广州地区急性散发性HEV毒株基因特征和生物学性状的研究
作者：李庆虹 黄如统 魏绍静 李德荣
单位：军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100850
关键词：戊型肝炎病毒(HEV)；细胞分离株；基因特征；生物学性状
中国病毒学000107 摘 要：利用RT-PCR技术对我国广州地区急性散发性戊型肝炎病毒细 胞培养分离株G93-1、G93-2、G93-3和G93-4基因组聚合酶区部分核苷酸序列(4522～4761nt)进行检测，PCR阳性产物经纯化、克隆后测序。结果G93-1、G93-3和G93-4株 病毒的 这段序列完全相同，且与我国新疆暴发流行的HEV 87A株及亚洲HEV代表株的同源性为100%； 而G93-2株与它们的差异较大，同源性只有79.9%；但是，它与1997年从厦门地区急 性戊型肝炎病人血清中检测的X-S1株同源性很高，达99.2%。并对G93-2株病毒的生物学特性进行了研究，结果与87A株一致。表明我国南方散发性HEV毒株的基因组存在差异，可能同时流行着两种不同的HEV基因型，但生物学性状是相同的。
分类号：R373.21 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)01-0039-05
Study on Genetic and Biological Character of
Sporadic Strains of Acute HEV in Guangzhou
LI Qing-hong, HUANG Ru-tong, WEI Shao-jing, LI De-rong
(Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100850, China)
Abstract：Partial nucleotide sequences (location 4522-4761) from ORF 1 of sporadic strains (G93-1,G93-2,G93-3 and G93-4) of acute HEV in Guangzhou were detected, the positive PCR products were purified, cloned and sequenced. In the result,the nucleotide sequences of G93-1, G93-3 and G93-4 strain are all the same to each other, and have a homology of 100% with the Xin Jiang 87A and Burma strain respectively. The G93-2 strain is different, the homology of thisp art of sequence with them is only 79.9%, but it has a homology of 99.2% with X-S1 strain obtained from the acute phase serum of a patient with hepatitis E in X iamen. In addition, the biological character of the G93-2 strain was studied, the result was as same as the 87A strain's. All the results show there is a variant subgenotype of HEV in the South of China besides the similar strain with Xinjiang, but they have the same biological character.
Key words：Hepatitis Evirus; Isolated strain; Genetic character; Biological character▲
戊型肝炎(HE)是一种世界性疾病，在亚洲、非洲和北美洲的一些发展中国家常呈暴发流行或散发传播。我国戊型肝炎流行率为17.2%，仅次于甲型肝炎[1]，严重危害着人类的健康。甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)同为肠道传播的肝炎病毒，在临床和传播途径上非常相似。已知来自世界不同地区的人类HAV只有一个血清型，但可分成四个不同的基因型[2]。对于HEV，其血清型是否为一个尚不清楚，但从不同地区毒株的核苷酸差异分析，至少存在四个不同的基因型(或亚型)[3～6]。目前国内外关于散发性HEV病原学的报道不多，更缺乏病毒学性质的研究。
本实验室自1988年分离新疆暴发性HEV87A株后[7]，1993年又与广州市传染病医院合作，从广州地区散发性HE病人急性期粪便标本中分离到四株病毒。近年来，在病毒的形态学、血清学、PCR扩增及核酸杂交方面进行了初步鉴定[8]。最近，我们又利用RT-PCR技术对这四株病毒的ORF1聚合酶区部分基因组进行了扩增和核苷酸序列分析，从而在分子水平上进一步证明它们为HEV，并与我国及亚洲已知的HEV序列进行了比较。然后，我们还对G93-2株病毒的生物学特性进行了研究，包括血清学关系、细胞敏感性及理化性质，这在国内外尚未见有报道。
