16型人乳头瘤病毒E6/E7诱导角质形成细胞表达热休克蛋白70
作者：廖文俊 叶苓 刘彦仿 刘玉峰 王春梅
单位：710032西安，第四军医大学西京医院皮肤科(廖文俊 刘玉峰)；第四军医大学基础部病理学教研室(叶苓 刘彦仿)，电镜室(王春梅)
关键词：乳头瘤病毒；人热休克蛋白类角蛋白细胞转染
中华皮肤科杂志990407
【摘要】目的 了解16型人乳头瘤病毒(HPV16)E6/E7、HSP70与角质形成细胞永生化及转化之间的关系。方法 Lipofectamine介导法进行转染，以G418筛选阳性克隆，免疫印迹分析及免疫荧光双标记染色结合激光扫描共聚焦显微镜对HSP70和HPV16E6/E7在转染角质形成细胞中的表达进行了观察。结果 免疫印迹分析显示正常角质形成细胞和转染角质形成细胞均在相对分子质量70000处出现一条染色带，但转染细胞的着色深度明显强于正常细胞；激光扫描共聚焦显微镜观察也发现转染细胞中HSP70的表达明显增高，HSP70与HPV16E6/E7有共定位。结论 HPV16E6/E7可以诱导角质形成细胞中HSP70的高表达，这种高表达可能在角质形成细胞永生化甚至转化过程中具有重要作用。
, 百拇医药
Expression of 70-kD Heat Shock Protein in Keratinocytes Induced by Human Papillomavirus 16 E6/E7
LIAO Wenjun, YE Ling, LIU Yanfang, et al
. Department of Dermatology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710032
【Abstract】 Objective To investigate the relation between human papillomavirus 16 E6/E7 (HPV16 E6/E7),70000 heat shock protein (HSP70) and immortalization and transformation of keratinocytes. Methods Keratinocytes were transfected with lipofectamine and positive clones were selected by G418. The expressions of HSP70 and HPV16 E6/E7 by transfected keratinocytes were analysed by means of Western blot,double labelling immunofluorescent staining and laser-scanning confocal microscopy techniques. Results Results of Western blot analysis showed a specific band exhibiting a molecular weight of 70 000 in both normal keratinocytes and HPV16 E6/E7 transfected keratinocytes, but the staining was more intensive in transfected keratinocytes than in normal ones. The co-location of HPV16 E6/E7 and HSP70 in transfected keratinocytes were observed by laser-scanning confocal microscopy. Conclusion The high expression of HSP70 in transfected keratinocytes may be induced by HPV16 E6/E7 which suggests that HSP70 might play an important role in immortalization and even transformation of keratinocytes.
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【Key words】 Papillomavirus, human Heat-shock proteins Keratinocytes Transfection
人乳头瘤病毒(HPV)是一种嗜上皮性小DNA病毒，基因组中共有8个开放读框(ORF)，其中E6、E7ORF为调节病毒生长的编码区。已有报道将HPV16E6/E7转染角质形成细胞后可诱导角质形成细胞永生化。为了解HPVE6/E7、HSP70与角质形成细胞永生化及转化之间的关系，本实验将HPV16E6/E7癌基因转染角质形成细胞，并对转染角质形成细胞中HSP70的表达情况进行了观察。
材料和方法
(一)材料：质粒pLXSN16E6/E7由美国癌症研究中心Hutchinson教授惠赠，该质粒含16型人乳头瘤病毒E6/E7开放读框，约800bp；鼠抗人HSP70单克隆抗体(美国SantaCruz公司)，兔抗人HSP70多克隆抗体(美国Dako公司)，鼠抗HPV16E6、E7单克隆抗体，生物素化羊抗鼠IgG，FITC标记羊抗兔IgG，SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，Avidin标记TexasRed(Sigma公司)，角质形成细胞无血清培养基(KC-SFM)、Lipofectamine转染试剂盒、G418(GibcoBRL)。
