SAA3启动子调控的炎症诱导表达系统体内表达及对内毒素响应特性研究
作者：太光平 汪仕良 王裴 王桂珍 黎鳌
单位：第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038
关键词：血清淀粉样蛋白启动子(SAA3)；氯霉素乙酰转移酶(CAT)；LPS；IL-6；基因治疗
第三军医大学学报991101 提要 目的：探索应用血清淀粉样蛋白启动子(SAA3)调控下游基因的可能性，利用构建的SAA3启动子/氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达载体观察SAA3启动子/增强子应用于调控目的基因体内表达特性及对体内炎症信号刺激的响应特性。方法：小鼠随机分2组，采用腹腔注射法转染脂质体/DNA复合物，48 h后LPS攻击，测定LPS攻击后不同时间CAT的诱导表达(ELISA法)及不同时间的血清IL-6水平(ELISA法)。结果：LPS攻击可诱导转染小鼠CAT在肝、肺表达，LPS活化迅速诱导肝脏CAT表达，12 h达3.74 ng/mg蛋白，36～48 h维持较高的表达水平，96 h下降；小鼠血清IL-6的水平与肝脏CAT表达显著正相关r=0.87。结论：本研究证实SAA3启动子转录调控序列(-306～+47)在体内可响应炎症刺激灵敏启动、诱导下游的报告基因CAT表达，适合于构建自适应炎症诱导性表达载体，为炎症疾病的基因治疗奠定基础及治疗新策略。
, 百拇医药
中图法分类号 R394；R996 文献标识码 A
Study of SAA3-mediated inflammation inducible expression
system in vivo and the responsive characteristics
to endotoxin
TAI Guang-ping,WANG Shi-liang,WANG Pie,WANG Gui-zhen,
(Institute of Burn Research,Southwestern Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
, 百拇医药
Abstract Objective:To study the expression characteristics of pSAA3/CAT in vivo and its responsive charcteristics to inflammatory stimulus in order to assess the possibility to modulate a target gene with the promotor of serum amyloid A3 gene (SAA3).Methods:Mice were randomized into two groups. They received intraperitoneally administration of pSAA3CAT-liposome mixture and then were challenged with LPS. CAT expression in the organs of the mice and their serum content of IL-6 were determined with ELISA.Results:LPS attack induced CAT receptor expression in the liver and lung. In the liver,CAT expression reached 3.74 ng/mg in the 12th hour after LPS attack and the peak value of CAT expression occured between the 24th and 48th hour. CAT expression began to decline after the 96th hour. The intensity of CAT expression in the liver was dependent on the dosage of LPS. The intensity of CAT expression in the liver was positively correlated to the serum content of IL-6 (r=0.87).Conclusion:Our findings suggest that the promotor of SAA3 transcription modulation sequence (-306～+46) is able to response to inflammatory stimulation sensitively,promote and induce the expression of the downstream gene of CAT,which is suitable to construct an inflammation-inducible vector. Our findings provide theoretical basis of gene therapy for inflammatory disease.
