变形链球菌表面蛋白的结构和功能
作者：汪喻忠 刘建国 樊明文
单位：汪喻忠(湖北医科大学口腔医学院, 湖北 武汉430079)；刘建国(华西医科大学口腔医 学院, 四川 成都 610041)；樊明文(湖北医科大学口腔医学院, 湖北 武汉430079)
关键词：变形链球菌； 表面蛋白； 分子结构； 龋病
牙体牙髓牙周病学杂志000336 【中图号】 R781.1 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)03-0174-03
变形链球菌表面蛋白(surface protein antigen of S.mutans，PAc) 又称为表面蛋白 P1、AgⅠ/Ⅱ、PAg、SpaA、SA等，是一类结构和功能十分相似的蛋白质家族，是致龋变链菌 (mutans streptococcus)的重要毒力因子之一，在细菌对牙面的初始粘附中起着重 要作用。并且具有良好的免疫原性，可诱导机体的保护性免疫应答。近年来，在PAc及其类 似蛋白的遗传学方面做了大量的研究工作，对其基因和蛋白分子结构、结构与功能的关系有 了进一步的了解。
, 百拇医药
1 基因克隆和核酸序列分析
Okahashi等[1]克隆了PAc的编码基因pac由5169bp组成，编码1565个 氨基酸组成的PAc蛋白。Lee等[2]从变链菌全染色体基因库中筛选出包含P1基因spa P的克隆 子。Kelly等[3]发现 spaP由4683bp组成，编码1561个氨基酸的蛋白质。Sommer等 [4]从变链菌OMZ175中克隆出编码SR蛋白的基因由4667bp组成，表达Mr 19×1 04的蛋白质。Lapolla[5]测定spaA的编码基因spaA由4684bp组成，编码1 528 个氨 基酸的蛋白，而Tokuda等[6]测定的spaA则由4689bp组成，编码1566个氨基酸的蛋 白。尽管各位学者报道的基因组成碱基数、限制性酶切位点和编码蛋白的分子量大小不一致 ，但其核苷酸和蛋白序列均有高度的同源性。
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2 蛋白分子结构与功能
2.1 信号肽
原核和真核细胞分泌蛋白质前体的导向序列称信号肽(signal peptide)。导向序列是蛋白质前体N端的一段序列，它指导蛋白质定位到不同的亚细胞器中[6]。P1分子N端1 ～38位残 基是信号肽序列[1，3，6]，Lapolla推测信号肽序列是1～50位残基[5]。 它们具有信号肽的典型特征，即有一个带电荷区、紧接其后的疏水区和一个极性C端区域，C 末端存在信号肽酶切位点。目前，大多数学者认为信号肽序列引导蛋白质由细胞内向细胞外 转移的机制是环模式。即信号肽序列带正电荷的氨基末端与带负电荷的细胞质膜内侧结合， 然后信号肽序列的疏水 区插入疏水的膜双脂层，形成环或发夹型的结构。随着新生肽链的延伸，环向周质的面不断 扩大，信号肽断裂位点暴露于膜外侧表面而被酶切除，多肽链释入周质空间，信号肽序列 仍留在细胞质膜[7～9]。
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2.2 粘附功能区[10～12 、16、17]
2.2.1 位于分子N端包含A区的序列中大多数学者提出P1分子与唾液蛋白成分粘结是N端含A区的片段介导的。证据有：①与P1分子N端序列一致，包含A区的基因工程多肽 与 唾液糖蛋白(SGPs)连接效率最高，与中间区段序列一致的基因工程多肽只有中等程度 的粘 接反应，与C端一致的多肽反应弱；②与N端一致多肽和与319～335，401～417位氨基酸序列 一致的合成肽明显抑制了P1与SGPs的粘接反应；③N端39～864位氨基酸片段与唾液成分具有 高度亲和力；④含A区多肽的麦芽糖结合蛋白——多肽复合体强烈抑制了变链菌对唾液凝集 素 (SAg)包被羟基磷灰石(HA)的粘附，这种粘附抑制作用是线性剂量依赖性的；⑤AgⅠ/Ⅱ 与唾液包被HA粘接反应被天然或重组的包含A区N端多肽抑制，而C端、中间区域以及不含A区 的N端多肽，均不影响粘附。
2.2.2 位于分子C端。目前有两位学者提出这一观点。他们的依据是：①表达P1分子N端1～612位氨基酸的变链菌变异株丧失了粘接到SAg包被HA的能力；②切去P1 C末端254 个氨基酸能有效地阻止变链菌的粘附；③抗C端Mr为74×103片段的单克隆抗体有效地 阻止了变链菌与唾液包被HA的粘附。
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2.2.3 位于分子P区。以Munro和Kelly等为代表。其依据是：①816～1213氨基酸片段多 肽明显抑制了变链菌包被HA的粘附；②1005～1024，1025～1044，1085～1104，1095～1114 肽段含有粘附决定簇，这些决定簇部分暴露于分子表面，能与唾液成分或抗体接触。这些肽 段中存在多个替换点(substitutions),决定了微生物连接受体的特异性和菌种间的特异性 反应。
2.2.4 分子中存在多个粘附功能区。P1分子二、三级结构不清楚，在一级结构中相距较 远的位点，经分子多次折迭后聚在一起，暴露于分子表面，构成一个或多个粘附功能区。特 异性抗体与这些位点反应后可以阻断变链菌在牙面的粘附。
2.3 凝集功能区[13～15]
