不同浓度染铅大鼠海马神经元Ca2+浓度与LTP关系的研究
作者：刘素媛 孙黎光 邢伟 刘倩 张宪
单位：刘素媛(中国医科大学基础医学院生化教研室, 沈阳 110001)；孙黎光(中国医科大学基础医学院生化教研室, 沈阳 110001)；邢伟(中国医科大学基础医学院生化教研室, 沈阳 110001)；刘倩(中国医科大学基础医学院生化教研室, 沈阳 110001)；张宪(本钢职工总医院检验科)
关键词：铅；长时程增强；钙离子浓度
中国医科大学学报000309 摘要 目的：探讨铅对大鼠海马神经元Ca2+浓度的影响及其与长时程增强(LTP)的关系。方法：断乳后Wistar大鼠自由饮用不同浓度醋酸铅溶液(0.015%,0.10%,0.15%)，建立慢性染铅动物模型。高频刺激(HFS)海马区诱发长时程变化后,分离海马神经元,测定[Ca2+]i。结果：各染铅组大鼠海马神经元[Ca2+]i 与对照组比较均明显增高(P<0.05)；血铅浓度(3.28±0.88) μmol/L以上时海马LTP产生率下降，三染铅组PS幅值均降低， LTP阴性组[Ca2+]i明显高于LTP阳性组(P<0.05)。结论：慢性染铅可使HFS后大鼠海马神经元[Ca2+]i升高，损害海马区LTP的在体诱导；铅致LTP发生率下降与海马神经元[Ca2+]i增高有关。
, 百拇医药
The Study of Relationship between Hippocampal Intraneuronal [Ca2+]i and
Long-term Potentiation in Rat Exposed to Different Concentration Lead
Liu Suyuan Sun Liguang Xing Wei Liu Qian Zhang Xian
(Department of Biochemistry, College of Basic Medical Sciences, China Medical University, Shenyang, 110001)
ABSTRACT Objective:Our aims were to study the effect of different concentration blood lead on [Ca2+]i, and to figure out the relationship between [Ca2+]i and long-term potentiation(LTP) in rat hippocampus. Methods: Chronic lead-treated animal models were acquired by feeding the male postwean Wistar rats with 0.015%,0.10%,0.15% acetate lead in drinking water for 3 months,[Ca2+]i was determined after LTP of hippocampus was induced by high-frequency stimulation (HFS). Results: [Ca2+]i of lead-treated groups was elevated significantly compared with control group; PS amplitude of lead-treated groups was decreased compared with control group. The incidence of LTP reduced when the blood lead level was more than (3.28±0.88) μmol/L, [Ca2+]i of LTP negative group was significantly higher than the positive one (P<0.05). Conclusion: Different concentration lead exposure can significantly increase [Ca2+]i and damage the inducement of LTP in rat hippocampus after HFS; The decrease of LTP incidence leaded by lead related to the elevation of hippocampal intraneuronal [Ca2+]i.