, http://www.100md.com
Key words serum amyloid A3 gene;promotor;CAT;IL-6;gene therapy;mouse
急性相反应蛋白(Acute responsive phase proteins,ARPS)是一类进化上高度保守的蛋白，能对各种炎性刺激灵敏响应。业已阐明，血液ARPS水平的升高与创伤、感染及炎症反应的严重程度成正比，并随病程的波动而波动。ARPS主要在肝细胞合成(如补体C3、抗胰蛋白酶a-AT)，其中血清淀粉样蛋白启动子(Serum amyloid A3，SAA3)既可表达于肝细胞，也表达于肝外单核细胞系统。SAA3启动子存在IL-1、IL-6激活应答元件[1]。因此，利用ARPS基因启动子能对病理信号迅速响应的特性，就可能使其调节的目的基因表达随疾病的病理生理信号(炎性反应水平)变化而改变，受疾病病理过程自动控制，为解决基因治疗中目的基因表达的时机和表达水平动态控制这关键问题将提供一极好的治疗基因调节策略[2]。本实验选用含SAA3启动子(-306～+47)调节序列及报告基因氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicol acetyltransferase,CAT)的真核表达质粒(PSAA3CAT3)，观察SAA3启动子/增强子对报告基因调控作用及对体内炎症信号及刺激的响应特性，探索应用SAA3体内调控基因表达的可能性。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物 BALB/C小鼠，雌雄不限，体重18～25 g，本校实验动物中心提供。
1.2 表达载体
PSAA3CAT3为一穿梭质粒，含鼠SAA3启动区(-306～+47)转录调节序列，SAA3启动子下游为CAT编码区及SV40 poly A序列，系载体pBLCAT3 (EMBL/GenBank编号X64409)的衍生载体，该载体由日本Kanazawa大学Yamamoto教授惠赠。常规质粒转化(DH5a大肠杆菌)及碱裂解法抽提、纯化质粒DNA[3]。
1.3 体内基因导入
BALB/C小鼠随机分成两组，实验组(PSAA3CAT3 DNA+LPS攻击组)及对照组(PSAA3CAT3 DNA组)，实验分3次进行，实验组21只，对照组14只。实验组每只小鼠腹腔注射0.5 ml含DNA 20 μg的DNA脂质体复合物及生理盐水，实验组同时注射250 μgLPS(Ecoli O111 B4 Sigma)，DOTAP脂质体购自Boehringer Mannheim公司，对照组单纯腹腔注射PSAA3CAT3 DNA/脂质体复合物及生理盐水。不同时相点12、24、36、48、72、96、120 h，取眼眶血，取肝、肾、脾、肺、肠，液氮冻存待测。
, 百拇医药
1.4 氯霉素乙酰转移酶CAT的测定
收集不同时相点组织用0.25 mmol/L Tris缓冲液冰浴中匀浆，反复冻融3次，12000×g离心沉淀，取上清。Lowery法定蛋白含量，CAT酶联免疫试剂药盒(Boehringer Mannheim公司)测定CAT蛋白水平。
1.5 血清IL-6的测定
收集不同时相点血清，用IL-6酶联免疫试剂药盒(第四军医大学免疫教研室提供)，酶标仪测定OD值，估计样品IL-6含量。
1.6 统计学分析
所有数据x±s表示，以t检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 转染小鼠体内脏器CAT表达分布
, 百拇医药
LPS攻击可诱导转染CAT在肝、肺表达，而未能在脾、肾、肠及血清检测到CAT表达，该方法CAT检测下限为5pg，见表1。
表1 LPS攻击不同脏器报告基因CAT表达水平
Tab 1 LPS induced CAT expression in different
organs in vivo
CAT(ng/mg protein)
Liver
Lung
Spleen
Kidney
, http://www.100md.com
Intestine
Serum
CAT
16.26±3.25
3.71±2.43
-
-
-
-
2.2 肝脏CAT诱导表达的时间动态分析
LPS活化迅速诱导肝脏CAT表达，12 h达3.74 ng/mg蛋白，36～48 h维持较高的表达水平，96 h下降，120 h接近对照组水平(2.741.80 ng/mg蛋白)，见表2。表2 LPS诱导肝脏报告基因CAT表达动态分析(CAT ng/mg)
, 百拇医药
Tab 2 Kinetics of CAT expression in liver induced by LPS 12 h
24 h
36 h
48 h
72 h
96 h
120 h
3.72±1.28
9.25±3.86
18.28±6.32
16.60±5.18
, 百拇医药
8.54±3.36
5.43±1.08
3.04±1.10
2.3 肝脏CAT诱导表达的剂量效应关系
不同剂量内毒素攻击小鼠，结果显示100 μg的内毒素48 h已显著激活、启动了CAT基因的表达，与200 μg、300 μg剂量组间无显著差异(P>0.05)，见表3。表3 LPS诱导肝脏CAT表达的剂量-效应关系
Tab 3 Dose-dependent expression of CAT
in liver induced by LPS
LPS(μg/mouse)
, http://www.100md.com
25
50
100
200
300
CAT(ng/mg)