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(二)方法：
1.pLXSN16E6/E7质粒的鉴定：碱裂法提取pLXSN16E6/E7质粒，以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，1%琼脂糖电泳进行鉴定。
2.基因转染：取正常成人包皮(本院门诊手术室提供)，胰酶消化法分离、培养原代皮肤角质形成细胞，用Lipofectamine介导法进行基因转染(质粒2μg,Lipofectamine10μL，转染6h)。72h后用G418(400μg/mL)对细胞进行筛选。2周后出现细胞集落(此时未转染组细胞已全部死亡)，将G418改为200μg/mL维持剂量。收集G418抗性细胞用于做下述检测。
3.免疫印迹分析：提取转染角质形成细胞及未转染角质形成细胞中的细胞内总蛋白，用紫外分光光度仪测定含量，取等量待测样品做SDSPAGE电泳，电转移至硝酸纤维素膜，分别加鼠抗人HSP70单抗、生物素化羊抗鼠IgG及SABC复合物，4-氯-1-萘酚显色。
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4.免疫荧光双标记染色及激光扫描共聚焦显微镜观察：将兔抗人HSP70多抗和鼠抗HPV16E6/E7单抗混合加至细胞铺片上，37℃孵育1h，加生物素化羊抗鼠IgG和FITC标记的羊抗兔IgG混合液，37℃孵育1h；加Avidin标记的TexasRed，孵育1h，无荧光缓冲甘油封片后在激光扫描共聚焦显微镜下观察。FITC和TexasRed的激发波长分别是488nm和568nm。
结果
1.pLXSN16E6/E7质粒的酶切鉴定：质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，1%琼脂糖电泳可见1条800bp的目的片段和载体片段(图1)，证明所获质粒确为pLXSN16E6/E7。
图1 pLXSN16E6/E7酶切鉴定P：pLXSN16E6/E7:EcoRⅠ+BamHⅠ，M：λDNA/HindⅢMarker
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2.免疫印迹分析：正常角质形成细胞及转染角质形成细胞均在相对分子质量70000处出现1条染色带，但转染组的染色深度明显强于未转染组(图2)，提示转染组细胞中HSP70的表达较未转染组明显增强。
图2 免疫印迹分析A：E6/E7转染角质形成细胞，B：正常角质形成细胞，M：Marker
3.免疫荧光双标记染色及激光扫描共聚焦显微镜观察：正常角质形成细胞内仅表达HSP70(FITC绿色荧光)，且荧光强度较弱；而pLXSN16E6/E7转染角质形成细胞中则可见到较强的FITC绿色荧光(高表达HSP70)和TexasRed红色荧光(表达HPV16E6/E7)，双标记结果可见由HSP70的绿色荧光与HPV16E6/E7的红色荧光重叠形成的黄色荧光(图3～5)。提示正常角质形成细胞可构成性表达HSP70，而转入的HPV16E6/E7在角质形成细胞中表达后，则可诱导HSP70的高表达。
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图3 E6/E7转染角质形成细胞表达HSP70(FITC绿色荧光)
图4 E6/E7转染角质形成细胞表达E6/E7(TexasRed红色荧光)
图5 转染角质形成细胞中E6/E7与HSP70共定位(黄色荧光)
讨论
由于在皮肤、口腔及宫颈鳞癌组织中检测出16型人乳头瘤病毒，而且将HPV16DNA转染上皮细胞后，细胞可发生永生化，因而认为它们可能在这些肿瘤的发生学中具有意义[1]。进一步研究还发现，HPV16E6/E7也能使包括角质形成细胞在内的一些类型的细胞发生永生化，因而认为E6/E7序列是诱导细胞永生化的主要功能区[2]。E6/E7可能通过失活抑癌基因，导致细胞周期紊乱，干扰细胞分化过程等诱导细胞永生化，还可协同作用使永生化细胞发生转化，并维持转化细胞的恶性表型[3]。
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有关DNA病毒诱导HSP70高表达及癌细胞中HSP70高表达的研究已有报道[4，5]。为了解HPV16E6/E7、HSP70与肿瘤发生之间的关系，本实验将HPV16E6/E7癌基因转染角质形成细胞，并观察细胞中HSP70的表达情况。结果发现，HPV16E6/E7转染的角质形成细胞中HSP70的表达水平明显高于未转染角质形成细胞，免疫荧光双标记染色还发现E6/E7与HSP70有共定位，提示转染细胞中HSP70的高表达可能是由HPV16E6/E7所诱导。HSP70的功能已逐渐被认识，它作为一种分子伴侣，通过对蛋白质合成、折叠、装配及信号转导等过程的调节而发挥保护细胞的作用。研究已发现，高表达HSP70的细胞对有害因素如高热、紫外线、缺氧等的耐受能力明显增强，HSP70还能影响肿瘤细胞的生长和分化，并诱导癌细胞抵抗抗癌细胞因子的杀伤[6]。这种由HPVE6/E7诱导的HSP70高表达可能通过细胞保护机制影响细胞的生长、分化特性，从而导致细胞周期及增殖活性的改变，可能是HPV16E6/E7诱导角质形成细胞永生化、甚至转化过程中的一个重要辅助机制。
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国家自然科学基金资助项目(39570656)
参考文献
1 Androphy EJ. Molecular biology of human papillomavirus infection and oncogenesis. J Invest Dermatol, 1994,103:248- 256.