, 百拇医药
KEY WORDS lead; long-term potentiation; [Ca2+]i
海马长时程增强(long-term potentiation ,LTP)是高频刺激(high-frequency stimulation, HFS)传入纤维引起的海马突触传递效能的长时间持续性增强，是在突触水平研究学习和记忆功能的模型。文献表明[1]，铅暴露可损害大鼠LTP的诱导和维持，其机制尚未完全阐明，其中Ca2+在LTP诱导的突触机制中起十分重要的作用。本实验观察了不同浓度慢性铅暴露大鼠海马神经元[Ca2+]i 与LTP损害的关系，为探讨铅损害LTP的机制打下基础。
1 材料与方法
1.1 动物及处理 断乳后雄性Wistar大鼠48只，体重60～100 g,中国医科大学实验动物部提供。随机分为4组，取3组分别饮用0.015%、0.10%、0.15%醋酸铅水溶液，对照组饮蒸馏水， 3个月后用于各项指标检测。
, 百拇医药
1.2 HFS诱发长时程变化 将双极刺激电极插入内嗅皮层，记录电极插入海马齿状回，先记录单一刺激(7.5 V，0.1 ms，1次/min，30次)引发的群体锋电位(PS)，将每次所测幅值平均为基线值(100%)，施加HFS(100 HZ) 5 s后给予单一检验刺激，观察、记录PS变化并与基线值比较。
1.3 血铅浓度测定 原子吸收石墨炉法
1.4 海马神经元分离及[Ca2+]i测定见文献[2]。
2 结果
2.1 不同浓度铅对大鼠海马神经元[Ca2+]i及LTP的影响见表1。
2.2 染铅2、3组大鼠海马LTP与[Ca2+]i的比较
, 百拇医药
染铅2、3组大鼠血铅浓度虽然相差很大，海马LTP与[Ca2+]i的差异却不显著，将两组按LTP产生与否分组后发现：LTP阳性组[Ca2+]i(140.75±26.98)nmol/L(n=4)，低于LTP阴性组(185.30±29.56)nmol/L(n=10, t=1.98, P<0.05)。
表1 不同血铅浓度对大鼠海马神经元[Ca2+]i及LTP的影响(
±s)
Tab.1 Effect of different concentration blood lead on[Ca2+]i and LTP in rat hippocampus (±s) 分 组
, 百拇医药
n
血铅浓度
(μmol/L)
[Ca2+]i
(nmol/L)
LTP产生率
(%)
LTP增强率
(PS幅值 %)
对照组
8
0.26±0.12
, 百拇医药
101.98±30.23
87.5
135.88±25.30
染铅1组
7
0.79±0.40
129.14±28.40*
100.0
129.20±25.40
染铅2组
7
3.28±0.88
, 百拇医药
167.14±38.01**
28.6
124.72±12.96
染铅3组
7
5.49±0.92
178.45±40.58
28.6
117.81±11.31
* 与对照组及2、3组相比P<0.05；**与3组相比P>0.05
3 讨论
, 百拇医药
实验中观察到三组染铅大鼠海马神经元[Ca2+]i比对照组明显升高，说明低浓度铅可干扰[Ca2+]i平衡机制，使海马神经元[Ca2+]i不同程度增高。研究表明，细胞外Pb2+可代替Ca2+激活钙通道， Pb2+经钙通道进入细胞，细胞内微量Pb2+即可激活PKC，后者可激活细胞膜、内质网、线粒体的钙通道，使胞外Ca2+内流，内质网、线粒体Ca2+释放，导致[Ca2+]i增高[3]。Dowd等报道[Pb2+]i低于2×10-11M,并证明细胞对Pb2+的吸收是可饱和的，当血铅浓度达一定程度时[Pb2+]i不再继续增高，[Ca2+]i在相关机制的调节下建立起新的平衡。另外，钙通道还存在一个Ca2+依赖性失活机制，即通过细胞内Ca2+水平反馈调节钙通道活性，防止因过多Ca2+流入使细胞内Ca2+超载，铅对这种反馈机制的影响也会导致[Ca2+]i增高，这一作用为铅中毒引起的[Ca2+]i增高提供了更好的解释。
, 百拇医药
从表1可见，染铅1组LTP发生率未受影响，染铅2、3组LTP发生率明显下降，三组PS幅值都随血铅浓度的升高呈现不同程度下降，说明在体慢性染铅可使神经元兴奋性降低，表现为不同程度降低PS幅值，使LTP不能引出，在高铅组甚至还可观察到长时程抑制(LTD)。目前认为，LTP具有N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受体依赖性，位于突触后膜的NMDA受体通道在一定条件下开放，使胞外Ca2+内流，激活细胞内一系列生化反应，是LTP产生的前提条件。Pb2+可抑制海马神经元已激活的NMDA受体，使受体通道开放次数减少，并使之恢复减慢[4]；另一方面, Pb2+与Ca2+竞争电压依赖性钙通道上Ca2+结合位点，阻断Ca2+内流，这些作用的结果使细胞去极化时Ca2+内流减少，Ca2+介导的突触递质诱发性释放减少，从而不能充分激活下游反应，使LTP不能产生或难以维持。
, http://www.100md.com
将染铅2、3组按LTP产生与否分组后发现：LTP阴性组[Ca2+]i明显高于LTP阳性组，说明[Ca2+]i 的增高可能是导致LTP异常的重要分子基础。[Ca2+]i增高一方面可直接促进神经末梢内的突触小泡与前膜结合,引起递质释放，另一方面还可增加CaM 及CaM依赖性蛋白激酶系统活性，反馈信息传递到突触前膜，也会引起递质释放，两种作用的结果都使前膜自发性神经递质释放增多，导致后膜敏感性降低，进一步影响LTP。
总之，在本实验条件下，慢性染铅可使HFS后大鼠海马神经元[Ca2+]i升高， PS幅值下降；血铅浓度达(3.28±0.88) μmol/L以上时可严重损害海马区LTP的在体诱导，这种损害作用与海马神经元[Ca2+]i增高有关。