8.62±1.53
11.88±3.80
15.52±5.44
17.08±7.59
17.34±6.21
2.4 小鼠血清炎症介质水平与CAT诱导表达的相关分析
, http://www.100md.com
相关分析显示LPS攻击肝脏CAT表达与小鼠血清IL-6的水平显著正相关r=0.87，见图1。
图1 肝脏CAT表达与血清IL-6水平的相关分析
Fig 1 Correlation analysis of hepatic CAT expression
and serum IL-6 level
3 讨论
目前普遍采用的基因治疗载体其目的基因的表达受载体自带启动子自发激活，表达不受限制，不能解决目的基因表达的时机和表达水平动态控制这一关键问题，难于符合临床要求(可控制性基因治疗)。急性相反应是生物界较普遍的一种对各种炎性打击(创伤、感染)的应答及保护性反应。业已阐明血清急性相反应产物(C-RP)、小鼠血清淀粉样蛋白(SAA)的表达正比与疾病(感染、创伤)的严重程度，随疾病病程的变化而波动。SAA在LPS攻击后24 h后血清水平增加1 000倍；体外20%的单核细胞上清诱导的肝细胞HepG2 SAA mRNA表达增加150～224倍(6～24 h)及375倍(48 h)。其中SAA3是唯一既能在肝细胞合成，亦在肝外细胞如巨噬细胞表达的SAA蛋白[4]。SAA3能表达于多种细胞系统的特性对炎性疾病基因治疗有独特意义。本研究选用的SAA3启动子调节序列(-306～+47)，其包括了外显子Ⅰ，邻近转录起点的31 bp的保守序列TATA盒子，含有C/EBP增强子结合蛋白元件，NF-KB结合元件(-164～-155 ATTTCTGGAAATGCC)、NF-IL-6(IL-6核因子)作用元件及肝组织特异性增强子元件(-96～-38)[5]。本试验证明腹腔注射转染CAT基因主要在肝脏诱导表达，肺有低水平表达，而脾、肾、肠及血液均无可测水平的CAT表达。CAT体内分布特点与该表达体系中启动子/增强子组织特异性元件及脂质体分布特点有关。LPS攻击12 h小鼠肝CAT开始上升，36～48 h维持在较高水平，至120 h回降，该结果与小鼠内源性SAA水平峰值时间相似[6]。本试验SAA3启动子/增强子调节CAT体内表达有诱导表达特性。LPS活化36～48 h，肝CAT表达增加6.71～7.40倍，CAT表达水平与LPS剂量有关，但不同剂量LPS诱导CAT表达水平个体变异较大。IL-6被认为是肝急性期蛋白的主要活化因子，LPS攻击组小鼠血清IL-6水平与CAT表达水平正相关，相关系数r=0.87。说明内源性细胞SAA3启动子调节元件可有效指导下游目的基因在体内表达，其表达水平依赖于炎症介质水平，提示用急性期反应蛋白SAA3启动子调控目的基因表达的策略是可行的。
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600140)
Foundation item: National Natural Science Foundation of China(39600140)
作者简介：太光平，男，31岁，主治医师，博士
参考文献
[1] Rygg M,Husby G,Marhaug G. Differential expression of rabbit serum amyloid A genes in response to various inflammatory agents[J]. Scand J Immunol,1993,38(5):417-422.
[2] Brigham K L,Canonico A E,Meyrick B O,et al. Gene therapy for inflammatory diseases[J].Prog Clin Biol Res,1994,388(15):361-365.
, 百拇医药
[3] 太光平，王 裴，陈 渝，等.培养细胞SAA3启动子调控的基因表达及对炎症信号的响应特性研究[J].第三军医大学学报，1999，21(10)：705-708.
[4] Ray B K,Ray A. Functional NF-kappa B element in rabbit serum amyloid A gene and its role in acute phase induction[J]. Biochem Biophys Res Commun,1993,193(3):1159-1167.
[5] Uhlar C M,Grehan S,Steel D M,et al. Use of the acute phase serum amyloid A2(SAA2) gene promoter in the analysis of pro- and anti-inflammatory mediators:Diffe-rential kinetics of SAA2 promoter induction by IL-1 beta and TNF-alpha compared to IL-6[J]. Methods Immunomethods,1997,203(6):123-130.
[6] Varley A W,Geiszler S M,Gaynor R B,et al. A two-component expression system that responds to inflammatory stimuli in vivo[J]. Nat Biotechnol,1997,15(10):1002-1006.
