白色念珠菌基因多态性分析
作者：韦莉萍 桂稀恩 杨自成
单位：510315 解放军广州医学高等专科学校(韦莉萍)；湖北医科大学附属第二医院(桂稀恩、杨自成)
关键词：
中华传染病杂志980414 80年代末与80年代初相比，院内真菌感染率明显增加。白色念珠菌是院内真菌感染最常见的致病菌，为研究白色念珠菌医院内感染的流行病学，查明感染源和感染途径，本实验通过真菌限制性内切酶基因多态性分析，对白色念珠菌感染方式作初步探讨。
材料与方法
一、临床资料与菌株来源
实验菌株来自住院患者血、尿、粪、痰等临床标本，将标本接种于血平皿或沙氏培养基(血、胸水、腹水接种于肉汤增菌培养基)25～35℃温育24～48小时，涂片镜检，有真菌生长时，做人血清牙管试验、厚膜孢子形成试验及API20C系统鉴定到种，冻干保存于4℃冰箱。以分离到的菌株为线索，通过访视患者与查阅病例，按照全国院内感染诊断标准确定是否为院内感染。
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二、限制性内切酶EcoRI酶切方法
(一) 菌株复活 将1.5ml沙氏液体培养基加入冻干保存菌株的安瓿内，35℃，24小时复活后转种于沙氏固体培养基。
(二) 真菌增菌培养 采用YEPG液体培养基(酵母浸膏、蛋白胨、葡萄糖)，取两菌环新鲜菌落溶于YEPG液体培养基中，37℃摇动培养24小时。
(三) 真菌破壁 参照文献[1，2]，菌液离心后，用生理盐水和600mmol/L氯化钾各洗一次，用蜗牛酶消化，获取原生质。
(四) DNA提取 参照文献[3，4]，用2% SDS裂解，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)缓慢混匀，离心后用大口径吸管吸取上清，反复抽提直到界面无蛋白，用乙醇沉淀DNA，脱盐脱水，溶于适量TE中，4℃保存。
(五) DNA EcoRI限制性内切酶酶切 按常规法操作[5]。
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(六) 琼脂糖凝胶电泳 0.8%琼脂糖，于TBE电泳缓冲液中，以1.0～2.5MV电压电泳过夜，于波长300～360nm紫外透射仪下照相观察。
结 果
一、检出结果
检出真菌262株，占检出病原菌的15.2%，所检出的真菌包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑球拟酵母菌、皮状毛孢子菌、曲霉菌，共五属九种，其中白色念珠菌最为常见，占72.8%。同期发生真菌院内感染91例，占院内感染的8.7%。
二、白色念珠菌酶切基因分型结果
本研究两年间，4例患者反复发生白色念珠菌感染，不同时期从粪、便、痰、咽拭标本中分离到白色念珠菌12株，从5例多部位感染患者的血、尿、粪、痰、伤口分泌物中分离到白色念珠菌13株。对25株白色念珠菌进行EcoRI限制性内切酶基因分型，不同菌株分别能切出4～9条带，分为8个基因型。分析结果表明，9例患者中，仅2例患者的菌株具有相同的基因型，这两名患者均为呼吸道多次感染且同一病区不同时期的住院患者，其他患者之间基因型均不相同。而同一患者不同部位分离到的菌株均具有相同的基因型。
, 百拇医药
讨 论
近年来，真菌院内感染尤其是白色念珠菌造成的院内感染日益增加，本研究期间真菌院内感染占同期院内感染的8.68%，与美国报道的10.6%[6]接近，随着各种危重患者的不断增加以及广谱抗生素和各种侵袭性操作手段的广泛应用，在我国重视真菌院内感染已经迫在眉睫。
在院内感染研究中，一个重要的问题是如何确定感染源和传播途径。只有明确了病原菌的感染方式，才能采取有效的预防和控制措施，因而对微生物的分类就不能仅限于种间水平，还必须深入到种内即亚种，以便更精确了解其流行病学意义。以往真菌的分型方法主要依赖于血清型、酵母杀菌系统、抗性谱[7]等生物学方法，但这些方法易受环境及人为因素的影响而缺乏满意的稳定性和重复性，并且生物学方法也不能精细分型，分辨率较低。DNA酶切多态性分析(RFLP)通过一种或多种限制性内切酶对所提取的DNA进行酶切，根据不同菌种其酶切的DNA指纹图谱不同，从本质上区别种间差异。该方法结果稳定，重复性好，不需要特殊的仪器设备，是一种简单而可靠的方法，1987年Schesre等[8]首先将这种方法应用于念珠菌分型。近年来，国外学者将这种方法应用于细菌、真菌感染源及传播途径调查，取得了巨大成功，对真菌感染的流行病学研究起到积极的推动作用。
, 百拇医药
本研究结果表明：同一患者不同感染部位或不同时期感染分离的白色念珠菌具有相同基因型，而不同患者之间的基因型基本不同，提示这些患者的感染源来自患者自身的正常菌群，说明白色念珠菌内源性感染的可能性大。所以对于高危患者如ICU病区重症患者，恶性肿瘤晚期及放、化疗患者，血液病，器官移植等患者，预防用抗真菌药，减少定植，是控制白色念珠菌内源性院内感染的合理措施。
(山东医科大学附属医院李春阳博士给予大力支持，特此志谢)
参考文献
1 Torres-Bauza,Riggsby WS. Protopiasts from yeast and mycelial form of Candida albicans. J Gen Microbiol,1990，119：341-349.