, 百拇医药 国家自然科学基金资助项目, 39470620
参考文献
1，时利德，蔡葵，滕国玺，等.慢性铅暴露对在体诱导年轻大鼠海马齿状回LTP的损害作用.中国应用生理学杂志， 1998,14(1):82～85
2，Dildy J，Leslie S. Ethanal inhibits NMDA-induced increases in free intracellular Ca2+ in dissociated brain cell. Brain Res，1989,499(1): 383—387
3，Pounds J G. Effect of lead intoxication on calcium homeostasis and calcium mediated cell function. Neurotoxicology， 1984,5(3):295—331
4，Busselberg D，Evans ML，Rahmann H， et al. Lead and Zinc block a voltage-activated calcium channel of aplysia neurons. J Neurophysiol，1991,65(4):786—795
收稿日期：1999-03-10, 百拇医药
单位：刘素媛(中国医科大学基础医学院生化教研室, 沈阳 110001)；孙黎光(中国医科大学基础医学院生化教研室, 沈阳 110001)；邢伟(中国医科大学基础医学院生化教研室, 沈阳 110001)；刘倩(中国医科大学基础医学院生化教研室, 沈阳 110001)；张宪(本钢职工总医院检验科)
关键词：铅；长时程增强；钙离子浓度
中国医科大学学报000309 摘要 目的：探讨铅对大鼠海马神经元Ca2+浓度的影响及其与长时程增强(LTP)的关系。方法：断乳后Wistar大鼠自由饮用不同浓度醋酸铅溶液(0.015%,0.10%,0.15%)，建立慢性染铅动物模型。高频刺激(HFS)海马区诱发长时程变化后,分离海马神经元,测定[Ca2+]i。结果：各染铅组大鼠海马神经元[Ca2+]i 与对照组比较均明显增高(P<0.05)；血铅浓度(3.28±0.88) μmol/L以上时海马LTP产生率下降，三染铅组PS幅值均降低， LTP阴性组[Ca2+]i明显高于LTP阳性组(P<0.05)。结论：慢性染铅可使HFS后大鼠海马神经元[Ca2+]i升高，损害海马区LTP的在体诱导；铅致LTP发生率下降与海马神经元[Ca2+]i增高有关。
, 百拇医药
The Study of Relationship between Hippocampal Intraneuronal [Ca2+]i and
Long-term Potentiation in Rat Exposed to Different Concentration Lead
Liu Suyuan Sun Liguang Xing Wei Liu Qian Zhang Xian
(Department of Biochemistry, College of Basic Medical Sciences, China Medical University, Shenyang, 110001)
ABSTRACT Objective:Our aims were to study the effect of different concentration blood lead on [Ca2+]i, and to figure out the relationship between [Ca2+]i and long-term potentiation(LTP) in rat hippocampus. Methods: Chronic lead-treated animal models were acquired by feeding the male postwean Wistar rats with 0.015%,0.10%,0.15% acetate lead in drinking water for 3 months,[Ca2+]i was determined after LTP of hippocampus was induced by high-frequency stimulation (HFS). Results: [Ca2+]i of lead-treated groups was elevated significantly compared with control group; PS amplitude of lead-treated groups was decreased compared with control group. The incidence of LTP reduced when the blood lead level was more than (3.28±0.88) μmol/L, [Ca2+]i of LTP negative group was significantly higher than the positive one (P<0.05). Conclusion: Different concentration lead exposure can significantly increase [Ca2+]i and damage the inducement of LTP in rat hippocampus after HFS; The decrease of LTP incidence leaded by lead related to the elevation of hippocampal intraneuronal [Ca2+]i.