收稿日期：1998-10-14；修回日期：1999-08-06, 百拇医药
单位：第三军医大学附属西南医院烧伤研究所，重庆 400038
关键词：血清淀粉样蛋白启动子(SAA3)；氯霉素乙酰转移酶(CAT)；LPS；IL-6；基因治疗
第三军医大学学报991101 提要 目的：探索应用血清淀粉样蛋白启动子(SAA3)调控下游基因的可能性，利用构建的SAA3启动子/氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达载体观察SAA3启动子/增强子应用于调控目的基因体内表达特性及对体内炎症信号刺激的响应特性。方法：小鼠随机分2组，采用腹腔注射法转染脂质体/DNA复合物，48 h后LPS攻击，测定LPS攻击后不同时间CAT的诱导表达(ELISA法)及不同时间的血清IL-6水平(ELISA法)。结果：LPS攻击可诱导转染小鼠CAT在肝、肺表达，LPS活化迅速诱导肝脏CAT表达，12 h达3.74 ng/mg蛋白，36～48 h维持较高的表达水平，96 h下降；小鼠血清IL-6的水平与肝脏CAT表达显著正相关r=0.87。结论：本研究证实SAA3启动子转录调控序列(-306～+47)在体内可响应炎症刺激灵敏启动、诱导下游的报告基因CAT表达，适合于构建自适应炎症诱导性表达载体，为炎症疾病的基因治疗奠定基础及治疗新策略。
, 百拇医药
中图法分类号 R394；R996 文献标识码 A
Study of SAA3-mediated inflammation inducible expression
system in vivo and the responsive characteristics
to endotoxin
TAI Guang-ping,WANG Shi-liang,WANG Pie,WANG Gui-zhen,
(Institute of Burn Research,Southwestern Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038)
, 百拇医药
Abstract Objective:To study the expression characteristics of pSAA3/CAT in vivo and its responsive charcteristics to inflammatory stimulus in order to assess the possibility to modulate a target gene with the promotor of serum amyloid A3 gene (SAA3).Methods:Mice were randomized into two groups. They received intraperitoneally administration of pSAA3CAT-liposome mixture and then were challenged with LPS. CAT expression in the organs of the mice and their serum content of IL-6 were determined with ELISA.Results:LPS attack induced CAT receptor expression in the liver and lung. In the liver,CAT expression reached 3.74 ng/mg in the 12th hour after LPS attack and the peak value of CAT expression occured between the 24th and 48th hour. CAT expression began to decline after the 96th hour. The intensity of CAT expression in the liver was dependent on the dosage of LPS. The intensity of CAT expression in the liver was positively correlated to the serum content of IL-6 (r=0.87).Conclusion:Our findings suggest that the promotor of SAA3 transcription modulation sequence (-306～+46) is able to response to inflammatory stimulation sensitively,promote and induce the expression of the downstream gene of CAT,which is suitable to construct an inflammation-inducible vector. Our findings provide theoretical basis of gene therapy for inflammatory disease.