2 戴文英，孙亦新.蜗牛酶对3种致病性真菌细胞壁作用的研究.中华皮肤科杂志，1985，18：129-130.
, http://www.100md.com
3 Kado CI, Skoog WA, Beck WS, et al. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteriol,1981，145：1365-1373.
4 Glee PM, Russeii PJ, Welsch JC, et al.Methods for DNA extraction from Candida albicans. Anal Biochem,1987，164：207-213.
5 金冬雁，等译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992. 259-262.
6 Weber DJ, Sobel JD, Zervos MI, et al.Relative frequence of nosocomial pathogens at a university hospital during the decade 1980～1990.Am J Infect Control,1992,20：192-197.
, http://www.100md.com
7 Pafaller MA. Epidemiological tying
motheds for mycoses. Clin Infect Dis,1992,14(suppl):s4-13.
8 Schesre S, Stevens DA. Application of DNA typing methods to epidemiology and taxonomy of Candida species. J Clin Microbiol,1987,25:675-679.
(收稿：1997-04-17 修回：1998-02-28), 百拇医药
单位：510315 解放军广州医学高等专科学校(韦莉萍)；湖北医科大学附属第二医院(桂稀恩、杨自成)
关键词：
中华传染病杂志980414 80年代末与80年代初相比，院内真菌感染率明显增加。白色念珠菌是院内真菌感染最常见的致病菌，为研究白色念珠菌医院内感染的流行病学，查明感染源和感染途径，本实验通过真菌限制性内切酶基因多态性分析，对白色念珠菌感染方式作初步探讨。
材料与方法
一、临床资料与菌株来源
实验菌株来自住院患者血、尿、粪、痰等临床标本，将标本接种于血平皿或沙氏培养基(血、胸水、腹水接种于肉汤增菌培养基)25～35℃温育24～48小时，涂片镜检，有真菌生长时，做人血清牙管试验、厚膜孢子形成试验及API20C系统鉴定到种，冻干保存于4℃冰箱。以分离到的菌株为线索，通过访视患者与查阅病例，按照全国院内感染诊断标准确定是否为院内感染。
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二、限制性内切酶EcoRI酶切方法
(一) 菌株复活 将1.5ml沙氏液体培养基加入冻干保存菌株的安瓿内，35℃，24小时复活后转种于沙氏固体培养基。
(二) 真菌增菌培养 采用YEPG液体培养基(酵母浸膏、蛋白胨、葡萄糖)，取两菌环新鲜菌落溶于YEPG液体培养基中，37℃摇动培养24小时。
(三) 真菌破壁 参照文献[1，2]，菌液离心后，用生理盐水和600mmol/L氯化钾各洗一次，用蜗牛酶消化，获取原生质。
(四) DNA提取 参照文献[3，4]，用2% SDS裂解，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)缓慢混匀，离心后用大口径吸管吸取上清，反复抽提直到界面无蛋白，用乙醇沉淀DNA，脱盐脱水，溶于适量TE中，4℃保存。
(五) DNA EcoRI限制性内切酶酶切 按常规法操作[5]。
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(六) 琼脂糖凝胶电泳 0.8%琼脂糖，于TBE电泳缓冲液中，以1.0～2.5MV电压电泳过夜，于波长300～360nm紫外透射仪下照相观察。
结 果
一、检出结果
检出真菌262株，占检出病原菌的15.2%，所检出的真菌包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑球拟酵母菌、皮状毛孢子菌、曲霉菌，共五属九种，其中白色念珠菌最为常见，占72.8%。同期发生真菌院内感染91例，占院内感染的8.7%。
二、白色念珠菌酶切基因分型结果