2 Halbert C, Demers GW, Galloway DA. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J Virol, 1991,65:473- 478.
3廖文俊综述.HPVE6、E7基因在角朊细胞转化过程中的作用.国外医学皮肤性病学分册，1997，23：275-278.
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4 Khandjian EW, Turler H. Simian virus 40 and polymavirus induce synthesis of heat shock proteins in permissive cells. Mol Cell Biol, 1983,3:1- 8.
5 Jindal S, Young RA. Vaccinia virus infection induces a stress response that leads to association of HSP70 with viral proteins. J Virol, 1992,66:5357- 5362.
6王顺友，朱忠勇.热休克蛋白的产生及功能.生理科学进展，1991，22：370-372.
收稿：1998-08-11修回：1998-12-18, http://www.100md.com
单位：710032西安，第四军医大学西京医院皮肤科(廖文俊 刘玉峰)；第四军医大学基础部病理学教研室(叶苓 刘彦仿)，电镜室(王春梅)
关键词：乳头瘤病毒；人热休克蛋白类角蛋白细胞转染
中华皮肤科杂志990407
【摘要】目的 了解16型人乳头瘤病毒(HPV16)E6/E7、HSP70与角质形成细胞永生化及转化之间的关系。方法 Lipofectamine介导法进行转染，以G418筛选阳性克隆，免疫印迹分析及免疫荧光双标记染色结合激光扫描共聚焦显微镜对HSP70和HPV16E6/E7在转染角质形成细胞中的表达进行了观察。结果 免疫印迹分析显示正常角质形成细胞和转染角质形成细胞均在相对分子质量70000处出现一条染色带，但转染细胞的着色深度明显强于正常细胞；激光扫描共聚焦显微镜观察也发现转染细胞中HSP70的表达明显增高，HSP70与HPV16E6/E7有共定位。结论 HPV16E6/E7可以诱导角质形成细胞中HSP70的高表达，这种高表达可能在角质形成细胞永生化甚至转化过程中具有重要作用。
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Expression of 70-kD Heat Shock Protein in Keratinocytes Induced by Human Papillomavirus 16 E6/E7
LIAO Wenjun, YE Ling, LIU Yanfang, et al
. Department of Dermatology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710032
【Abstract】 Objective To investigate the relation between human papillomavirus 16 E6/E7 (HPV16 E6/E7),70000 heat shock protein (HSP70) and immortalization and transformation of keratinocytes. Methods Keratinocytes were transfected with lipofectamine and positive clones were selected by G418. The expressions of HSP70 and HPV16 E6/E7 by transfected keratinocytes were analysed by means of Western blot,double labelling immunofluorescent staining and laser-scanning confocal microscopy techniques. Results Results of Western blot analysis showed a specific band exhibiting a molecular weight of 70 000 in both normal keratinocytes and HPV16 E6/E7 transfected keratinocytes, but the staining was more intensive in transfected keratinocytes than in normal ones. The co-location of HPV16 E6/E7 and HSP70 in transfected keratinocytes were observed by laser-scanning confocal microscopy. Conclusion The high expression of HSP70 in transfected keratinocytes may be induced by HPV16 E6/E7 which suggests that HSP70 might play an important role in immortalization and even transformation of keratinocytes.