, http://www.100md.com
Key words serum amyloid A3 gene;promotor;CAT;IL-6;gene therapy;mouse
急性相反应蛋白(Acute responsive phase proteins,ARPS)是一类进化上高度保守的蛋白，能对各种炎性刺激灵敏响应。业已阐明，血液ARPS水平的升高与创伤、感染及炎症反应的严重程度成正比，并随病程的波动而波动。ARPS主要在肝细胞合成(如补体C3、抗胰蛋白酶a-AT)，其中血清淀粉样蛋白启动子(Serum amyloid A3，SAA3)既可表达于肝细胞，也表达于肝外单核细胞系统。SAA3启动子存在IL-1、IL-6激活应答元件[1]。因此，利用ARPS基因启动子能对病理信号迅速响应的特性，就可能使其调节的目的基因表达随疾病的病理生理信号(炎性反应水平)变化而改变，受疾病病理过程自动控制，为解决基因治疗中目的基因表达的时机和表达水平动态控制这关键问题将提供一极好的治疗基因调节策略[2]。本实验选用含SAA3启动子(-306～+47)调节序列及报告基因氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicol acetyltransferase,CAT)的真核表达质粒(PSAA3CAT3)，观察SAA3启动子/增强子对报告基因调控作用及对体内炎症信号及刺激的响应特性，探索应用SAA3体内调控基因表达的可能性。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物 BALB/C小鼠，雌雄不限，体重18～25 g，本校实验动物中心提供。
1.2 表达载体
PSAA3CAT3为一穿梭质粒，含鼠SAA3启动区(-306～+47)转录调节序列，SAA3启动子下游为CAT编码区及SV40 poly A序列，系载体pBLCAT3 (EMBL/GenBank编号X64409)的衍生载体，该载体由日本Kanazawa大学Yamamoto教授惠赠。常规质粒转化(DH5a大肠杆菌)及碱裂解法抽提、纯化质粒DNA[3]。
1.3 体内基因导入
BALB/C小鼠随机分成两组，实验组(PSAA3CAT3 DNA+LPS攻击组)及对照组(PSAA3CAT3 DNA组)，实验分3次进行，实验组21只，对照组14只。实验组每只小鼠腹腔注射0.5 ml含DNA 20 μg的DNA脂质体复合物及生理盐水，实验组同时注射250 μgLPS(Ecoli O111 B4 Sigma)，DOTAP脂质体购自Boehringer Mannheim公司，对照组单纯腹腔注射PSAA3CAT3 DNA/脂质体复合物及生理盐水。不同时相点12、24、36、48、72、96、120 h，取眼眶血，取肝、肾、脾、肺、肠，液氮冻存待测。
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1.4 氯霉素乙酰转移酶CAT的测定
收集不同时相点组织用0.25 mmol/L Tris缓冲液冰浴中匀浆，反复冻融3次，12000×g离心沉淀，取上清。Lowery法定蛋白含量，CAT酶联免疫试剂药盒(Boehringer Mannheim公司)测定CAT蛋白水平。
1.5 血清IL-6的测定
收集不同时相点血清，用IL-6酶联免疫试剂药盒(第四军医大学免疫教研室提供)，酶标仪测定OD值，估计样品IL-6含量。
1.6 统计学分析
所有数据x±s表示，以t检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 转染小鼠体内脏器CAT表达分布
, 百拇医药
LPS攻击可诱导转染CAT在肝、肺表达，而未能在脾、肾、肠及血清检测到CAT表达，该方法CAT检测下限为5pg，见表1。
表1 LPS攻击不同脏器报告基因CAT表达水平
Tab 1 LPS induced CAT expression in different
organs in vivo
CAT(ng/mg protein)
Liver
Lung
Spleen
Kidney
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Intestine
Serum
CAT
16.26±3.25
3.71±2.43
-
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2.2 肝脏CAT诱导表达的时间动态分析
LPS活化迅速诱导肝脏CAT表达，12 h达3.74 ng/mg蛋白，36～48 h维持较高的表达水平，96 h下降，120 h接近对照组水平(2.741.80 ng/mg蛋白)，见表2。表2 LPS诱导肝脏报告基因CAT表达动态分析(CAT ng/mg)
, 百拇医药
Tab 2 Kinetics of CAT expression in liver induced by LPS 12 h
24 h
36 h
48 h
72 h
96 h
120 h
3.72±1.28
9.25±3.86
18.28±6.32
16.60±5.18
, 百拇医药
8.54±3.36
5.43±1.08
3.04±1.10
2.3 肝脏CAT诱导表达的剂量效应关系
不同剂量内毒素攻击小鼠，结果显示100 μg的内毒素48 h已显著激活、启动了CAT基因的表达，与200 μg、300 μg剂量组间无显著差异(P>0.05)，见表3。表3 LPS诱导肝脏CAT表达的剂量-效应关系
Tab 3 Dose-dependent expression of CAT
in liver induced by LPS
LPS(μg/mouse)
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25