P1可能是SAg的受体。P1与液相SAg反应介导细菌凝集，有利于对细菌的清除；还可以促进变 链菌对其他细菌的粘附。对P1分子中凝集功能区的认识，有两种不同的看法：①粘附和凝集 是由分子中不同功能区参与的两个不同反应。因为，变链菌凝集可被乳糖和岩藻糖抑制，而 粘 附被氨基糖和含一级氨基集团的化合物抑制。②粘附和凝集是由分子中相同的功能区介导的 ，即粘附功能区同时具有凝集功能。因为，含有A区的融合蛋白可以同时抑制变链菌的粘附 和凝集，并可在小鼠中诱发保护性反应。Crowlefy将编码P1分子A区的DNA片段亚克隆至大肠 杆菌中，并以麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)多肽融合体方式获得表达 。这个含A区的融合蛋白对变链菌在SAg 包被的HA上的粘附和液相SAg介导的凝集均有明显的 抑制作用，而MBP或MBP-副肌球蛋白融合体均无此抑制作用。
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2.4 钙离子结合功能区(calcium-binding domains)
SAg与表面蛋白之间的相互作用，对介导细菌在口腔组织中的定居具有重要意义。而这 种相互作用需要钙离子的参与。Duan等[14]的研究证实，来自于Streptococcus go donii的表面蛋白SSP-5是一种与钙离子有高度亲和力的蛋白质。用1mmol/LⅦ螯 合剂EDTA就可 以抑制SAg介导的S.gordonii的凝集反应。只有重新加入钙离子后，凝集反应才得以恢复。进一步用同位数45Ca和荧光素钙结合染料fura2对SSP-5结合钙的特性分析表明，1mmo l/L SSP-5可以结合1mmol/L钙离子。利用基因重组技术构建表达缺失SSP-5分子C端不同数目 氨基酸残基 的克隆株，常规分离纯化这些克隆株产物，检测其结合钙的能力以及对整个分子结构的影响 ，发现当SSP-5缺失C端250个氨基酸残基时，它结合钙的能力和与SAg相互作用的能力几乎不 受影响。而缺失1168～1250位残基则导致结合钙的能力丧失。这一段序列带有极高的电荷， 但与在原核和真核生物发现的钙结合功能区没有多大的相似性。认为SSP-5分子1168～1250 残基序列是其重要的钙离子结合区。
, 百拇医药
由于SSP-5在蛋白和基因水平与P1、PAc、PAg、SPaA等有高度同源性，推测这些分子中同样 存在类似的功能区。Crowlefy等[13]的研究结果支持这一观点，他们发现含A区多 肽的融合蛋白与SAg反应时加入EDTA，就可以阻断凝集反应的发生。
3 结语
分子生物学和现代免疫学等学科的迅猛发展和生物学实验技术的日趋完善和普及，极大地促 进了对变链菌族表面蛋白分子结构和功能的认识，为进一步阐明龋病发生的分子机理和防龋 疫苗的研制与开发提供强有力的依据。
【参考文献】
[1] Okahashi N ,Sasakawa C, Yoshikawa M, et al. Molecular characterization of a surface protein antigen gene from serotype c S treptococcus mutans, implicated in dental caries. Mol Microbiol, 1989,3(5):673
, http://www.100md.com
[2] Lee SF, Fox AP, Bleiweis AS. Molecular cloning and expression of a Streptococcus mutans major surface prote in antigen, P1 (I/II), in Escherichia coli. Infect Immun, 1988,56(8):2114
[3] Kelly CG, Evans P, Ma JK, et al. Sequencing and characterization of the 185 kDa cell surface antigen of Strepto coccus mutans. Arch Oral Biol, 1990,35(suppl):33s
[4] Sommer P, Bruyere T, Ogier JA, et al. J Bacteriol,1987，169(1 1):5167
, 百拇医药
[5] Lapolla RJ, Haron JA, Kelly CG, et al. Sequence and structura l analysis of surface protein antigen I/II (SpaA) of Streptococcus sobrinus. Infect Immun, 1991,59(8):2677
[6] Tokuda M, Okahashi N, Takahashi I, et al. Complete nucleotide sequence of the gene for a surface protein antigen of Stre ptococcus sobrinus. Infect Immun, 1991,59(9):3309
[7] Russell RR. The application of molecular genetics to the microbiology of dental caries. Caries Res,1994,28(2):69
, http://www.100md.com