1 材料与方法
1.1 病毒株 1993年用A549细胞从广州地区四名散发性HE病人急性期粪便标本中分离，分别命名为G93-1、G93-2、G93-3和G93-4株[8]。用2BS细胞从第一代连传三代后用于实验。对照病毒为87A株[7]。
1.2 引物设计与合成 根据已报道的HEV缅甸株序列[3]，于军事医学科学院生物工程研究所合成两对引物，详见文献[7]。
1.3 RNA提取 将病毒液接种2BS细胞后于37℃孵箱培养，CPE达时收冻，冻融两次后离心去细胞碎片，常规PEG浓缩100倍后，按说明书操作，用TRIzol试剂(Gibco/BRL)提取RNA。RNA经DNaseI(Gibco/BRL)消化后用于RT-PCR。具体方法见文献[9]。
1.4 RT-PCR 使用RT-PCR一步法试剂盒(Gibco/BRL)，加入R1、F1外引物，45℃30min逆转录，94℃2min后进入PCR循环，94℃变性30sec，52℃退火45sec，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸8min。取5μLPCR一扩产物用内引物R2、F2进行二扩。PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶中观察结果。
1.5 克隆与鉴定 阳性PCR产物纯化回收后，与pGEM-T-Easy载体(Promega)连接，并转化JM109菌。阳性菌落经PCR初步鉴定后用EcoRI酶切鉴定，均按分子克隆有关操作进行。
1.6 序列分析与比较 鉴定阳性菌送至军事医学科学院生物工程研究所进行纯化与测序，测序结果与我国87A株[7]及亚洲代表株缅甸株[3]进行同源性比较。
1.7 交叉中和试验 用1∶10稀释的抗-87A株病毒的兔免疫血清进行固定血清-稀释病毒微量细胞中和试验，方法按常规。87A株作阳性对照，同时设细胞及血清对照。
1.8 细胞敏感性试验 选择2BS、A549、LLC-MK2三种细胞，病毒接种培养后CPE达++～+++时收冻，未出现CPE的细胞于接种后第7天收冻。如此连传三代后用微量滴定法测定传代前后的病毒滴度。
1.9 理化性质试验 耐乙醚、耐热、耐酸以及核酸型的测定均按文献[10]。
2 结果
2.1 PCR检测结果
由图1可见，HEVG93-1、G93-2、G93-3和G93-4第五代分别经RT-nPCR后，均可扩增出长约239bp带，而正常2BS细胞培养物阴性。
图1 四株散发性HEV毒株的RT-nPCR检测结果
1.pBR322/MspIDNA分子量标志；2.G93-1株；3.G93-2株；4.G93-3株；5.G93-4株；6.正常细胞对照
Fig.1Results of four strains of HEV detected by RT-nPCR
1. pBR322/Msp I DNA Markers; 2.G93-1 strain; 3.G93-2 strain;
4.G93-3 strain; 5.G93-4 strain; 6.Normal cells control
2.2 核苷酸序列分析
如图2所示，RT-nPCR扩增的G93-1、G93-3和G93-4的这段核苷酸及推测的氨基酸序列均 相同，且与新疆87A株及亚洲缅甸株同源性均为100%，只有G93-2株的序列有明显不同，与 以上几株病毒的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.9%和86.3%。
图2 6株HEV的核苷酸和氨基酸序 列
Fig.2 The nucleotide (N) and amino acid (A) sequences of six strains of HEV
*G93-3和G93-4序列与G93-1完全相同，仅以G93-1表示。
The sequences of G93-3 and G93-4 are the same as that of G93-1 expressing as sequence of G93-1.
2.3 交叉中和试验
从表1可见，G93-2株病毒与87A株一样，均可被抗-87A株病毒的免疫血清所中和，二者属 同一个血清型。
表1 HEV G93-2株与抗-87A株病毒血清交叉中和试验 的结果
Table 1 Results of cross -neutralization between G93-2 strain and anti-87A s erum 病毒株(代次)
Virus strain (Passage)
与抗-87A株病毒血 清(1∶10)的中和试验结果
Results of cross-neutralization
between G93-2 strain and anti-87A serum
(TCID50/0.025mL)
中和指数
Neutralization
index
中和组
Neutralization
病毒对照组
Virus control
G93-2(5)
0
5.5