50
100
200
300
CAT(ng/mg)
8.62±1.53
11.88±3.80
15.52±5.44
17.08±7.59
17.34±6.21
2.4 小鼠血清炎症介质水平与CAT诱导表达的相关分析
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相关分析显示LPS攻击肝脏CAT表达与小鼠血清IL-6的水平显著正相关r=0.87，见图1。
图1 肝脏CAT表达与血清IL-6水平的相关分析
Fig 1 Correlation analysis of hepatic CAT expression
and serum IL-6 level
3 讨论
目前普遍采用的基因治疗载体其目的基因的表达受载体自带启动子自发激活，表达不受限制，不能解决目的基因表达的时机和表达水平动态控制这一关键问题，难于符合临床要求(可控制性基因治疗)。急性相反应是生物界较普遍的一种对各种炎性打击(创伤、感染)的应答及保护性反应。业已阐明血清急性相反应产物(C-RP)、小鼠血清淀粉样蛋白(SAA)的表达正比与疾病(感染、创伤)的严重程度，随疾病病程的变化而波动。SAA在LPS攻击后24 h后血清水平增加1 000倍；体外20%的单核细胞上清诱导的肝细胞HepG2 SAA mRNA表达增加150～224倍(6～24 h)及375倍(48 h)。其中SAA3是唯一既能在肝细胞合成，亦在肝外细胞如巨噬细胞表达的SAA蛋白[4]。SAA3能表达于多种细胞系统的特性对炎性疾病基因治疗有独特意义。本研究选用的SAA3启动子调节序列(-306～+47)，其包括了外显子Ⅰ，邻近转录起点的31 bp的保守序列TATA盒子，含有C/EBP增强子结合蛋白元件，NF-KB结合元件(-164～-155 ATTTCTGGAAATGCC)、NF-IL-6(IL-6核因子)作用元件及肝组织特异性增强子元件(-96～-38)[5]。本试验证明腹腔注射转染CAT基因主要在肝脏诱导表达，肺有低水平表达，而脾、肾、肠及血液均无可测水平的CAT表达。CAT体内分布特点与该表达体系中启动子/增强子组织特异性元件及脂质体分布特点有关。LPS攻击12 h小鼠肝CAT开始上升，36～48 h维持在较高水平，至120 h回降，该结果与小鼠内源性SAA水平峰值时间相似[6]。本试验SAA3启动子/增强子调节CAT体内表达有诱导表达特性。LPS活化36～48 h，肝CAT表达增加6.71～7.40倍，CAT表达水平与LPS剂量有关，但不同剂量LPS诱导CAT表达水平个体变异较大。IL-6被认为是肝急性期蛋白的主要活化因子，LPS攻击组小鼠血清IL-6水平与CAT表达水平正相关，相关系数r=0.87。说明内源性细胞SAA3启动子调节元件可有效指导下游目的基因在体内表达，其表达水平依赖于炎症介质水平，提示用急性期反应蛋白SAA3启动子调控目的基因表达的策略是可行的。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600140)
Foundation item: National Natural Science Foundation of China(39600140)
作者简介：太光平，男，31岁，主治医师，博士
参考文献
[1] Rygg M,Husby G,Marhaug G. Differential expression of rabbit serum amyloid A genes in response to various inflammatory agents[J]. Scand J Immunol,1993,38(5):417-422.
[2] Brigham K L,Canonico A E,Meyrick B O,et al. Gene therapy for inflammatory diseases[J].Prog Clin Biol Res,1994,388(15):361-365.
, 百拇医药
[3] 太光平，王 裴，陈 渝，等.培养细胞SAA3启动子调控的基因表达及对炎症信号的响应特性研究[J].第三军医大学学报，1999，21(10)：705-708.
[4] Ray B K,Ray A. Functional NF-kappa B element in rabbit serum amyloid A gene and its role in acute phase induction[J]. Biochem Biophys Res Commun,1993,193(3):1159-1167.
[5] Uhlar C M,Grehan S,Steel D M,et al. Use of the acute phase serum amyloid A2(SAA2) gene promoter in the analysis of pro- and anti-inflammatory mediators:Diffe-rential kinetics of SAA2 promoter induction by IL-1 beta and TNF-alpha compared to IL-6[J]. Methods Immunomethods,1997,203(6):123-130.
[6] Varley A W,Geiszler S M,Gaynor R B,et al. A two-component expression system that responds to inflammatory stimuli in vivo[J]. Nat Biotechnol,1997,15(10):1002-1006.
收稿日期：1998-10-14；修回日期：1999-08-06, 百拇医药