[8] 王槐春,编著.蛋白质与核酸序列分析基础. 北京：人民军医出版社，1994 ,113
[9] 林万明,主编. 医学分子生物学进展. 北京：中国科学技术出版社，1991. 685
[10] Mary K, Mc Gavin H, Lee SF. Role of the charged tail in localizat ion of a surface protein antigen of Streptococcus mutans. J Bacteriol,1996,178 (2):801
[11] Murakami Y, Yamashita Y, Nakano Y, et al. Role of the charged tail in localization of a surface protein antigen of Streptococcus mutans. Infect Immun,1997,65(4):1531
, http://www.100md.com
[12] 刘建国，刘天佳，周学东. 国外医学口腔分册，1997,24(3)：131
[13] Crowlefy PJ, Brady LJ,Piacentini DA, et al. Identification of a salivary agglutinin-binding domain within cell surface adhesin P1 of Streptoc occus mutans. Infect Immun, 1993,61(4):1547
[14] Duan Y,Fisher E, Malamud D, et al. Calcium-binding properties of SSP-5, the Streptococcus gordonii M5 receptor for salivary agglutinin. Infect Immun, 1994,62(12):5220
, http://www.100md.com
[15] Senpuku H, Hzima T, Yamaguchi Y, et al. Immunogenicity of peptides coupled with multiple T-cell epitopes of a surface protein antigen of Streptococcus mutans. Immunology, 1996,88:275
[16] Homonylo-McGavin MK, Lee SF. Role of the C terminus in antigen P 1 surface localization in Streptococcus mutans and two related cocci. J Bacterio l, 1996, 178:801
收稿日期：1998-04-29, 百拇医药
单位：汪喻忠(湖北医科大学口腔医学院, 湖北 武汉430079)；刘建国(华西医科大学口腔医 学院, 四川 成都 610041)；樊明文(湖北医科大学口腔医学院, 湖北 武汉430079)
关键词：变形链球菌； 表面蛋白； 分子结构； 龋病
牙体牙髓牙周病学杂志000336 【中图号】 R781.1 【文献标识码】 A
【文章编号】 1005-2593(20 00)03-0174-03
变形链球菌表面蛋白(surface protein antigen of S.mutans，PAc) 又称为表面蛋白 P1、AgⅠ/Ⅱ、PAg、SpaA、SA等，是一类结构和功能十分相似的蛋白质家族，是致龋变链菌 (mutans streptococcus)的重要毒力因子之一，在细菌对牙面的初始粘附中起着重 要作用。并且具有良好的免疫原性，可诱导机体的保护性免疫应答。近年来，在PAc及其类 似蛋白的遗传学方面做了大量的研究工作，对其基因和蛋白分子结构、结构与功能的关系有 了进一步的了解。
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1 基因克隆和核酸序列分析
Okahashi等[1]克隆了PAc的编码基因pac由5169bp组成，编码1565个 氨基酸组成的PAc蛋白。Lee等[2]从变链菌全染色体基因库中筛选出包含P1基因spa P的克隆 子。Kelly等[3]发现 spaP由4683bp组成，编码1561个氨基酸的蛋白质。Sommer等 [4]从变链菌OMZ175中克隆出编码SR蛋白的基因由4667bp组成，表达Mr 19×1 04的蛋白质。Lapolla[5]测定spaA的编码基因spaA由4684bp组成，编码1 528 个氨 基酸的蛋白，而Tokuda等[6]测定的spaA则由4689bp组成，编码1566个氨基酸的蛋 白。尽管各位学者报道的基因组成碱基数、限制性酶切位点和编码蛋白的分子量大小不一致 ，但其核苷酸和蛋白序列均有高度的同源性。
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2 蛋白分子结构与功能
2.1 信号肽