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【Key words】 Papillomavirus, human Heat-shock proteins Keratinocytes Transfection
人乳头瘤病毒(HPV)是一种嗜上皮性小DNA病毒，基因组中共有8个开放读框(ORF)，其中E6、E7ORF为调节病毒生长的编码区。已有报道将HPV16E6/E7转染角质形成细胞后可诱导角质形成细胞永生化。为了解HPVE6/E7、HSP70与角质形成细胞永生化及转化之间的关系，本实验将HPV16E6/E7癌基因转染角质形成细胞，并对转染角质形成细胞中HSP70的表达情况进行了观察。
材料和方法
(一)材料：质粒pLXSN16E6/E7由美国癌症研究中心Hutchinson教授惠赠，该质粒含16型人乳头瘤病毒E6/E7开放读框，约800bp；鼠抗人HSP70单克隆抗体(美国SantaCruz公司)，兔抗人HSP70多克隆抗体(美国Dako公司)，鼠抗HPV16E6、E7单克隆抗体，生物素化羊抗鼠IgG，FITC标记羊抗兔IgG，SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，Avidin标记TexasRed(Sigma公司)，角质形成细胞无血清培养基(KC-SFM)、Lipofectamine转染试剂盒、G418(GibcoBRL)。
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(二)方法：
1.pLXSN16E6/E7质粒的鉴定：碱裂法提取pLXSN16E6/E7质粒，以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，1%琼脂糖电泳进行鉴定。
2.基因转染：取正常成人包皮(本院门诊手术室提供)，胰酶消化法分离、培养原代皮肤角质形成细胞，用Lipofectamine介导法进行基因转染(质粒2μg,Lipofectamine10μL，转染6h)。72h后用G418(400μg/mL)对细胞进行筛选。2周后出现细胞集落(此时未转染组细胞已全部死亡)，将G418改为200μg/mL维持剂量。收集G418抗性细胞用于做下述检测。
3.免疫印迹分析：提取转染角质形成细胞及未转染角质形成细胞中的细胞内总蛋白，用紫外分光光度仪测定含量，取等量待测样品做SDSPAGE电泳，电转移至硝酸纤维素膜，分别加鼠抗人HSP70单抗、生物素化羊抗鼠IgG及SABC复合物，4-氯-1-萘酚显色。
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4.免疫荧光双标记染色及激光扫描共聚焦显微镜观察：将兔抗人HSP70多抗和鼠抗HPV16E6/E7单抗混合加至细胞铺片上，37℃孵育1h，加生物素化羊抗鼠IgG和FITC标记的羊抗兔IgG混合液，37℃孵育1h；加Avidin标记的TexasRed，孵育1h，无荧光缓冲甘油封片后在激光扫描共聚焦显微镜下观察。FITC和TexasRed的激发波长分别是488nm和568nm。
结果
1.pLXSN16E6/E7质粒的酶切鉴定：质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，1%琼脂糖电泳可见1条800bp的目的片段和载体片段(图1)，证明所获质粒确为pLXSN16E6/E7。
图1 pLXSN16E6/E7酶切鉴定P：pLXSN16E6/E7:EcoRⅠ+BamHⅠ，M：λDNA/HindⅢMarker
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2.免疫印迹分析：正常角质形成细胞及转染角质形成细胞均在相对分子质量70000处出现1条染色带，但转染组的染色深度明显强于未转染组(图2)，提示转染组细胞中HSP70的表达较未转染组明显增强。
图2 免疫印迹分析A：E6/E7转染角质形成细胞，B：正常角质形成细胞，M：Marker