, 百拇医药
KEY WORDS lead; long-term potentiation; [Ca2+]i
海马长时程增强(long-term potentiation ,LTP)是高频刺激(high-frequency stimulation, HFS)传入纤维引起的海马突触传递效能的长时间持续性增强，是在突触水平研究学习和记忆功能的模型。文献表明[1]，铅暴露可损害大鼠LTP的诱导和维持，其机制尚未完全阐明，其中Ca2+在LTP诱导的突触机制中起十分重要的作用。本实验观察了不同浓度慢性铅暴露大鼠海马神经元[Ca2+]i 与LTP损害的关系，为探讨铅损害LTP的机制打下基础。
1 材料与方法
1.1 动物及处理 断乳后雄性Wistar大鼠48只，体重60～100 g,中国医科大学实验动物部提供。随机分为4组，取3组分别饮用0.015%、0.10%、0.15%醋酸铅水溶液，对照组饮蒸馏水， 3个月后用于各项指标检测。
, 百拇医药
1.2 HFS诱发长时程变化 将双极刺激电极插入内嗅皮层，记录电极插入海马齿状回，先记录单一刺激(7.5 V，0.1 ms，1次/min，30次)引发的群体锋电位(PS)，将每次所测幅值平均为基线值(100%)，施加HFS(100 HZ) 5 s后给予单一检验刺激，观察、记录PS变化并与基线值比较。
1.3 血铅浓度测定 原子吸收石墨炉法
1.4 海马神经元分离及[Ca2+]i测定见文献[2]。
2 结果
2.1 不同浓度铅对大鼠海马神经元[Ca2+]i及LTP的影响见表1。
2.2 染铅2、3组大鼠海马LTP与[Ca2+]i的比较
, 百拇医药
染铅2、3组大鼠血铅浓度虽然相差很大，海马LTP与[Ca2+]i的差异却不显著，将两组按LTP产生与否分组后发现：LTP阳性组[Ca2+]i(140.75±26.98)nmol/L(n=4)，低于LTP阴性组(185.30±29.56)nmol/L(n=10, t=1.98, P<0.05)。
表1 不同血铅浓度对大鼠海马神经元[Ca2+]i及LTP的影响(
±s)Tab.1 Effect of different concentration blood lead on[Ca2+]i and LTP in rat hippocampus (
±s) 分 组, 百拇医药
n
血铅浓度
(μmol/L)
[Ca2+]i
(nmol/L)
LTP产生率
(%)
LTP增强率
(PS幅值 %)
对照组
8
0.26±0.12
, 百拇医药
101.98±30.23
87.5
135.88±25.30
染铅1组
7
0.79±0.40
129.14±28.40*
100.0
129.20±25.40
染铅2组
7
3.28±0.88
, 百拇医药
167.14±38.01**
28.6
124.72±12.96
染铅3组
7
5.49±0.92
178.45±40.58
28.6
117.81±11.31
* 与对照组及2、3组相比P<0.05；**与3组相比P>0.05
3 讨论
, 百拇医药
实验中观察到三组染铅大鼠海马神经元[Ca2+]i比对照组明显升高，说明低浓度铅可干扰[Ca2+]i平衡机制，使海马神经元[Ca2+]i不同程度增高。研究表明，细胞外Pb2+可代替Ca2+激活钙通道， Pb2+经钙通道进入细胞，细胞内微量Pb2+即可激活PKC，后者可激活细胞膜、内质网、线粒体的钙通道，使胞外Ca2+内流，内质网、线粒体Ca2+释放，导致[Ca2+]i增高[3]。Dowd等报道[Pb2+]i低于2×10-11M,并证明细胞对Pb2+的吸收是可饱和的，当血铅浓度达一定程度时[Pb2+]i不再继续增高，[Ca2+]i在相关机制的调节下建立起新的平衡。另外，钙通道还存在一个Ca2+依赖性失活机制，即通过细胞内Ca2+水平反馈调节钙通道活性，防止因过多Ca2+流入使细胞内Ca2+超载，铅对这种反馈机制的影响也会导致[Ca2+]i增高，这一作用为铅中毒引起的[Ca2+]i增高提供了更好的解释。