3.16×105
87A(13)
0
6.5
3.16×106
2.4 细胞敏感性试验
结果如表2。G93-2株病毒在2BS细胞和A549细胞中连传三代后，病毒滴度均较稳定并有所增 高，可见这两种细胞对G93-2株病毒是敏感的。但是，该株病毒在LLC-MK2细胞中连传三代 后，病毒滴度明显降低，故该细胞对G93-2株病毒是不敏感的。结果与87A株相同。表2 G93-2株病毒的细胞敏感性试验
Table 2 Results of cell sensitivity of G93-2 strain 毒株(代次)
Virus strain (the passage)
病 毒 滴 度 (TC ID50/0.025mL*)
Viral titers
试验前
Pre-passage
连传三代后
After three passages
2BS
A549
LLC-MK2
G93-2(5)
4.7
5.3
5.7
0
87A(13)
5.3
6.0
5.5
2.5
*A549细胞测定 Determined in A549 cell
用接种了G93-2株第五代病毒的2BS细胞培养液作耐乙醚、耐酸(pH3.0)、耐热(56℃，3 0m in)、病毒核酸型试验，结果显示G93-2株病毒是耐乙醚、不耐酸、不耐热的，且不受5-IU DR的抑制，见表3。说明该株病毒与87A株一样属无包膜、不耐酸和不耐热的RNA病毒。
表3 G93-2株病毒的理化性质试验
Table 3 Results of physical-chemical character of G93-2 strain 试验组
Test group
病毒滴度*(TCID50/0.025ml)
Viral titers
G93-2(5)
87A(13)
耐乙醚
6.2
6.0
Ether
耐酸(pH3.0)
<1.0
1.3
Acid
耐热(56℃ 30min)
<1.0
<1.0
Heat
核酸型
6.2
5.5
Nucleic acid
病毒对照
6.0
5.5
Virus control
*A549细胞测定 Determined in A549 cell2.5 理化性质试验
4 讨论
一般来说，RNA病毒有较高的变异性，其中的一个原因是这种RNA的复制中缺乏校正功能。这种RNA病毒高度变异的特点在人免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)基因组中表现得最为充分。但是，HEV不象HIV和HCV那样容易形成慢性感染，它与HAV一样，仅限于急性感染的模型。在HAV基因克隆成功后的最初几年，对克隆的HAV株间比较显示有很高的同源性，但最近几年来，又新分离出不同的HAV株。现已将人源HAV分为四个基因型，同型内有≥85%的同源性，异型间有>15%的差异性[2]。但人源HAV的抗原结构非常保守，目前认为只有一个血清型。随着对HEV的不断深入研究，虽然其血清型尚不清楚，就不同地区获得的毒株的核苷酸差异进行分析，至少存在四个不同的基因型(或亚型)，即亚洲的缅甸株[3]、北美的墨西哥株[4]、我国广州地区G-20株[5]和美国的US-1株[6]。HEVcDNA核苷酸的高度保守区位于ORF2和ORF3区域，而ORF1的变异性最大，且变异多发生于密码的第三个位置，对转译的氨基酸的组成影响较小。这次对我国广州四株散发性HEV的细胞分离株进行了较详尽的研究，结果发现，对于ORF1ET1.1区段的这段核苷酸序列，其中三株与我国新疆87A株[7]及亚洲代表株缅甸株[3]完全相同，但G93-2株具有较大的变异，同源性只有79.9%。有趣的是，该株的这段核苷酸序列与1997年我室从厦门HE病人血清中检测到的X-S1株[11]却有着惊人的相似，同源性达到了99.2%。因此我们认为在我国南方急性散发性HEV毒株中，可能还存在着一种不同于新疆和北京HEV毒株[5]的基因亚型。这与本室研究的结果[5]以及最近台湾学者的报道是一致的[12]。
基于以上核苷酸序列的分析结果，我们特别对这株ORF1变异较大的G93-2株病毒进行了进一步生物学性质的研究，包括血清学、细胞敏感性以及理化性质三个方面，并与我国新疆87A株进行比较。结果发现，该株病毒在血清学关系方面，与87A株无明显的抗原性差异，二者均可被抗-87A株的免疫血清完全中和，可见该两株病毒属于同一血清型，这为我国HE疫苗的研究提供了资料；细胞敏感性方面，二者均对2BS和A549细胞敏感，对LLC-MK2细胞不敏感；理化性质方面，二者均为无包膜、不耐酸、不耐热的RNA病毒，均符合嵌杯状病毒科的性质。可见二者在上述生物学性质方面未见有差异，这可能与该病毒的抗原性质是由结构区基因决定有关，尚待进一步证明。
基金项目：本课题为院基金资助项目(编号9608056)
作者简介：李庆虹(1973-)，女，天津市人，研究生，硕士，1996年毕业于南开大学生化专业，同年8月于军事医学科学院微生物流行病研究所病毒室分子病毒学专业就读硕士。
黄如统(1942-)，男，浙江浦江人，副研究员，1966年毕业于复旦大学生物系，主要从事病毒病原的分离鉴定研究。
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收稿日期：1999-03-01
修稿日期：1999-05-24