv 125I-rh -bFGF或rh-bFGF 1600ng/kg,后血浆中rh-bFGF浓度/ng.ml-1,x±s 时间/min
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ELISA法/ n=9
SDS-PAGE及125I示踪法/n=10
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5.11±0.14*
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2
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2.90±0.08*
3
0.53±0.10
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5
0.39±0.07
2.36±0.04*
7
0.16±0.06
1.64±0.05*
10
0.07±0.07
1.14±0.03*
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注：与ELISA法比较，*P<0.01
3 讨 论
125I比放射性高，标记制备容易 ，半衰期合适，是一种常用的蛋白质多肽标记核素。标记后的放射性化学纯度、比放射性和 比生物活性是衡量标记是否成功的三个主要参数。比放射性过低将影响灵敏度，过高则可能 引起蛋白质三级结构的改变和变性，影响蛋白质的生物活性、体内代谢过程和免疫活性。本 实验的标记比放射性为2.3～3.8×106Bq/μg，标记rh-bFGF的放射性浓度在1.7～2.4×1 09cpm/ml之间，具有较高的可检测性。标记前后rh-bFGF的生物活性无差别。高纯度的标 记rh-bFGF是研究药代动力学可靠的前提。本实验对标记rh-bFGF采用阴离子交换树脂分离 纯化，可达到最佳分离。用纸层析和电泳两方法鉴定其纯度，可分离125I-rh-bFGF 和非标记rh-bFGF，是较为可靠的测定标记rh-bFGF纯度的方法。经以上两种方法检测, 125I-rh-bFGF的放射性化学纯度均在95%以上，从而保证了实验用125I-rh-b FGF的纯度。标记rh-bFGF在4℃下保存，一周内其放射性化学纯度仍可达95%以上。核素标 记药注射到体内如仅仅测体内的各种样品总放射性计数并不能代表原形物浓度，必须结合其 它分离分析蛋白质的方法才能较好地反映所测定样品中rh-bFGF原形物。
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SDS-PAGE法是 分离及定性分析蛋白质的常用方法，具有较高的分辨率。它可以根据蛋白质颗粒大小、形状 不同造成的在凝胶中移动速度不同而将rh-bFGF结合物、原形物、降解物进行较好地分离。 125I标记示踪与SDS-PAGE相结合既能较好地分离和测定动物血浆、组织匀浆中rh-b FGF原形物，又可大大提高检测灵敏度，且其线性关系和稳定性均可达到药动学研究的要求 。缺点是不能检测到小分子水溶性代谢物。多样品在同一电泳槽中泳动时，扩散效应可造成 高放射性样品对低放射性样品的污染，将放射性相近的样品放在一起可减少这种可能性。另 外每次电泳时每板均加一个标准品做参考，可有效防止操作带来的样品泳动距离偏差。
SD S-PAGE结合125I示踪法最大的缺点是不能用于人体实验。ELISA法是利用酶催化反应 的放大作用和抗原抗体免疫亲和反应相结合的一种分析技术，反映了血浆中药物的抗原性。 大鼠iv相同剂量rh-bFGF后的血浆样品经用以上两种方法测定后的结果表明，ELISA法测得 的所有时间点血药浓度均比DSD-PAGE结合125I示踪法测得的要低(P<0.01)，机理有待探讨。但二者血药浓度-时间曲线的变化趋势相似。
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ELISA法不能排 除蛋白质多肽类药物代谢物的干扰，可能是代谢物有抗原性。药物降解后也有可能使蛋白质 与抗体的相互作用发生变化，还可能受内源性物质的干扰。此法亦难以测定组织内的药物浓 度。实验中要注意样品须保存在2～8℃，测定前再取出。每次冲洗都要将洗液弃尽，以获得 最佳结果；测OD值要在30min内完成，以减少误差。
参考文献
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收稿日期：1999-10-15, 百拇医药