3.免疫荧光双标记染色及激光扫描共聚焦显微镜观察：正常角质形成细胞内仅表达HSP70(FITC绿色荧光)，且荧光强度较弱；而pLXSN16E6/E7转染角质形成细胞中则可见到较强的FITC绿色荧光(高表达HSP70)和TexasRed红色荧光(表达HPV16E6/E7)，双标记结果可见由HSP70的绿色荧光与HPV16E6/E7的红色荧光重叠形成的黄色荧光(图3～5)。提示正常角质形成细胞可构成性表达HSP70，而转入的HPV16E6/E7在角质形成细胞中表达后，则可诱导HSP70的高表达。
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图3 E6/E7转染角质形成细胞表达HSP70(FITC绿色荧光)
图4 E6/E7转染角质形成细胞表达E6/E7(TexasRed红色荧光)
图5 转染角质形成细胞中E6/E7与HSP70共定位(黄色荧光)
讨论
由于在皮肤、口腔及宫颈鳞癌组织中检测出16型人乳头瘤病毒，而且将HPV16DNA转染上皮细胞后，细胞可发生永生化，因而认为它们可能在这些肿瘤的发生学中具有意义[1]。进一步研究还发现，HPV16E6/E7也能使包括角质形成细胞在内的一些类型的细胞发生永生化，因而认为E6/E7序列是诱导细胞永生化的主要功能区[2]。E6/E7可能通过失活抑癌基因，导致细胞周期紊乱，干扰细胞分化过程等诱导细胞永生化，还可协同作用使永生化细胞发生转化，并维持转化细胞的恶性表型[3]。
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有关DNA病毒诱导HSP70高表达及癌细胞中HSP70高表达的研究已有报道[4，5]。为了解HPV16E6/E7、HSP70与肿瘤发生之间的关系，本实验将HPV16E6/E7癌基因转染角质形成细胞，并观察细胞中HSP70的表达情况。结果发现，HPV16E6/E7转染的角质形成细胞中HSP70的表达水平明显高于未转染角质形成细胞，免疫荧光双标记染色还发现E6/E7与HSP70有共定位，提示转染细胞中HSP70的高表达可能是由HPV16E6/E7所诱导。HSP70的功能已逐渐被认识，它作为一种分子伴侣，通过对蛋白质合成、折叠、装配及信号转导等过程的调节而发挥保护细胞的作用。研究已发现，高表达HSP70的细胞对有害因素如高热、紫外线、缺氧等的耐受能力明显增强，HSP70还能影响肿瘤细胞的生长和分化，并诱导癌细胞抵抗抗癌细胞因子的杀伤[6]。这种由HPVE6/E7诱导的HSP70高表达可能通过细胞保护机制影响细胞的生长、分化特性，从而导致细胞周期及增殖活性的改变，可能是HPV16E6/E7诱导角质形成细胞永生化、甚至转化过程中的一个重要辅助机制。
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国家自然科学基金资助项目(39570656)
参考文献
1 Androphy EJ. Molecular biology of human papillomavirus infection and oncogenesis. J Invest Dermatol, 1994,103:248- 256.
2 Halbert C, Demers GW, Galloway DA. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J Virol, 1991,65:473- 478.
3廖文俊综述.HPVE6、E7基因在角朊细胞转化过程中的作用.国外医学皮肤性病学分册，1997，23：275-278.
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4 Khandjian EW, Turler H. Simian virus 40 and polymavirus induce synthesis of heat shock proteins in permissive cells. Mol Cell Biol, 1983,3:1- 8.
5 Jindal S, Young RA. Vaccinia virus infection induces a stress response that leads to association of HSP70 with viral proteins. J Virol, 1992,66:5357- 5362.
6王顺友，朱忠勇.热休克蛋白的产生及功能.生理科学进展，1991，22：370-372.
收稿：1998-08-11修回：1998-12-18, http://www.100md.com