, 百拇医药
从表1可见，染铅1组LTP发生率未受影响，染铅2、3组LTP发生率明显下降，三组PS幅值都随血铅浓度的升高呈现不同程度下降，说明在体慢性染铅可使神经元兴奋性降低，表现为不同程度降低PS幅值，使LTP不能引出，在高铅组甚至还可观察到长时程抑制(LTD)。目前认为，LTP具有N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受体依赖性，位于突触后膜的NMDA受体通道在一定条件下开放，使胞外Ca2+内流，激活细胞内一系列生化反应，是LTP产生的前提条件。Pb2+可抑制海马神经元已激活的NMDA受体，使受体通道开放次数减少，并使之恢复减慢[4]；另一方面, Pb2+与Ca2+竞争电压依赖性钙通道上Ca2+结合位点，阻断Ca2+内流，这些作用的结果使细胞去极化时Ca2+内流减少，Ca2+介导的突触递质诱发性释放减少，从而不能充分激活下游反应，使LTP不能产生或难以维持。
, http://www.100md.com
将染铅2、3组按LTP产生与否分组后发现：LTP阴性组[Ca2+]i明显高于LTP阳性组，说明[Ca2+]i 的增高可能是导致LTP异常的重要分子基础。[Ca2+]i增高一方面可直接促进神经末梢内的突触小泡与前膜结合,引起递质释放，另一方面还可增加CaM 及CaM依赖性蛋白激酶系统活性，反馈信息传递到突触前膜，也会引起递质释放，两种作用的结果都使前膜自发性神经递质释放增多，导致后膜敏感性降低，进一步影响LTP。
总之，在本实验条件下，慢性染铅可使HFS后大鼠海马神经元[Ca2+]i升高， PS幅值下降；血铅浓度达(3.28±0.88) μmol/L以上时可严重损害海马区LTP的在体诱导，这种损害作用与海马神经元[Ca2+]i增高有关。
, 百拇医药 国家自然科学基金资助项目, 39470620
参考文献
1，时利德，蔡葵，滕国玺，等.慢性铅暴露对在体诱导年轻大鼠海马齿状回LTP的损害作用.中国应用生理学杂志， 1998,14(1):82～85
2，Dildy J，Leslie S. Ethanal inhibits NMDA-induced increases in free intracellular Ca2+ in dissociated brain cell. Brain Res，1989,499(1): 383—387
3，Pounds J G. Effect of lead intoxication on calcium homeostasis and calcium mediated cell function. Neurotoxicology， 1984,5(3):295—331
4，Busselberg D，Evans ML，Rahmann H， et al. Lead and Zinc block a voltage-activated calcium channel of aplysia neurons. J Neurophysiol，1991,65(4):786—795
收稿日期：1999-03-10, 百拇医药