原核和真核细胞分泌蛋白质前体的导向序列称信号肽(signal peptide)。导向序列是蛋白质前体N端的一段序列，它指导蛋白质定位到不同的亚细胞器中[6]。P1分子N端1 ～38位残 基是信号肽序列[1，3，6]，Lapolla推测信号肽序列是1～50位残基[5]。 它们具有信号肽的典型特征，即有一个带电荷区、紧接其后的疏水区和一个极性C端区域，C 末端存在信号肽酶切位点。目前，大多数学者认为信号肽序列引导蛋白质由细胞内向细胞外 转移的机制是环模式。即信号肽序列带正电荷的氨基末端与带负电荷的细胞质膜内侧结合， 然后信号肽序列的疏水 区插入疏水的膜双脂层，形成环或发夹型的结构。随着新生肽链的延伸，环向周质的面不断 扩大，信号肽断裂位点暴露于膜外侧表面而被酶切除，多肽链释入周质空间，信号肽序列 仍留在细胞质膜[7～9]。
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2.2 粘附功能区[10～12 、16、17]
2.2.1 位于分子N端包含A区的序列中大多数学者提出P1分子与唾液蛋白成分粘结是N端含A区的片段介导的。证据有：①与P1分子N端序列一致，包含A区的基因工程多肽 与 唾液糖蛋白(SGPs)连接效率最高，与中间区段序列一致的基因工程多肽只有中等程度 的粘 接反应，与C端一致的多肽反应弱；②与N端一致多肽和与319～335，401～417位氨基酸序列 一致的合成肽明显抑制了P1与SGPs的粘接反应；③N端39～864位氨基酸片段与唾液成分具有 高度亲和力；④含A区多肽的麦芽糖结合蛋白——多肽复合体强烈抑制了变链菌对唾液凝集 素 (SAg)包被羟基磷灰石(HA)的粘附，这种粘附抑制作用是线性剂量依赖性的；⑤AgⅠ/Ⅱ 与唾液包被HA粘接反应被天然或重组的包含A区N端多肽抑制，而C端、中间区域以及不含A区 的N端多肽，均不影响粘附。
2.2.2 位于分子C端。目前有两位学者提出这一观点。他们的依据是：①表达P1分子N端1～612位氨基酸的变链菌变异株丧失了粘接到SAg包被HA的能力；②切去P1 C末端254 个氨基酸能有效地阻止变链菌的粘附；③抗C端Mr为74×103片段的单克隆抗体有效地 阻止了变链菌与唾液包被HA的粘附。
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2.2.3 位于分子P区。以Munro和Kelly等为代表。其依据是：①816～1213氨基酸片段多 肽明显抑制了变链菌包被HA的粘附；②1005～1024，1025～1044，1085～1104，1095～1114 肽段含有粘附决定簇，这些决定簇部分暴露于分子表面，能与唾液成分或抗体接触。这些肽 段中存在多个替换点(substitutions),决定了微生物连接受体的特异性和菌种间的特异性 反应。
2.2.4 分子中存在多个粘附功能区。P1分子二、三级结构不清楚，在一级结构中相距较 远的位点，经分子多次折迭后聚在一起，暴露于分子表面，构成一个或多个粘附功能区。特 异性抗体与这些位点反应后可以阻断变链菌在牙面的粘附。
2.3 凝集功能区[13～15]
P1可能是SAg的受体。P1与液相SAg反应介导细菌凝集，有利于对细菌的清除；还可以促进变 链菌对其他细菌的粘附。对P1分子中凝集功能区的认识，有两种不同的看法：①粘附和凝集 是由分子中不同功能区参与的两个不同反应。因为，变链菌凝集可被乳糖和岩藻糖抑制，而 粘 附被氨基糖和含一级氨基集团的化合物抑制。②粘附和凝集是由分子中相同的功能区介导的 ，即粘附功能区同时具有凝集功能。因为，含有A区的融合蛋白可以同时抑制变链菌的粘附 和凝集，并可在小鼠中诱发保护性反应。Crowlefy将编码P1分子A区的DNA片段亚克隆至大肠 杆菌中，并以麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)多肽融合体方式获得表达 。这个含A区的融合蛋白对变链菌在SAg 包被的HA上的粘附和液相SAg介导的凝集均有明显的 抑制作用，而MBP或MBP-副肌球蛋白融合体均无此抑制作用。
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2.4 钙离子结合功能区(calcium-binding domains)
SAg与表面蛋白之间的相互作用，对介导细菌在口腔组织中的定居具有重要意义。而这 种相互作用需要钙离子的参与。Duan等[14]的研究证实，来自于Streptococcus go donii的表面蛋白SSP-5是一种与钙离子有高度亲和力的蛋白质。用1mmol/LⅦ螯 合剂EDTA就可 以抑制SAg介导的S.gordonii的凝集反应。只有重新加入钙离子后，凝集反应才得以恢复。进一步用同位数45Ca和荧光素钙结合染料fura2对SSP-5结合钙的特性分析表明，1mmo l/L SSP-5可以结合1mmol/L钙离子。利用基因重组技术构建表达缺失SSP-5分子C端不同数目 氨基酸残基 的克隆株，常规分离纯化这些克隆株产物，检测其结合钙的能力以及对整个分子结构的影响 ，发现当SSP-5缺失C端250个氨基酸残基时，它结合钙的能力和与SAg相互作用的能力几乎不 受影响。而缺失1168～1250位残基则导致结合钙的能力丧失。这一段序列带有极高的电荷， 但与在原核和真核生物发现的钙结合功能区没有多大的相似性。认为SSP-5分子1168～1250 残基序列是其重要的钙离子结合区。
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由于SSP-5在蛋白和基因水平与P1、PAc、PAg、SPaA等有高度同源性，推测这些分子中同样 存在类似的功能区。Crowlefy等[13]的研究结果支持这一观点，他们发现含A区多 肽的融合蛋白与SAg反应时加入EDTA，就可以阻断凝集反应的发生。