本研究两年间，4例患者反复发生白色念珠菌感染，不同时期从粪、便、痰、咽拭标本中分离到白色念珠菌12株，从5例多部位感染患者的血、尿、粪、痰、伤口分泌物中分离到白色念珠菌13株。对25株白色念珠菌进行EcoRI限制性内切酶基因分型，不同菌株分别能切出4～9条带，分为8个基因型。分析结果表明，9例患者中，仅2例患者的菌株具有相同的基因型，这两名患者均为呼吸道多次感染且同一病区不同时期的住院患者，其他患者之间基因型均不相同。而同一患者不同部位分离到的菌株均具有相同的基因型。
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讨 论
近年来，真菌院内感染尤其是白色念珠菌造成的院内感染日益增加，本研究期间真菌院内感染占同期院内感染的8.68%，与美国报道的10.6%[6]接近，随着各种危重患者的不断增加以及广谱抗生素和各种侵袭性操作手段的广泛应用，在我国重视真菌院内感染已经迫在眉睫。
在院内感染研究中，一个重要的问题是如何确定感染源和传播途径。只有明确了病原菌的感染方式，才能采取有效的预防和控制措施，因而对微生物的分类就不能仅限于种间水平，还必须深入到种内即亚种，以便更精确了解其流行病学意义。以往真菌的分型方法主要依赖于血清型、酵母杀菌系统、抗性谱[7]等生物学方法，但这些方法易受环境及人为因素的影响而缺乏满意的稳定性和重复性，并且生物学方法也不能精细分型，分辨率较低。DNA酶切多态性分析(RFLP)通过一种或多种限制性内切酶对所提取的DNA进行酶切，根据不同菌种其酶切的DNA指纹图谱不同，从本质上区别种间差异。该方法结果稳定，重复性好，不需要特殊的仪器设备，是一种简单而可靠的方法，1987年Schesre等[8]首先将这种方法应用于念珠菌分型。近年来，国外学者将这种方法应用于细菌、真菌感染源及传播途径调查，取得了巨大成功，对真菌感染的流行病学研究起到积极的推动作用。
, 百拇医药
本研究结果表明：同一患者不同感染部位或不同时期感染分离的白色念珠菌具有相同基因型，而不同患者之间的基因型基本不同，提示这些患者的感染源来自患者自身的正常菌群，说明白色念珠菌内源性感染的可能性大。所以对于高危患者如ICU病区重症患者，恶性肿瘤晚期及放、化疗患者，血液病，器官移植等患者，预防用抗真菌药，减少定植，是控制白色念珠菌内源性院内感染的合理措施。
(山东医科大学附属医院李春阳博士给予大力支持，特此志谢)
参考文献
1 Torres-Bauza,Riggsby WS. Protopiasts from yeast and mycelial form of Candida albicans. J Gen Microbiol,1990，119：341-349.
2 戴文英，孙亦新.蜗牛酶对3种致病性真菌细胞壁作用的研究.中华皮肤科杂志，1985，18：129-130.
, http://www.100md.com
3 Kado CI, Skoog WA, Beck WS, et al. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteriol,1981，145：1365-1373.
4 Glee PM, Russeii PJ, Welsch JC, et al.Methods for DNA extraction from Candida albicans. Anal Biochem,1987，164：207-213.
5 金冬雁，等译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992. 259-262.
6 Weber DJ, Sobel JD, Zervos MI, et al.Relative frequence of nosocomial pathogens at a university hospital during the decade 1980～1990.Am J Infect Control,1992,20：192-197.
, http://www.100md.com
7 Pafaller MA. Epidemiological tying
motheds for mycoses. Clin Infect Dis,1992,14(suppl):s4-13.
8 Schesre S, Stevens DA. Application of DNA typing methods to epidemiology and taxonomy of Candida species. J Clin Microbiol,1987,25:675-679.
(收稿：1997-04-17 修回：1998-02-28), 百拇医药