3 结语
分子生物学和现代免疫学等学科的迅猛发展和生物学实验技术的日趋完善和普及，极大地促 进了对变链菌族表面蛋白分子结构和功能的认识，为进一步阐明龋病发生的分子机理和防龋 疫苗的研制与开发提供强有力的依据。
【参考文献】
[1] Okahashi N ,Sasakawa C, Yoshikawa M, et al. Molecular characterization of a surface protein antigen gene from serotype c S treptococcus mutans, implicated in dental caries. Mol Microbiol, 1989,3(5):673
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[3] Kelly CG, Evans P, Ma JK, et al. Sequencing and characterization of the 185 kDa cell surface antigen of Strepto coccus mutans. Arch Oral Biol, 1990,35(suppl):33s
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, 百拇医药
[5] Lapolla RJ, Haron JA, Kelly CG, et al. Sequence and structura l analysis of surface protein antigen I/II (SpaA) of Streptococcus sobrinus. Infect Immun, 1991,59(8):2677
[6] Tokuda M, Okahashi N, Takahashi I, et al. Complete nucleotide sequence of the gene for a surface protein antigen of Stre ptococcus sobrinus. Infect Immun, 1991,59(9):3309
[7] Russell RR. The application of molecular genetics to the microbiology of dental caries. Caries Res,1994,28(2):69
, http://www.100md.com
[8] 王槐春,编著.蛋白质与核酸序列分析基础. 北京：人民军医出版社，1994 ,113
[9] 林万明,主编. 医学分子生物学进展. 北京：中国科学技术出版社，1991. 685
[10] Mary K, Mc Gavin H, Lee SF. Role of the charged tail in localizat ion of a surface protein antigen of Streptococcus mutans. J Bacteriol,1996,178 (2):801
[11] Murakami Y, Yamashita Y, Nakano Y, et al. Role of the charged tail in localization of a surface protein antigen of Streptococcus mutans. Infect Immun,1997,65(4):1531
, http://www.100md.com
[12] 刘建国，刘天佳，周学东. 国外医学口腔分册，1997,24(3)：131
[13] Crowlefy PJ, Brady LJ,Piacentini DA, et al. Identification of a salivary agglutinin-binding domain within cell surface adhesin P1 of Streptoc occus mutans. Infect Immun, 1993,61(4):1547
[14] Duan Y,Fisher E, Malamud D, et al. Calcium-binding properties of SSP-5, the Streptococcus gordonii M5 receptor for salivary agglutinin. Infect Immun, 1994,62(12):5220
, http://www.100md.com
[15] Senpuku H, Hzima T, Yamaguchi Y, et al. Immunogenicity of peptides coupled with multiple T-cell epitopes of a surface protein antigen of Streptococcus mutans. Immunology, 1996,88:275
[16] Homonylo-McGavin MK, Lee SF. Role of the C terminus in antigen P 1 surface localization in Streptococcus mutans and two related cocci. J Bacterio l, 1996, 178:801
收稿日期：1998-04-29, 百拇医药